酵母双杂交的优势及关键点
蛋白互作
蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。
我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧常用的体外互作研究方法：1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h)酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
“假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
《酵母双杂交系统》课件
01
明确研究目标，确定需要验证的蛋白间相互作用或筛选与特定
蛋白相互作用的候选蛋白。
挑选合适的酵母菌株
02
根据研究目的选择适合的酵母菌株，如用于筛选候选蛋白的酵
母菌株或用于验证已知相互作用蛋白的酵母菌株。
构建诱饵和猎物蛋白的表达载体
03
将目的蛋白分别克隆到酵母表达载体上，构建诱饵和猎物蛋白
的表达载体。
应用领域
蛋白质互作网络研究
利用酵母双杂交系统可以大规模地筛选蛋白质之间的 相互作用，构建蛋白质互作网络。
疾病机制研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，有助于深入了解 疾病的发生和发展机制。
药物靶点发现
发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路和方向 。
02
酵母双杂交系统的实验流程
准备阶段
确定研究目的
基因表达调控研究
研究转录因子与DNA的结合
利用酵母双杂交系统可以筛选与特定DNA序列结合的转录因子，进而研究其在基因表达调控中的作用 。
发现新的转录因子
通过与已知转录因子的相互作用筛选，可以发现新的转录因子，进一步揭示基因表达调控的机制。
药物发现与设计
寻找药物靶点
利用酵母双杂交系统可以筛选与药物作用靶点相互作用的蛋白质，为药物发现提供潜在 的靶点。
对生命科学领域的影响与贡献
促进基础研究
酵母双杂交系统作为一种强大的研究工具，有助于深入揭示生命 过程的奥秘，推动生命科学领域的基础研究。
疾病机制与治疗研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，为疾病机制的解析和药物研发 提供有力支持。
生物技术产业
酵母双杂交系统的应用有助于推动生物技术产业的发展，如新药发 现、生物制品开发等。
酵母双杂交系统的研究进展与应用
〔综 译〕酵母双杂交系统的研究进展与应用马洪波 杜 坚 珠海出入境检验检疫局(珠海 519020) 酵母双杂交系统作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,在近几年来得到了广泛运用。
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。
大量的研究文献表明,酵母双杂交系统既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用,也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。
因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用。
本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。
1 酵母双杂交系统基本原理 酵母双杂交系统首先是由Fields和S ong等1在研究真核基因转录调控中建立的。
酵母双杂交系统最初是在人们对酵母转录因子G A L4的认识基础上的。
天然G A L4分子由1条多肽链组成,含有881个氨基酸,1个完整的酵母转录因子G A L4可分为结构上可以分开的、功能上相互独立的2个结构域:位于N端1～174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和位于C端768～881位氨基酸区段的转录激活域(Activation domain,DAN-AD)。
DNA-BD能够识别位于G A L4效应基因(G A L4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating Sequence,UAS),并与之结合。
而AD则是通过同转录机(transcription machinery)中的其它成分之间的结合作用,以启动UAS下游的基因进行转录2。
DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在上游较为接近时,则呈现完整的G A L4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录(图1)。
酵母双杂交的一些问题
研究蛋白互作的方法蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。
我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧常用的体外互作研究方法：1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h)酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
“假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
酵母双杂交
酵母双杂交的原理Fields 与Song于1989年首先创立。
典型的真核生长转录因子（如GAL4），都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
酵母双杂交的应用1研究已知蛋白质与蛋白质间的相互作用2确定蛋白质功能区：对基因进行系列突变，通过检测其蛋白质相互作用的变化，确定功能区3确定未知蛋白质间的相互作用：从cDNA文库中与已知蛋白结合的未知蛋白，将cDNA与AD结合，已知蛋白与BD结合，检测报告基因的转录4确定基因治疗中多肽药物的作用机理：酵母双杂交系统优点（1）快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤（3）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况（4）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
（5）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
6双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，优点：根据兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白。
蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来。
可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。
酵母双杂交技术1
发展背景
酵母双杂交系统是由Fields等在1989年提出的一种在活细 胞中鉴定蛋白质相互作用的遗传系统。
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始
过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录因子都是由 两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析 蛋白质相互作用的技术。 它可用于： 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
酵母双杂交技术的原理
基于对真核生物基因调控转录起始过程的认识。 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需 要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构 成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活 结构域(activation domain, AD), 它们都是能激活基因转录，但不同转录激活因子 的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
酵母双杂交操作主要流程
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 分别将重组载体转化酵母菌细胞 对酵母转化子进行自激活检测 将重组载体共转化酵母菌细胞 检测报告基因表达产物 分析酵母双杂交实验结果
酵母双杂交技术的优点：
1. 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白 质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。
如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活报告 基因(reporter gene)的转录与表达。通过检测报告基因的 表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物”这两个蛋白质之间是 否存在相互作用。
酵母双杂交技术
酵母双杂交常规技术一．双杂交系统原理及应用范围蛋白质之间的互作是很多反应机制分子水平的核心动作，如DNA合成、转录激活、蛋白质翻译、蛋白质定位和信号转导等所有的的反应的完成都涉及到蛋白质复合体的作用。
而随着酵母双杂系统的成熟和完善，其在蛋白质互作研究中的应用越来越广泛。
酵母双杂交系统是基于转录因子的典型结构特征所建立的，它利用了酵母的转录因子GAL4基因产物，该蛋白拥有两个典型的转录因子结构域DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）。
前者结合GAL1启动子区的DNA序列，后者则激活转录（Fields and Song，1989）。
Fields和Song分别构建了含有含有编码GAL4 DNA结合结构域（GAL4BD）和GAL4转录激活结构（GAL4AD）序列的载体。
将我们所要研究的目的基因分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。
当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因（report gene）的表达。
特点与优点酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：（1）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
（2）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
（3）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。
酵母双杂交
酵母双杂交随着分子生物学研究的迅猛发展与人类基因组计划的完成, 基因工程领域的研究已从结构基因组时代走进了功能基因组时代。
功能基因组学的主要任务就是对生物基因组中包含的全部基因及其所翻译的蛋白质的功能加以解读和描述, 尤其是大量未知基因的功能及其相应蛋白质产物的功能。
系统综合分析蛋白- 蛋白相互作用将为了解蛋白质的功能提供重要的信息。
酵母双杂交是目前研究蛋白-蛋白相互作用的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法。
它是利用酵母遗传学方法在真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的分子生物学技术, 可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因。
酵母双杂交技术的可行性和有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的诱饵蛋白的研究中已被广泛的得到证实。
随着人类、水稻和拟南芥等模式生物基因组测序的完成, 酵母双杂交及其衍生的相关技术将在蛋白质组学、细胞周期调控、细胞信号转导和肿瘤基因表达等领域的研究中发挥着越来越重要的作用。
一、酵母双杂交原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。
很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。
这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。
二、酵母双杂交的系统酵母双杂交常用的有两种系统，第一种为LexA系统：DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 第二种为Gal4系统：BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。
酵母双杂交文库筛选与蛋白互作验证服务
酵母双杂交技术是研究蛋白质-蛋白质相互作用的一种蛋白组学方法，是基于对真核生物的转录因子调控转录起始过程的认识而发明的技术。
其基本原理是利用真核生物酵母的转录激活因子Gal4可分为结构上分开并且功能独立的两个结构域：N端1-147aaDNA结合结构域(DNAb in di ngdomai n,BD)和 C 端768-881aa 转录激活结构域(Activati on Doma in ,AD)，Gal4 的N端和C端可以分开构建表达质粒，将N端和诱饵蛋白(研究的目标蛋白A)融合表达，C端和细胞cDNA或者猎物蛋白X融合表达，如果cDNA编码的蛋白x能和A互相作用，就能把Gal4的C端和N端联系在一起，形成转录因子，激活UAS下游的基因表达，原理如图1所示。
图 1 酵母双杂交技术原理图(引自MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3&Libraries User Manual).公司选用的是美国Clontech公司(现为Takara公司收购)的MatchMaker系列酵母双杂交系统，所用的AH109, Y187酵母菌株，是通过基因工程的方法突变了内源Gal4转录因子的工程菌株，并在GAL4 UASs和启动子的下游构建了3个报道基因--ADE2, HIS3, MEL1(或LacZ，因此可以通过营养缺陷和显色报告基因的表达来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。
菌株信息如图2所示。
AH1W CrhUsIfKHGALI UASCALI TATA tfIS3GAL2UASGAU IATAADtZMELI UAS加 ELI TATAMELI UA3MELI TATAMH IY1t?Cuh$lriicn触 11 UASGALITATA血JI I I MATCHMAKER GAU Two-Hybrid System 3&Libnries Uitf MaiiuaKctontech)所用表达载体信息如下引自 MATCHMAKER GAL4 Two-Hyt^nd Sv^tem 濟Ubr@riE$ U 典r Mawa 唯少址“吋酵母双杂交技术优点：①高效：转化方法简单，转化效率高，便于操作。
酵母双杂交技术
在生命活动中， DNA的复制、转录、RNA的剪接、蛋白质的翻译和分泌以及细胞周期的调节、信号传导和诸多代谢过程都是各种相关蛋白质有机相互作用的结果。
细胞或组织中的蛋白质不是杂乱无章的混合物，蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。
随着分子生物学实验技术的飞速发展，近10年来，发展了一些研究蛋白--蛋白相互作用的方法，其中以Fields和Song创立的酵母双杂交技术为最佳。
该方法利用酵母生长速度快，且容易操作的特点，在其体系中研究哺乳动物细胞的蛋白--蛋白间的相互作用，通过筛选cDNA文库，找到与感兴趣蛋白相互作用的蛋白。
1．原理酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。
研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。
但是，单独的DNA 结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
2．试验流程酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。
2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。
2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。
知无不“研”一文读懂酵母单双杂交点对点验证
知⽆不“研”⼀⽂读懂酵母单双杂交点对点验证⼀、前⾔酵母双杂交由Fields和Song在1989年提出. 他的产⽣是基于对真核细胞转录因⼦特别是酵母转录因⼦GAL4性质的研究。
酵母双杂交就是基因转录所需的转录因⼦的两个结构域在两个互作蛋⽩的吸引下位置靠近，诱导了基因的表达。
酵母双杂交系统的最主要的应⽤是快速、直接分析已知蛋⽩之间的相互作⽤，及分离新的与已知蛋⽩作⽤的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋⽩之间的相互作⽤具有以下优点：•⑴作⽤信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因⼦的作⽤⽽给出的，省去了纯化蛋⽩质的繁琐步骤。
•⑵检测在活细胞内进⾏，可以在⼀定程度上代表细胞内的真实情况。
•⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因⽽可检测存在于蛋⽩质之间的微弱的或暂时的相互作⽤。
•⑷酵母双杂交系统可采⽤不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA⽂库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋⽩等多种不同亚细胞部位及功能的蛋⽩。
⼆、酵母单/双杂交简介1、酵母单杂交酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展⽽来的⼀种研究核酸-蛋⽩相互作⽤的⼯具，被⼴泛⽤于研究真核细胞内基因的表达调控，如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋⽩基因、分析DNA结合结构域信息等。
2、酵母双杂交酵母双杂交及系统是⼀种鉴定和检测蛋⽩质相互作⽤的研究⽅法，因其具有灵敏性⾼、功能强⼤、适⽤范围⼴等特点，现已被应⽤于多个研究领域。
①核蛋⽩酵母双杂交：核蛋⽩酵母双杂交技术最初由Fields等⼈在研究酵母转录因⼦GAL4性质时建⽴，后续经过不断改进已发展成为⼀种成熟的蛋⽩-蛋⽩互作研究⼯具，具有简便、灵敏、可反映蛋⽩在活细胞内互作真实情况的特点，被⼴泛应⽤于互作蛋⽩的筛选、蛋⽩相互作⽤的鉴定/验证、蛋⽩互作机理的探究、蛋⽩连锁图谱绘制等⼯作。
②膜蛋⽩酵母双杂交：DUALmembrane技术在传统的酵母双杂交系统的基础上，巧妙地利⽤分离的泛素系统（split-ubiquitin）进⾏蛋⽩质相互作⽤的筛选；泛素作为降解信号分⼦，⼈为分成两部分：N端（Nub），C端（Cub），互补重构的完整泛素分⼦可被泛素专⼀性蛋⽩酶（UBPs）识别，从⽽导致与泛素相连的蛋⽩被酶解。
酵母双杂交 原理
酵母双杂交原理
酵母双杂交原理是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
该技术利用酵母细胞中的两个互补的基因片段，将它们分别与两个感兴趣的蛋白质的编码基因融合，形成一个融合蛋白。
当这两个融合蛋白在酵母细胞中相互作用时，就会激活一个报告基因，从而实现对蛋白质相互作用的检测。
酵母双杂交技术的基本原理是利用酵母细胞中的两个互补的基因片段，将它们分别与两个感兴趣的蛋白质的编码基因融合，形成一个融合蛋白。
其中一个融合蛋白包含了DNA结合域，另一个融合蛋白包含了激活域。
当这两个融合蛋白在酵母细胞中相互作用时，就会激活一个报告基因，从而实现对蛋白质相互作用的检测。
酵母双杂交技术的优点是可以在活细胞中直接检测蛋白质相互作用，而不需要纯化蛋白质。
此外，该技术可以用于高通量筛选，可以同时检测多个蛋白质相互作用，从而加快了研究进程。
酵母双杂交技术的应用非常广泛，可以用于研究蛋白质相互作用、信号转导通路、基因调控等方面。
例如，利用酵母双杂交技术可以筛选出与某个蛋白质相互作用的蛋白质，从而揭示其功能和调控机制。
此外，该技术还可以用于筛选药物靶点，从而为药物研发提供新的思路和方法。
酵母双杂交技术是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究蛋白
质相互作用和信号转导通路等方面。
该技术具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点，是现代生命科学研究中不可或缺的工具之一。
酵母双杂交技术
酵母双杂交技术引言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该技术能够检测和分析细胞内发生的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、代谢途径和疾病发生机制。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。
原理酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。
当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。
具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤：1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。
2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。
3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。
4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。
一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。
应用1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白质之间的相互关系和调控机制。
2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。
3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研发过程。
优缺点酵母双杂交技术具有以下优点：•高通量：酵母双杂交技术可以同时检测大量蛋白质之间的相互作用，有助于加速研究的进程。
•对新蛋白质相互作用的发现：酵母双杂交技术可以帮助发现未知的蛋白质相互作用，有助于揭示新的细胞信号传导途径和代谢途径。
•相对简洁易行：酵母双杂交技术不需要复杂的实验设备，相对容易实施。
酵母双杂交 Yeast Two hybrids
反向酵母双杂交的例子：
1）酵母URA3基因表达产物是尿嘧啶合成所必需的 ， 同时它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)转化为有毒 物质。Vidal等构建了一酵母细胞株， 其URA3的表 达由含GAL4结合位点的启动子严密控制。 2）在缺乏尿嘧啶的培养基中，细胞培育需要GAL4 激活结构域(GAD)和GAL4 DNA结合结构域(GBD) 的融合蛋白的相互作用的表达。而在含5-FOA的完 全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的 抑制。因此可通过筛选5-FOA抗性克隆从随机突变 库中鉴定阻断蛋白相互作用的突变体。
免疫共沉淀的一般流程： 在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵 育后再加入与抗体Fc段特异结合的结合于 Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与 兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样 一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴 趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免 疫印迹或质谱检测目的蛋白。
You can use the system to: Test for interactions between two proteins for which you have the genes. Screen a protein from a expression library which interacts with a protein you have.
GST Pull down 原理示意图
GST Pull down 中的实验对照
GST-Pull down的应用：
1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或 靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的 相互作用
2） Co-Immunoprecipitation
酵母双杂交
阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。
4、建立基因组蛋白连锁图
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼 此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在 着功能上的联系，通过基因组的测序和序列分析发现了很
1、发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
酵母双杂交技术已成为发现新基因的主要途
径。用已知基因作诱饵，利分离得到AD-Library载体，对其进行
测序并在GenBank中进行比较，可以得到与已知
基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研 究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之 间功能相关的主要方法。
酵母转录因子（Gal 4）
与BD-fusion ---诱饵蛋白（bait protein ） 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein）
报告基因（reporter gene）
---Lac Z（编码β -半乳糖苷酶）
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
多新的基因和EST序列。
HUA等人利用酵母双杂交技术，将母双杂交技术，绘制出了人与致病性细菌
蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。
蛋白间相互作用的基因组蛋白网络连锁图，为深入研究人
与致病菌间的相互作用关系奠定了基础。
五、酵母双杂交的应用
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的， 研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、 瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检 测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间 关系的技术。
酵母双杂交系统(参考资料)
GENBANK序号 序号
NM_003282
P1 P5 P6 P1
16
800.000 700.000 β-G al Ac tivi ty ( Unit) 600.000 500.000 400.000 300.000 200.000 100.000 0.000 E1 E4 E8 E9 E11 E15 E17 E21 E22
10
11
以粒pGBT9-ERRα1/LBD的准备
DBD
LBD
PCR
ERRα1/LBD
13
14
2. 结果 2.1 酵母双杂交试验结果
A
A：在SD/-Leu/-Trp平板上接种的24个His+阳性克隆
B
15
B：菌落滤膜影印后X-gal/Z 缓冲液显色法共有17个克隆在8h之内变蓝
克隆序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
克隆编号 E1-3* E2-2 E2-5 * E4-1 * E8-1 * E9-3 * E10-2* E11-3 * E11-4 E12 -1 * E13-1 * E13-2 E14-1 * E15-3* E17-2* E17-3 E18-1* E18-2 E18-3 E20-5 * E21-3 E21-10 * E22-5 * E23-2 *
2
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
transcription activator
酵母双杂交技术应用进展
酵母双杂交技术应用进展酵母双杂交技术是一种强大的生物技术方法，用于研究蛋白质之间的相互作用。
这项技术自20世纪80年代问世以来，已经广泛应用于基因功能研究、药物研发和生物技术应用等领域。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用进展及未来展望。
酵母双杂交技术是基于真核生物体内两个互补的转录因子，即GAL4和DBD-VP16，以及一个含有报告基因的载体穿梭质粒构建而成的。
在该技术中，一个转录因子（DBD-VP16）与一个诱饵蛋白结合，另一个转录因子（GAL4）与目标蛋白结合。
当诱饵蛋白与目标蛋白相互作用时，两个转录因子将形成一个复合物，该复合物将激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达情况，可以确定蛋白质之间的相互作用。
基因功能研究酵母双杂交技术已成为研究基因功能的重要工具。
通过使用该技术，科学家们可以筛选出与特定基因相互作用的其他基因，从而揭示基因在细胞中的功能。
例如，一项研究发现人类肺癌细胞中抑癌基因TP53的相互作用蛋白，从而为肺癌治疗提供新的思路1。
在药物研发方面，酵母双杂交技术也发挥了重要作用。
通过该技术，科学家们可以筛选出能够与特定药物靶点相互作用的小分子化合物，从而发现新的药物候选。
例如，利用酵母双杂交技术成功发现了一种能够抑制乳腺癌细胞增殖的新药候选2。
酵母双杂交技术在生物技术应用方面也具有广泛的应用价值。
例如，利用该技术成功克隆了一个编码具有工业应用价值的酶的基因，并实现了该基因的高效表达3。
酵母双杂交技术还被用于构建具有重要应用价值的基因调控网络。
随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学等研究的深入发展，酵母双杂交技术的应用前景将更加广阔。
在基因组学领域，利用酵母双杂交技术可以揭示基因之间的相互作用和调控关系，有助于深入理解生命活动的复杂性。
在蛋白质组学领域，酵母双杂交技术可以应用于蛋白质相互作用的研究，为揭示生物学过程和疾病机制提供有力支持。
在代谢组学领域，酵母双杂交技术可以帮助研究代谢物之间的相互作用和调控机制，为代谢调控和代谢性疾病研究提供新的视角。
酵母双杂交的优缺点（供应即用YPDA培养基酵母菌种保存液酵母转化PEGLiAC混合液）
酵母双杂交的优缺点（供应即用YPDA培养基酵母菌种保存液酵母转化PEGLiAC混合液）酵母双杂交的优点：（1）省去了纯化蛋白质的繁琐步骤（2）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况（3）可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
下表是酵母双杂交与免疫共沉淀的比较酵母双杂交的局限性：1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后修饰，如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"，就是自激活，所以实验前都应先对目的基因进行自激活检测。
供应产品目录：1×TE/LiAC 混合液（即用型）100ml1M 醋酸锂溶液/乙酸锂溶液50ml1M山梨醇溶液/酵母电转感受态细胞制备液100ml50% PEG3350溶液50mlCarrier DNA/鲑鱼精DNA （10mg/ml，用于酵母转化）1mlCarrier DNA/鲑鱼精DNA （10mg/ml，用于酵母转化）1ml×10Super酵母转化试剂盒（酿酒酵母专用）200TSuper酵母转化试剂盒II（酿酒酵母专用）200TYPD Plus Liquid Medium50mlYPD Plus Liquid Medium50ml×5YPD Plus Liquid Medium100mlYPD Plus Liquid Medium100ml×5毕赤酵母感受态制备与转化试剂盒20T毕赤酵母感受态制备与转化试剂盒100T即用YPDA培养基5×100ml酵母菌种保存液20×1mL酵母菌种保存液50mL酵母平板菌落快速转化试剂盒（一步法）20T 酵母平板菌落快速转化试剂盒（一步法）50T 酵母转化PEG/LiAC混合液5ml酵母转化试剂盒（酿酒酵母专用）200T yyp2021.2.3。
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酵母双杂交的优势及关键点
分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，为适应对众多基因或蛋白进行功能研究的发展趋势，已出现了很多新技术，酵母双杂交就是其中的一种。
酵母双杂交可以简要概括为：基因转录所需的转录因子的两个结构域在两个互作蛋白的吸引下位置靠近，诱导了基因的表达。
蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用，具有其独特优势。
1、融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质保持天然的折叠状态，蛋白质间相互作用将更接近于体内的真实水平。
2、双杂交系统的敏感度非常高，蛋白质之间结合常数低至1mmol/L时都可以被侦测。
3、在筛选文库时，双杂交系统能够得到编码互作蛋白的基因序列，省略了其它体外检测蛋白互作方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。
经典的酵母双杂交技术的建立的主要关键点在于酵母双杂系统的转录因子和报道株。
一、转录因子
典型的转录因子含有DNA结合区 (DNA-binding domain)、转录调控区 (activation domain)、寡聚化位点(oligomerization site) 以及核定位信号 (nuclear localization signal) 等功能区域。
DNA结合区带共性的结构主要有：1）HTH 和 HLH 结构：由两段α-螺旋夹一段β-折叠构成，α-螺旋与β-折叠之间通过β-转角或成环连接，即螺旋-转角-螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构。
2）锌指结构：多见于 TFIII A 和类固醇激素受体中，由一段富含半胱氨酸的多肽链构成。
每四个半光氨酸残基或组氨酸残基螯合一分子 Zn2+，其余约 12-13个残基则呈指样突出，刚好能嵌入 DNA 双螺旋的大沟中而与之相结合。
3）亮氨酸拉链结构：多见于真核生物 DNA 结合蛋白的 C 端，与癌基因表达调控有关。
由两段α
- 螺旋平行排列构成，其α - 螺旋中存在每隔 7 个残基规律性排列的亮氨酸残基，亮氨酸侧链交替排列而呈拉链状，两条肽链呈钳状与 DNA 相结合。
1、酵母双杂系统的转录因子
酵母双杂交技术的建立要归功于Fields对酵母转录因子GAL4的研究，GAL4包括两个彼此分离的结构域.。
位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain,AD)。
DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合。
而AD则是通过与转录机构
（transcriptionmachinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。
DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
2、筛选方法
酵母双杂采用营养缺陷型的筛选方法。
双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
转录激活因子在结构上是组件式的（modular）, 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNA binding domain，简称为BD）和转录激活结构域（activation domain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
两个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
酵母双杂交系统利用杂交基因激活报道基因的表达，探测蛋白－蛋白的相互作用。
单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。
而不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。
二、报道株
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因（reporter gene）的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：1）易于转化、便于回收扩增质粒。
2）具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
3）酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达（如lacZ），从而可分析蛋白间的结合作用。
说了这么多，其实酵母双杂交并不止这一种模式，经过科学家的不断努力和创新，现在常用的酵母双杂交系统还有基于分离的泛素的膜蛋白酵母双杂交及基于Ras信号通路的酵母双杂系统。
基于分离的泛素的膜蛋白酵母双杂交系统
这个系统的基本思路和上文介绍的经典系统基本一致，只是将互作的场所搬到了细胞膜上，由于涉及到膜蛋白的方向性，在载体选择和实验设计上较经典模式更复杂。
基于Ras信号通路的酵母双杂系统
这个系统使用的是酵母细胞的温度敏感型菌株，利用的是蛋白的互作激活Ras信号通路才能使酵母细胞在低温下存活的思路。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。
③杂交蛋白稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时，酵母表型、X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交技术以其简便，灵敏，高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点，在蛋白互作的研究中将得到更为广泛的应用。
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