酵母双杂交

酵母双杂交的原理

Fields 与Song于1989年首先创立。典型的真核生长转录因子（如GAL4），都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。

酵母双杂交的应用

1研究已知蛋白质与蛋白质间的相互作用2确定蛋白质功能区：对基因进行系列突变，通过检测其蛋白质相互作用的变化，确定功能区3确定未知蛋白质间的相互作用：从cDNA文库中与已知蛋白结合的未知蛋白，将cDNA与AD结合，已知蛋白与BD结合，检测报告基因的转录4确定基因治疗中多肽药物的作用机理：

酵母双杂交系统优点

（1）快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤（3）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况（4）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。（5）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。6双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，优点：

根据兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白。蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来。可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。

酵母双杂交系统局限性

1许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。2有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。3酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。4某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。5某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。局限性：

▪表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符，造成结果的不准确

▪本身就具有转录激活活性的兴趣蛋白不适合于该系统

▪不能定位于核内的兴趣蛋白不适合于该系统

▪需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统

LexA酵母双杂交实验的基本流程

1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选

2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞

3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)

4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura 筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性4-1. 如果pLexA-X 能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少半乳糖苷酶的信号作用4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母

5. 如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。

5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但半乳糖苷酶无表达。5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋

白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。5-4. 将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。6. 阳性克隆的筛选6-1. 随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coli KC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒6-2. 如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆7-1. 将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10％-20％左右的频率随机丢失7-2. 将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，30︒C孵育2-3天7-3. 再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子7-4. 将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆。在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。9. 阳性克隆的进一步筛选和确证9-1. 扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。9-2. 将上述DNA电转化E.coli KC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA，酶切鉴定9-3. 用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达9-4. 扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究10. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究10-1. 用不同的双杂交系统验证10-1-1. 将载体pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。10-1-2. 选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。10-1-3. 将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。10-1-4. 去除或突变特定结合位点，定量检测β-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化。10-2. 用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。10-3. 用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。10-4. 进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系