酵母双杂交protocol

目录

（一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30

方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表

Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置

Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置

Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果

Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs

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Figure 1．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用 4 Figure 2．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用 4 Figure 3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤5 Figure 4．构建和筛选BD Matchmaker酵母单杂交和双杂交文库6 Figure 5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因12 Figure 6．BD Matchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选16 Figure 7．BD Matchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选17 Figure 8．用BD SMART技术合成高质量的ds cDNA 21 Figure 9．BD CHROMA SPIN纯化柱和收集管26 Figure 10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库27 Figure 11．为双杂交筛选AD融合文库32 Figure 12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略39 Figure 13．通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用42 Figure 14．用对照用人胎盘Poly A+ RNA合成双链cDNA 51 Figure 15．p53HIS对照载体的图谱53 Figure 16．pGAD-Rec2-53 AD对照载体的图谱53 Figure 17．pGADT7-RecT AD对照载体的图谱54 Figure 18．pGBKT7-53 DNA-BD 对照载体图谱54 Figure 19．pGBKT7-Lam DNA-BD 对照载体图谱55

（一）介绍

BD Matchmaker TM Library Construction & Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BD Matchmaker TM Systems和BD SMART TM cDNA Synthesis的技术，只需要用任何组织的1 μg poly A+ RNA 或total RNA就能构建cDNA文库。通过一般细胞内克隆步骤，你能利用BD Matchmaker Systems所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。

单杂交实验的原理——蛋白-DNA相互作用实验

单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA 绑定结构域的确定。通过BD Matchmaker One-Hybrid System你可以很容易的获得这些基因表达的蛋白

在BD Matchmaker One-Hybrid实验中，潜在的DNA绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2（为单杂交设计的低拷贝载体）上GAL4激活结构域（AD）序列一起融合表达的。一个或多个目的DNA序列的串联拷贝被构建在pHIS2（含有HIS3营养缺陷报告基因的报告载体）。DNA绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活HIS3的转录（Figure 1），该过程要在宿主菌株Y187（组氨酸缺陷型）中进行并在缺少组氨酸的培养基生长

双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理

双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确结构域。在一个BD Matchmaker双杂交实验分析中，诱饵基因是与GAL4 DNA（DNA-BD）绑定结构域序列融合表达的，同时其他的基因或其cDNA与GAL4激活域（AD）序列融合表达（Fields & Song, 1989; Chien et al., 1991）。当诱饵与文库融合蛋白在AH109（ADE2, HIS3, lacZ, MEL1）这样的报告菌株中相互作用，DNA-BD和AD相接近结合，并激活报告基因转录（Figure 2)

DNA-BD 和AD的融合序列是将cDNA序列克隆进酵母表达载体pGBKT7 和pGADT7-Rec载体中来实现的。pGBKT7表达了与GAL4 DNA-BD融合的蛋白，而pGADT7-Rec表达与GAL4 AD相融合的蛋白。在酵母中，两种融合基因在组成型启动子P ADH1下高水平表达的。其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge基于GAL4的克隆载体与这个试剂盒也相兼容的。pBridge载体能被用于鉴定三蛋白复合体的酵母三杂交实验。

单杂交和双杂交实验分析的生物学基础

单杂交和双杂交方法是基于许多真核转录因子被发现是复合组成的，它们的转录激活和DNA绑第结构域在结构上和功能上是分开的。这使研究者可以构建各种融合基因，当在酵母中表达时，能同时结合到目标DNA序列并激活下游报告基因的转录（Figure1

和Figure2），BD Matchmaker systems 使用的GAL4的转录激活域与DNA绑定域是被完全阐述的的转录因子（Zhu, L. & Hannon, G. J., 2000.）