采用酵母双杂交法筛选HbMybl相互作用蛋白
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法主要有酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上内容仅供参考，建议查阅相关文献获取更专业的信息。
酵母双杂交文库筛选HBX相互作用蛋白
*[基金项目]国家自然科学基金青年基金项目（81700774）；徐州医科大学优秀人才科研启动基金项目（53591518）。
**[作者简介]颜晓庆，女，汉族，山东枣庄人，生于1988年12月，硕士，助理实验师。
研究方向：免疫与代谢。
通信作者，寇艳波，E-mail ：fight -ingkyb@[文章编号]1006-2440(2018)05-0409-06肝癌（hepatocellular carcinorma ，HCC ）是目前全球范围内发病率和致死率最高的癌症之一。
53%的肝癌与乙肝病毒（heptitis B virus ，HBV ）感染有关[1]。
乙肝病毒X 蛋白（hepatitis B hirus X protein ，HBX ）的表达是HBV 诱发肝癌最关键的因素，与肝癌的发生具有极其密切的关系[2]。
HBX 不仅能够反式激活许多癌基因的表达，还能作为辅激活物参与转录调控，甚至可以引起细胞信号通路的异常抑制或激活[3-4]，最终促进HCC 的发生，但HBX 诱发肝癌的具体分子机制并不完全清楚。
HBX 是一个多功能蛋白，能够通过与功能执行蛋白的直接结合调节其活性，而且可以与一些转录因子相互作用间接调控某些功能执行蛋白的转录[5-6]。
例如，HBX 通过结合聚合酶PARP1，抑制DNA 损伤修复复合物的募集，从而加速DNA 损伤，最终引发肝癌[7]。
HBX 还能与进化保守的信号转导通路中的中间产物相互作用，影响NF κB 信号通路激活而调控肝癌的发生和发展[8]。
除此之外，HBX 还能够间接地影响其他重要信号通路，促进肝癌发生[9-10]。
早期，研究者们已经利用酵母双杂交系统筛选酵母双杂交文库筛选HBX 相互作用蛋白*颜晓庆1**,刘庆亚2,杨红宁1,汤仁仙2,寇艳波2(徐州医科大学1急救与救援医学系急诊医学实验室;2江苏省免疫与代谢重点实验室,江苏221004)[摘要]目的:筛选鉴定新的乙肝病毒X 蛋白（hepatitis B viral X protein ，HBX ）相互作用蛋白。
利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(MgPa)相互作用的宿主蛋白
㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(３１３７０２０７)㊀作者简介:王磊㊀男ꎬ硕士ꎬ副主任技师ꎮ主要从事医学检验工作ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓ＿ｗａｎｇｌｅｉ＠１６３.ｃｏｍ㊀∗通讯作者ꎮ男ꎬ博士ꎬ教授ꎬ硕士生导师ꎮ主要从事病原体的致病性和致病机制研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｅｎｇｙｉｈｕａ２１ｃｎ＠１２６.ｃｏｍ㊀收稿日期:２０１８￣１０￣０４利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)相互作用的宿主蛋白王㊀磊１ꎬ２ꎬ李冉辉１ꎬ邓湘赢１ꎬ戴㊀佩１ꎬ李玲玲１ꎬ罗㊀丹１ꎬ曾焱华１∗(１.南华大学病原生物学研究所特殊病原体防控湖南省重点实验室湖南省分子靶标新药研究协同创新中心ꎬ湖南衡阳㊀４２１００１ꎻ２.邵阳市中心医院ꎬ湖南邵阳㊀４２２０００)摘㊀要㊀从利用基于分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞ｃＤＮＡ文库中筛选生殖支原体(Ｍｇ)黏附蛋白(ＭｇＰａ)的互作蛋白ꎮ以ｐＥＴ３０ａ￣ＭｇＰａ为模板ꎬ经ＰＣＲ扩增ＭｇＰａ基因ꎬ将其分别连接到ｐＢＴ３ＳＴＥ和ｐＢＴ３ＳＵＣ载体以构建诱饵质粒ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ和ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａꎻ将诱饵质粒分别转化到酵母菌株ＮＭＹ３２内ꎬ检测其毒性和自激活活性ꎻ将人尿道上皮细胞ｃＤＮＡ文库质粒ｐＰＲ３￣Ｎ￣２０７￣Ｚｅｎｇ转入到含ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ诱饵质粒的酵母菌株中ꎬ筛选阳性克隆ꎮ检测阳性克隆ＬａｃＺ报告基因的活性ꎮ提取阳性克隆质粒进行ＤＮＡ测序与ＢＬＡＳＴ分析ꎮ结果显示ꎬ成功构建的诱饵质粒ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ和ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ两者都没有自激活功能ꎬ且ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的活性强于ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａꎮ用ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ转化ＮＭＹ３２酵母作为受体酵母细胞ꎮ经ＤＮＡ测序与ＢＬＡＳＴ分析结果表明筛选到的２８个阳性克隆归属于２３个不同的蛋白ꎮ从利用分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞ｃＤＮＡ文库中筛选到２３个与ＭｇＰａ相互作用的蛋白ꎬ为阐明ＭｇＰａ的功能及Ｍｇ可能的致病机制提供参考ꎮ关键词㊀生殖支原体ꎻ黏附蛋白ꎻ酵母双杂交ꎻｃＤＮＡ文库中图分类号㊀Ｑ９３－３ꎻＲ３７５＋３㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀１００５－７０２１(２０１９)０２－００３８－０６ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００５－７０２１.２０１９.０２.００６ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＨｏｓｔＰｒｏｔｅｉｎｓＩｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍＡｄｈｅｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎｏｆＵｓｉｎｇＹｅａｓｔＤｏｕｂｌｅ￣ＨｙｂｒｉｄＳｙｓｔｅｍＷＡＮＧＬｅｉ１ꎬ２ꎬＬＩＲａｎ￣ｈｕｉ１ꎬＤＥＮＧＸｉａｎｇ￣ｙｉｎｇ１ꎬＤＡＩＰｅｉ１ꎬＬＩＬｉｎｇ￣ｌｉｎｇ１ꎬＬＵＯＤａｎ１ꎬＺＥＮＧＹａｎ￣ｈｕａ１(１.Ｉｎｓｔ.ｏｆＰａｔｈｏｇ.ＢｉｏｌｏｇｙꎬＵｎｉ.ｏｆＳ.ＣｈｉｎａꎬＨｕｎａｎＰｒｏｖ.ＫｅｙＬａｂ.ｆｏｒＳｐｅｃｉａｌＰａｔｈｏｇ.Ｐｒｅｖｅｎｔ.＆Ｃｔｒｌ.ꎬＨｕｎａｎＰｒｏｖ.Ｃｏｏｐｅｒａｔ.ＩｎｎｏｖａｔᶄｎＣｔｒ.ｏｆＭｏｌ.ＴａｒｇｅｔＮｅｗＤｒｕｇＳｔｕｄｙꎬＨｅｎｇｙａｎｇ４２１００１ꎻ２.ＳｈａｏｙａｎｇＣｉｔｙＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐ.ꎬＳｈａｏｙａｎｇ４２２０００)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ(ＭｇＰａ)ｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｃｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｉｅｎｙｅａｓｔｄｏｕｂｌｅ￣ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ.ＴｈｅＭｇＰａｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈＰＣＲｕｓｉｎｇｐＥＴ３０ａ￣ＭｇＰａａｓｔｅｍｐｌａｔｅａｎｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｌｉｇａ￣ｔｅｄｗｉｔｈｐＢＴ３ＳＴＥａｎｄｐＢＴ３ＳＵＣｖｅｃｔｏｒｓｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｂａｉｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａａｎｄｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａꎻｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎＮＭＹ３２ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｔｈｅｉｒｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ.ＴｈｅｈｕｍａｎｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｐｌａｓｍｉｄｐＰＲ３￣Ｎ￣２０７￣ＺｅｎｇｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｔｈｅｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａｂａｉｔｐｌａｓｍｉｄａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄ.ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅＬａｃＺｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｆｏｒｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓ.ＴｈｅｐｌａｓｍｉｄｓｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｆｏｒＤＮＡａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｂｙＢＬＡＳＴ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂａｉｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａａｎｄｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄꎬｂｏｔｈｈａｄｎｏｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｉｅｓꎬａｎｄｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａｈａｄｓｔｒｏｎｇｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｔｈａｎｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ.ＴｈｅｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＮＭＹ３２ｙｅａｓｔａｎｄｕｓｅｄａｓｒｅｃｅｐｔｏｒｏｆｙｅａｓｔｃｅｌｌ.Ａｔｏｔａｌｏｆ２８ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄＢＬＡＳＴａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｃｌｏｎｅｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏ２３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ.Ｉｔｗａｓｃｏｎ￣ｃｌｕｄｅｄｔｈａｔ２３ｋｉｎｄｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＭｇＰａｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｉｅｎｙｅａｓｔｄｏｕｂｌｅ￣ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍꎬａｎｄｔｈｕｓｌａｉｄａ８３微生物学杂志㊀２０１９年４月第３９卷第２期㊀ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹＡｐｒ.２０１９Ｖｏｌ.３９Ｎｏ.２ｃｅｒｔａｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｔｏｅｎｕｎｃｉａｔｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＭｇＰａａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＭ.ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍꎻａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎꎻｙｅａｓｔｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍꎻｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ㊀㊀生殖支原体(ＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍꎬＭｇ)是一种基因组最小且能在无生命培养基中生长繁殖ꎬ同时与尿道炎㊁盆腔炎㊁不孕不育和宫颈炎等多种疾病密切相关的原核细胞型微生物[１￣５]ꎮ由于Ｍｇ生长缓慢ꎬ分离培养难度大ꎬ导致其致病机制尚未完全阐明ꎬ因此ꎬ开展Ｍｇ的致病机制研究对预防和控制Ｍｇ感染具有重要意义ꎮＭｇ没有细胞壁ꎬ但具有特殊的㊁呈烧瓶状的尖端结构ꎮＭｇ主要通过其尖端结构黏附或侵入宿主细胞ꎬ从而引起宿主的感染[２]ꎮ研究表明ꎬ位于尖端结构的生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)的羧基端在Ｍｇ的黏附与感染中起关键作用[６￣７]ꎮ然而ꎬ迄今为止尚不清楚ＭｇＰａ通过和宿主细胞膜上哪些蛋白发生相互作用ꎬ从而导致其黏附或侵入细胞引起宿主感染ꎮ本课题组在前期研究中ꎬ以重组ＭｇＰａ为靶分子ꎬ从人尿道上皮细胞Ｔ７噬菌体展示ｃＤＮＡ文库中筛选到ＭｇＰａ互作蛋白 ＲＰＬ３５[８]ꎻ本研究拟构建ＭｇＰａ的酵母诱饵载体ꎬ从人尿道上皮细胞(ＳＶ￣ＨＵＣ￣１)酵母双杂交ｃＤＮＡ文库筛选能与Ｍｇ￣Ｐａ发生相互作用的宿主蛋白ꎬ为进一步研究ＭｇＰａ的功能及其在Ｍｇ致病中的作用机制提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料１.１.１㊀质粒与质粒提取试剂盒㊀重组质粒ｐＥＴ￣３０ａ(＋)￣ＭｇＰａ由课题组前期制备并保存[９]ꎻ人尿道上皮细胞(ＳＶ￣ＨＵＣ￣１)酵母双杂交ｃＤＮＡ文库质粒ｐＰＲ３￣Ｎ￣２０７￣Ｚｅｎｇ委托上海海科生物技术有限公司制备ꎻ膜蛋白酵母双杂交系统(ＤＵＡＬｍｅｍ￣ｂｒａｎｅｓｔａｒｔｅｒｋｉｔ)和诱饵载体ｐＢＴ３ＳＴＥ和ｐＢＴ３ＳＵＣ为瑞士ＤｕａｌｓｙｓｔｅｍｓＢｉｏｔｅｃｈＡＧ公司产品ꎮＤＮＡ回收试剂盒和大肠埃希菌质粒提取试剂盒为Ｏｍｅｇａ公司产品ꎻ酵母质粒提取试剂盒购自索莱宝公司ꎮ１.１.２㊀培养基(％ꎬ质量分数)㊀大肠埃希菌培养基(ＬＢ):酵母提取液０ ５ꎬ蛋白胨１ꎬＮａＣｌ１ꎬｐＨ调至７ ０ꎻ酵母完全培养基(ＹＰＤＡ):酵母提取液１ꎬ胰蛋白胨２ꎬ葡萄糖２ꎬ腺嘌呤０ ０２％ꎻ酵母缺陷筛选培养基参照ＤＵＡＬｓｙｓｔｅｍ公司的ＤＵＡＬｍｅｍ￣ｂｒａｎｅｓｔａｒｔｅｒｋｉｔｓ说明书配制ꎮ１.１.３㊀酶㊀高保真ＤＮＡ聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司ꎻ限制性内切酶ｓｆｉＩ购自Ｆｅｒ￣ｍｅｎｔａｓ公司ꎻＤＮＡ连接酶ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ购自ＴＯＹＯＢＯ公司ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀诱饵载体构建㊀以ｐＥＴ￣３０ａ(＋)￣ＭｇＰａ为模板ꎬ利用合成好的引物(ＭｇＰａ￣Ｆ:５ᶄ￣ＡＡＧＧＣ￣ＣＡＴＴＡＣＧＧＣＣＣＣＴＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴＣＣ￣３ᶄꎬＭｇＰａ￣Ｒ:５ᶄ￣ＣＣＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣ￣ＴＡＴＡＧＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡＧＧ￣３')扩增目的片段并回收ꎮ将回收到的片段和诱饵载体质粒ｐＢＴ３ＳＴＥ和ｐＢＴ３ＳＵＣ使用ＳｆｉＩ进行酶切(３７ħ㊁５ｈ)并回收ꎮ将回收后的目的片段分别与ｐＢＴ３ＳＴＥ和ｐＢＴ３ＳＵＣ载体连接ꎬ将连接产物转化已制备好的大肠埃希菌感受态ꎮ随机挑取４个大肠埃希菌转化子ꎬ接种于含卡那霉素的液体ＬＢ培养基ꎬ３７ħ㊁２５０ｒ/ｍｉｎ振荡培养１６ｈ后进行ＰＣＲ扩增(Ｆ引物:５ᶄ￣ＴＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＣＴＧ￣３ᶄꎬＲ引物:５ᶄ￣ＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＴＣＴ￣３ᶄ)ꎬ以对诱饵质粒进行鉴定ꎬ各选取１个阳性克隆进行质粒抽提ꎬ然后测序并对测序结果进行ＢＬＡＳＴ比对ꎮ１.２.２㊀酵母转化㊀从ＹＰＤＡ平板挑取ＮＭＹ３２单菌落接种于４ｍＬＹＰＤＡ液体培养基中ꎬ３０ħꎬ２２５ｒ/ｍｉｎ振荡培养１８~２０ｈ至ＯＤ６００>１.５ꎻ转接于５０ｍＬＹＰＤＡ液体培养基ꎬ使初始ＯＤ６００约为０.２ꎬ振荡培养４~５ｈꎬ至ＯＤ６００＝０.６ꎻ离心收菌(４０００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)ꎻ依次用２０ｍＬ无菌水㊁５ｍＬ０.１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ㊁５００μＬ０.１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ重悬菌体ꎬ混匀后分装至１.５ｍＬ离心管ꎬ每管５０μＬꎻ再依次加入５０％ＰＥＧ￣３３５０２４０μＬ㊁１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ３６μＬ㊁ｓｓＤＮＡ(２０ｍｇ/ｍＬ)５μＬ㊁质粒ＤＮＡ５μＬꎬ剧烈振荡１ｍｉｎ左右ꎬ至完全混匀ꎮ３０ħ水浴孵育３０ｍｉｎꎬ４２ħ水浴孵育２５ｍｉｎꎬ３０ħ水浴孵育３０ｍｉｎꎬ离心收菌ꎮ用３００μＬ无菌水悬浮菌体ꎬ温和混匀ꎬ涂布在相应的缺陷型筛选平板上ꎬ３０ħ恒温培养４ｄꎮ１.２.３㊀文库筛选与转化㊀从ＳＤ￣Ｌ平板上挑取单克隆菌落接种于ＳＤ￣Ｌ培养基５０ｍＬꎬ振荡培养１８ｈ后转接于５００ｍＬＹＰＤＡ液体培养基中ꎬ使初始ＯＤ６００约为０.２ꎬ振荡培养４~５ｈ至ＯＤ６００＝０.６ꎻ离心收菌(４０００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)后依次用３０ｍＬ无菌水㊁２０ｍＬ０.１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ㊁１０ｍＬ０.１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ重悬菌体ꎬ混匀后离心收菌(４０００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)ꎬ弃上清ꎻ向离心管中依次加入５０％ＰＥＧ￣３３５０９.６ｍＬ㊁１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ１.４４ｍＬ㊁ｓｓＤＮＡ(１０ｍｇ/ｍＬ)９３２期㊀㊀㊀㊀㊀王磊等:利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)相互作用的宿主蛋白㊀㊀４００μＬ㊁文库质粒ＤＮＡ２５μｇꎬ剧烈振荡１ｍｉｎ左右ꎬ至完全混匀ꎻ３０ħ水浴孵育３０ｍｉｎꎻ４２ħ水浴热激２５ｍｉｎꎻ３０ħ水浴复苏１ｈꎻ离心收菌(４０００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)ꎻ用８ｍＬ无菌水重悬菌体ꎬ尽量温和地混匀ꎬ从中取２０μＬ培养物梯度稀释后涂效率平板ＳＤ￣ＴＬ３块ꎮ其余涂ＳＤ￣ＴＬＨ＋５ｍｍｏｌ/Ｌ３ＡＴ平板ꎬ每块２００μＬꎬ共４０块ꎻ３０ħ恒温培养３~４ｄꎬ记录转化效率ꎻ并根据转化子数量计算筛库效率ꎮ培养到第３天时ꎬ用无菌绒布对筛库平板进行影印清除ꎬ以消除受体菌背景生长的干扰ꎮ１.２.４㊀Ｈｉｓ和Ａｄｅ报告基因检测㊀从筛库平板中共挑取３８个初始阳性克隆转化子转接到ＳＤ￣ＴＬ缺陷型平板中继续培养２~３ｄꎬ将长出的３８个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至ＳＤ￣ＴＬ和ＳＤ￣ＴＬＨＡ＋６０ｍｍｏｌ/Ｌ３ＡＴ缺陷平板ꎬ３０ħ恒温培养３~４ｄꎬ以检测Ｈｉｓ和Ａｄｅ报告基因ꎮ１.２.５㊀阳性克隆激活ＬａｃＺ报告基因的检测㊀将３８个初始阳性克隆分别接种于ＳＤ￣ＴＬ培养液振荡培养过夜ꎬ离心收菌后弃上清ꎬ在每个反应中加入１００μＬ裂解液混合物以重悬菌体ꎬ将其转移至ＥＬＩＳＡ板ꎬ３７ħ孵育９０ｍｉｎ后测定每个孔对应的ＯＤ６１５和ＯＤ５４６值ꎬ分别计算相应的β￣ｇａｌａｃｔｏｓｉ￣ｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ＝ＯＤ６１５/ＯＤ５４６ꎮ１.２.６㊀酵母阳性克隆ＤＮＡ提取和测序比对㊀将通过３种报告基因检测的阳性克隆菌株分别抽提酵母质粒ꎬ然后转化大肠埃希菌Ｔｏｐ１０新鲜感受态并扩增ꎮ将含有阳性克隆的Ｔｏｐ１０转化子转接含有氨苄青霉素(５０μｇ/ｍＬ)的ＬＢ液体培养基ꎬ培养并扩增后抽提质粒ꎬ对质粒进行ＤＮＡ测序和ＢＬＡＳＴ比对ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＰＣＲ扩增得到ＭｇＰａ片段以ＭｇＰａ￣Ｆ和ＭｇＰａ￣Ｒ为引物ꎬｐＥＴ￣３０ａ(＋)￣ＭｇＰａ为模板进行ＰＣＲ扩增ꎬ如图１所示ꎬ在约８７０ｂｐ处有一明显条带ꎬ说明成功扩增出长度为８７０ｂｐ的目的片段ꎮ２.２㊀诱饵质粒ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ和ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的鉴定将构建好的ｐＢＴ３ＳＴＥ和ｐＢＴ３ＳＵＣ分别转化大肠埃希菌ꎬ随机挑取大肠埃希菌转化子４个ꎬ用质粒引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ结果表明成功扩增出长度约１２００ｂｐ的条带(图２)ꎬＰＣＲ产物经测序后与预期一致ꎮ２.３㊀ＭｇＰａ重组质粒自激活及其功能检测自激活检测显示ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ和ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ都有功能ꎬ且都不存在自激活现象ꎬ而ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的功能更强一些(图３)ꎬ因此ꎬ选用ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ进行下一步的文库筛选ꎮ图１㊀生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳分析Ｆｉｇ.１㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＭｇＰａ１:ＰＣＲ扩增产物ꎻＭ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒ１:ＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔꎻＭ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒ图２㊀诱饵质粒菌落ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳分析Ｆｉｇ.２㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｌｏｎｉａｌＰＣＲｏｆｂａｔｉｐｌａｓｍｉｄＭ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１~４:ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭＧＰＡ转化子ＰＣＲ产物ꎻ６~８:ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭＧＰＡ转化子ＰＣＲ产物Ｍ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１￣４:ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭＧＰＡＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎꎻ６￣８:ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭＧＰＡＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ图３㊀ＭｇＰａ重组质粒自激活检测Ｆｉｇ.３㊀Ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭｇＰａ１:阳性对照ꎻ２:阴性对照ꎻ３:ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的自激活检测ꎻ４:ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ的自激活检测ꎻ５:ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的功能检测ꎻ６:ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ的功能检测１:Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻ２:Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻ３:Ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐＢＴ３ＳＵ￣ＭｇＰａ:４:Ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａꎻ５:ＦｕｎｃｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａꎻ６:ＦｕｎｃｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ２.４㊀文库筛选用含有ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的ＮＭＹ３２酵母转化子制备感受态ꎬ将文库质粒ｐＰＲ３￣Ｎ￣２０７ＺｅｎｇＤＮＡ０４㊀㊀㊀㊀㊀微㊀生㊀物㊀学㊀杂㊀志㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷转入其中ꎬ接种ＳＤ￣Ｔｒｐ￣Ｌｅｕ￣Ｈｉｓ＋５ｍｍｏｌ/Ｌ３ＡＴ平板ꎮ计算筛库效率ꎬ结果共获得２.８ˑ１０６个转化子ꎬ转化效率为１.１ˑ１０５/μｇ(图４)ꎮ图４㊀ＭｇＰａ文库筛选效率Ｆｉｇ.４㊀ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＭｇＰａｌｉｂｒａｒｙ２.５㊀Ｈｉｓ和Ａｄｅ报告基因检测如图５所示ꎬ从文库筛选得到的３８个阳性克隆中ꎬ编号为１１㊁１３㊁１４㊁１５㊁２３和２６的６个克隆未能通过ＡＤＥ２和ＨＩＳ３报告基因检测ꎬ其余３２个克隆均通过ＡＤＥ２和ＨＩＳ３报告基因检测ꎮ２.６㊀ＬａｃＺ报告基因检测将β￣ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性值与阴性对照进行比较ꎬ如其β￣半乳糖甘酶活性值大于阴性对照值ꎬ则判定为通过了ＬａｃＺ报告基因的检测ꎮ结果表明有６个克隆(编号分别为２㊁５㊁７㊁８㊁１１㊁２３号)未能通过ＬａｃＺ报告基因检测ꎬ其余３２个克隆均通过检测(图６)ꎮ因此ꎬ本研究筛选到的与ＭｇＰａ相互作用的阳性克隆共有２８个ꎮ图５㊀阳性克隆ＡＤＥ２和ＨＩＳ３报告基因的检测Ｆｉｇ.５㊀ＲｅｐｏｒｔｇｅｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｌｏｎｙＡＤＥ２ａｎｄＨＩＳ３１~３８:克隆编号ꎻ＋:阳性对照ꎻ－:阴性对照１￣３８:ｃｌｏｎｅｎｕｍｂｅｒꎻ＋:ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻ－:ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ图６㊀ＭｇＰａ阳性克隆β￣半乳糖苷酶活性检测Ｆｉｇ.６㊀Ａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆβ￣ＧａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｆｏｒＭｇＰａｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｌｏｎｙ１~３８:克隆编号ꎻ３９:阳性对照ꎻ４０:阴性对照１￣３８:ｃｌｏｎｅｎｕｍｂｅｒꎻ３９:ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻ４０:ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２.７㊀酵母阳性克隆ＤＮＡ提取和测序比对将２８个阳性克隆进行ＤＮＡ测序ꎬ并在Ｇｅｎ￣Ｂａｎｋ数据库中进行ＢＬＡＳＴ比对分析ꎮ其中３个克隆在ＮＣＢＩ数据库中未查到同源序列ꎬ２５个克隆分别归属于２３种不同的蛋白编码基因(表１)ꎮ㊀㊀１４２期㊀㊀㊀㊀㊀王磊等:利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)相互作用的宿主蛋白㊀㊀表１㊀可能与生殖支原体黏附蛋白发生相互作用的蛋白Ｔａｂｌｅ１㊀ＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｆＭ.ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ克隆号基因代码基因名称１ＸＭ＿０１６９５９８５７.１ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ:Ｐａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓｔｒｉｂｂｌｅｓｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ１(ＴＲＩＢ１)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔＸ３ꎬｍＲＮＡ３ＡＬ５９０４５５.２０ＨｕｍａｎＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｆｒｏｍｃｌｏｎｅＲＰ１１￣２７８Ｊ１７ｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１ꎬｃｏｍｐｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅ４ＮＭ＿００５６６９.４Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｃｅｓｓｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ５(ＲＥＥＰ５)ꎬｍＲＮＡ６ＢＴ０５８３６１.１ＳａｌｍｏｓａｌａｒｃｌｏｎｅＣｏｎｔｉｇ４４０５６０ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎＬ３７ａｐｕｔａｔｉｖｅｍＲＮＡꎬｃｏｍｐｌｅｔｅｃｄｓ９ＡＦ０５９６１７.１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｓｅｒｕｍ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｋｉｎａｓｅｍＲＮＡꎬｃｏｍｐｌｅｔｅｃｄｓ１２ＮＭ＿００１０１０９２４.１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ１７１ｍｅｍｂｅｒＡ１(ＦＡＭ１７１Ａ１)ꎬｍＲＮＡ１６ＸＭ＿０１７５２６４３９.１ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ:ＣｅｂｕｓｃａｐｕｃｉｎｕｓｉｍｉｔａｔｏｒＨ３ｈｉｓｔｏｎｅꎬｆａｍｉｌｙ３Ａ(Ｈ３Ｆ３Ａ)ꎬｍＲＮＡ１７ＸＭ＿０１７０２１０９２.１ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ:ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＦＫ５０６ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ３(ＦＫＢＰ３)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔＸ１ꎬｍＲＮＡ１８ＮＧ＿０１５８４５.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｒｅｌｅａｓｅｆａｃｔｏｒ(ＰＴＲＦ)ꎬＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１７１９ＮＭ＿００１１０１.３Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓａｃｔｉｎｂｅｔａ(ＡＣＴＢ)ꎬｍＲＮＡ２０ＡＬ１１０２３９.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｍＲＮＡꎻｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５６６Ｅ１４４(ｆｒｏｍｃｌｏｎｅＤＫＦＺｐ５６６Ｅ１４４)２１ＮＭ＿００５９５２.３Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ１Ｘ(ＭＴ１Ｘ)ꎬｍＲＮＡ２２ＮＭ＿００１８６６.２Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｘｉｄａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ７Ｂ(ＣＯＸ７Ｂ)ꎬｍＲＮＡ２４ＡＫ０７４９６０.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｃＤＮＡＦＬＪ９０４７９ｆｉｓꎬｃｌｏｎｅＮＴ２ＲＰ３００２８３６ꎬｈｉｇｈｌｙｓｉｍｉｌａｒｔｏＰｌｅｘｉｎＡ２２７ＸＭ＿００９４４６４０９.２ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ:ＰａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓＧＡＴＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ２(ＧＡＴＡ２)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔＸ３ꎬｍＲＮＡ２８ＮＭ＿０１４７３６.５ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＫＩＡＡ０１０１(ＫＩＡＡ０１０１)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔ１ꎬｍＲＮＡ２９㊁３０㊁３４ＢＣ０３４３４９.１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙꎬｍｅｍｂｅｒ６ｂꎬｄｅｃｏｙꎬｍＲＮＡ(ｃＤＮＡｃｌｏｎｅＭＧＣ:２１０７９ＩＭＡＧＥ:４７５２５０７)３１ＢＣ０００１４１.１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｖ￣ｍｙｃｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓｖｉｒａｌｏｎｃｏｇｅｎｅｈｏｍｏｌｏｇ(ａｖｉａｎ)ꎬｍＲＮＡ(ｃＤＮＡｃｌｏｎｅＭＧＣ:５１８３ＩＭ￣ＡＧＥ:２９８５８４４)ꎬｃｏｍｐｌｅｔｅｃｄｓ３２ＸＭ＿００９４２５３７５.２ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ:ＰａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓＤＡＺａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ２(ＤＡＺＡＰ２)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔＸ３ꎬｍＲＮＡ３３ＮＭ＿００１１６３２８６.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＥＷＳＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１(ＥＷＳＲ１)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔ４ꎬｍＲＮＡ３６ＮＭ＿１９８５４１.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＩＧＦｌｉｋｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒ１(ＩＧＦＬ１)ꎬｍＲＮＡ３７ＫＸ７０２２３３.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｈａｐｌｏｇｒｏｕｐＨ１ａ１ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎꎬｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅ３８ＮＭ＿０１４０４１.３Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｓｕｂｕｎｉｔ１(ＳＰＣＳ１)ꎬｍＲＮＡ３㊀讨㊀论Ｍｇ于１９８１年首次从非淋菌性尿道炎患者中分离出来[２]ꎮ研究表明Ｍｇ与盆腔炎㊁宫颈炎和非淋菌性尿道炎等疾病相关ꎬ同时也是一种艾滋病相关支原体[５ꎬ１０]ꎮＭｇ没有细胞壁ꎬ其细胞膜中含有较多的膜蛋白ꎬ其中含量最高的黏附蛋白(ＭｇＰａ)与Ｍｇ黏附或感染宿主细胞密切相关[５]ꎮＤＵＡＬｍｅｍｂｒａｎｅ系统是一种基于分离泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统ꎬ能够直接在酵母内原位检测蛋白￣蛋白之间的相互作用ꎬ不需要核定位信号ꎬ且泛素蛋白对相互作用蛋白的影响很小[１１]ꎮ因此ꎬ该系统可以用来检测胞质蛋白与膜蛋白或者两个膜蛋白之间的相互作用ꎮ本研究首先构建了能表达ＭｇＰａ的诱饵质粒ꎬ该重组质粒能正确表达并且不能自主激活报告基因ꎬ用于筛选ＭｇＰａ互作蛋白的诱饵ꎮ然后将基于膜蛋白酵母双杂交的人尿道上皮细胞ｃＤＮＡ文库与此诱饵载体共同转化入宿主菌ꎬ再对阳性克隆进行筛选ꎬ结果共筛选到２８个阳性克隆ꎬＤＮＡ测序与ＢＬＡＳＴ比对分析的结果表明其归属于２３种不同的蛋白ꎬ这些蛋白可能为与ＭｇＰａ发生相互作用的蛋白ꎮ筛选到的２３个蛋白中ꎬ包含肿瘤坏死因子受体超家族成员６Ｂ㊁金属硫蛋白和细胞色素氧化酶等ꎮ肿瘤坏死因子受体超家族成员与其膜受体的相互作用与机体免疫系统的功能高度相关ꎬ并可能与某些获得性免疫缺陷病的病因学相关[１２]ꎮ肿瘤坏死因子受体超家族成员６Ｂꎬ即诱捕受体３(ＤｃＲ３)位于细胞膜ꎬ故推测Ｍｇ可能通过识别肿瘤坏死因子受体超家族成员６Ｂꎬ破坏细胞信号的正常传递ꎬ从而加速艾滋病的进展ꎮ此外ꎬＤｃＲ３水平在胃癌㊁肝癌㊁胆囊癌㊁细菌感染㊁肾衰竭等多种疾病中均升高[１３￣１４]ꎮ金属硫蛋白(ＭＴ)是一类分子量低㊁半胱氨酸含量丰富的蛋白质ꎬ与体内多种金属的转运相关ꎮ近年的研究表明ꎬ金属硫蛋白与肿瘤㊁中枢系统疾病㊁遗传性金属代谢病等多２４㊀㊀㊀㊀㊀微㊀生㊀物㊀学㊀杂㊀志㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷种疾病相关ꎬ且ＭＴ的过度表达与肿瘤的类型和分级相关[１５￣１６]ꎮ本研究的结果表明ꎬＭｇ感染宿主后通过ＭｇＰａ与金属硫蛋白发生互作ꎬ可能会导致宿主细胞抗氧化系统的失调ꎮ细胞色素氧化酶(ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｘｉｄａｓｅꎬＣＣＯ)是线粒体电子传递链末端的酶ꎬ在生物体代谢过程中极其重要ꎮ研究证实ＨＩＶ￣Ｔａｔ蛋白能够通过破坏线粒体来抑制细胞色素氧化酶的活性[１７]ꎮ我们发现ＭｇＰａ可能与ＣＣＯ发生相互作用ꎬ表明ＭｇＰａ有可能破坏宿主的能量系统从而导致宿主细胞受损ꎮ本研究筛选到的第６个克隆为６０Ｓ核糖体蛋白ꎬ与我们前期从人尿道上皮细胞Ｔ７噬菌体展示ｃＤＮＡ文库中筛选到的ＭｇＰａ互作蛋白ＲＰＬ３５一致[８]ꎻ另外ꎬ本研究筛选到的金属硫蛋白㊁细胞色素Ｃ氧化酶和Ｈ３组蛋白等与邓湘赢[１８]经改进的病毒铺覆蛋白印记技术和质谱分析等方法从人尿道上皮细胞膜蛋白中鉴定到的能与ＭｇＰａ互作的蛋白一致ꎮ因此ꎬ这进一步说明本研究利用膜蛋白酵母双杂交技术筛选到的这些蛋白可能为ＭｇＰａ的互作蛋白ꎮ由于酵母双杂交试验的结果有可能存在假阳性ꎬ在下一步研究中将使用ＧＳＴ￣ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ和荧光能量共振转移等技术对这些蛋白进行进一步验证ꎬ并研究这些蛋白的定位及其能否抑制Ｍｇ感染人尿道上皮细胞进行进一步研究ꎬ以对其是否为Ｍｇ的受体进行确证ꎮ总之ꎬ本研究利用膜蛋白酵母双杂交系统从人尿道上皮细胞ｃＤＮＡ文库中筛选到能与ＭｇＰａ发生相互作用的蛋白ꎬ为了解ＭｇＰａ的生物学功能及Ｍｇ与宿主细胞相互作用的机制提供参考ꎮ参考文献:[１]㊀张岱ꎬ刘朝晖.生殖道支原体感染诊治专家共识[Ｊ].中国性科学ꎬ２０１６ꎬ２５(３):８０￣８２.[２]㊀ＴｕｌｌｙＪＧꎬＴａｙｌｏｒ￣ＲｏｂｉｎｓｏｎＤꎬＣｏｌｅＲＭꎬｅｔａｌ.ＡＮｅｗｌｙＤｉｓ￣ｃｏｖｅｒｅｄＭｙｃｏｐｌａｓｍａｉｎＴｈｅＨｕｍａｎＵｒｏｇｅｎｉｔａｌＴｒａｃｔ[Ｊ].Ｌａｎ￣ｃｅｔꎬ１９８１ꎬ１(８２３３):１２８８￣１２９１.[３]㊀ＨａｍａｓｕｎａＲ.Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍｉｎｍａｌｅｕｒｅｔｈｒｉｔｉｓ:Ｄｉａｇ￣ｎｏｓｉｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎＪａｐａｎ[Ｊ].ＩｎｔＪＵｒｏｌꎬ２０１３ꎬ２０(７):６７６￣６８４.[４]㊀ＬｉｓＲꎬＲｏｗｈａｎｉ￣ＲａｈｂａｒＡꎬＭａｎｈａｒｔＬＥ.Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉ￣ｕｍｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｆｅｍａｌｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｒａｃｔｄｉｓｅａｓｅ:ａｍｅｔａ￣ａ￣ｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].ＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓꎬ２０１５ꎬ６１(３):４１８￣４２６.[５]㊀ＲａｍａｚａｎｚａｄｅｈＲꎬＫｈｏｄａｂａｎｄｅｈｌｏｏＭꎬＦａｒｈａｄｉｆａｒＦꎬｅｔａｌ.ＡＣａｓｅ￣ｃｏｎｔｒｏｌＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍＩｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎＷｏｍｅｎｗｉｔｈＮｏｒｍａｌＰｒｅｇｎａｎｃｙａｎｄＳｐｏｎｔａｎｅｏｕｓＡｂｏｒｔｉｏｎｕｓｉｎｇＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＯｓｏｎｇＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＲｅｓＰｅｒｓｐｅｃｔꎬ２０１６ꎬ７(５):３３４￣３３８. [６]㊀Ｉｖｅｒｓｏｎ￣ＣａｂｒａｌＳＬꎬＷｏｏｄＧＥꎬＴｏｔｔｅｎＰＡ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＭｙ￣ｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍＭｇｐＢＡｄｈｅｓｉｎｔｏＰｒｅｄｉｃｔＭｅｍｂｒａｎｅＴｏ￣ｐｏｌｏｇｙꎬＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｅＡｎｔｉｂｏｄｙＡｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙꎬＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅＡｍｉｎｏＡｃｉｄＤｉｖｅｒｓｉｔｙꎬａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｙＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃＥｐｉｔｏｐｅｓ[Ｊ].ＰＬＯＳＯＮＥꎬ２０１５ꎬ１０(９):ｅ１３８２４４. [７]㊀ＭａＬꎬＪｅｎｓｅｎＪＳꎬＭａｎｃｕｓｏＭꎬｅｔａｌ.Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉ￣ｄｅｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｓｉｎｔｈｅＭｇＰａｏｐｅｒｏｎａｎｄｉｔｓｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｃｈｒｏ￣ｍｏｓｏｍａｌｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ[Ｊ].ＪＭｅｄＭｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌꎬ２０１２ꎬ６１(２):１９１￣１９７.[８]㊀戴佩ꎬ邓湘赢ꎬ余敏君ꎬ等.从Ｔ７噬菌体展示ｃＤＮＡ文库筛选生殖支原体黏附蛋白的互作蛋白[Ｊ].中国免疫学杂志ꎬ２０１８ꎬ３４(５):６５３￣６５７.[９]㊀ＺｅｎｇＹꎬＬｉｕＬꎬＨｅＪꎬｅｔａｌ.ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｍｉｃｅｐｉｔｏｐｅｏｆｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ[Ｊ].ＣａｎＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌꎬ２０１２ꎬ５８(７):８９８￣９０８.[１０]ＦｕｃｈｓＷꎬＫｒｅｕｔｅｒＡꎬＨｅｌｌｍｉｃｈＭꎬｅｔａｌ.ＡｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃａｎａｌｓｅｘｕａｌｌｙｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎＨＩＶ￣ｐｏｓｉｔｉｖｅｍｅｎａｔｔｅｎｄｉｎｇａ￣ｎａｌｃａｎｃｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ[Ｊ].ＢｒＪＤｅｒｍａｔｏｌꎬ２０１６ꎬ１７４(４):８３１￣８３８.[１１]ＮａｋａｍｕｒａＹꎬＨａｓｈｉｍｏｔｏＴꎬＩｓｈｉｉＪꎬｅｔａｌ.Ｄｕａｌ￣ｃｏｌｏｒｒｅｐｏｒｔｅｒｓｗｉｔｃｈｉｎｇｓｙｓｔｅｍｔｏｄｉｓｃｅｒｎｄｉｍｅｒｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｏｆＧ￣ｐｒｏｔｅｉｎ￣ｃｏｕ￣ｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｓｉｎｇＣｒｅ/ｌｏｘＰｓｉｔｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎｙｅａｓｔ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇꎬ２０１６ꎬ１１３(１０):２１７８￣２１９０. [１２]熊娟ꎬ徐笑红.肿瘤坏死因子超家族成员分子结构的研究进展[Ｊ].医学综述ꎬ２０１１ꎬ１７(２２):３４０７￣３４０９.[１３]ＬｉｎＹꎬＹｅｎＣꎬＣｈｅｎＨꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｓｅｒｏｌｏｇｉｃｄｅｃｏｙｒｅｃｅｐｔｏｒ３(ＤｃＲ３)ｌｅｖｅｌｓａｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｌｏｗｅｒｄｉｓｅａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｉｎＨＩＶ￣１/ＡＩＤＳｐａｔｉｅｎｔｓ[Ｊ].ＪＦｏｒｍｏｓＭｅｄＡｓｓｏｃꎬ２０１５ꎬ１１４(６):４９８￣５０３.[１４]ＬｉｕＹＪꎬＳｈａｏＬＨꎬＺｈａｎｇＪꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｄｅｃｏｙｒｅｃｅｐｔｏｒ３ａｎｄｓｏｌｕｂｌｅｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｎｍｙｅｌｏｉｄｃｅｌｌｓ￣１ｆｏｒｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｂａｃｔｅｒｉａｌｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ[Ｊ].ＡｎｎＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂꎬ２０１５ꎬ１４(１):１￣７. [１５]宁凤ꎬ傅俊江ꎬ陈汉春.金属硫蛋白及其生物学功能[Ｊ].中国生物化学与分子生物学报ꎬ２０１７ꎬ３３(９):８９３￣８９９. [１６]ＢｉｚｏńＡꎬＪｅꎬｄｒｙｃｚｋｏＫꎬＭｉｌｎｅｒｏｗｉｃｚＨ.Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｍｅｔａｌｌｏ￣ｔｈｉｏｎｅｉｎｉｎｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ[Ｊ].ＰｏｓｔｅｐｙＨｉｇＭｅｄＤｏｓｗ(Ｏｎｌｉｎｅ)ꎬ２０１７ꎬ７１(１):９８￣１０９.[１７]ＬｅｃｏｅｕｒＨꎬＢｏｒｇｎｅ￣ＳａｎｃｈｅｚＡꎬＣｈａｌｏｉｎＯꎬｅｔａｌ.ＨＩＶ￣１Ｔａｔｐｒｏｔｅｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙｉｎｄｕｃｅｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａ￣ｔｉｏｎａｎｄｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｘｉｄａｓｅ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓꎬ２０１２ꎬ３(３):ｅ２８２.[１８]邓湘赢.生殖支原体ＭｇＰａ特异结合多肽的功能鉴定与ＭｇＰａ细胞受体的鉴定[Ｄ].衡阳:南华大学ꎬ２０１７.３４２期㊀㊀㊀㊀㊀王磊等:利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)相互作用的宿主蛋白㊀㊀。
用酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用
这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有 两者通过共价或非共价键连接建立起来 的空间结构方可表现出一个完整的激活 特定基因表达的激活因子的功能。
Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活 因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基 酸残基组成的多肽链。
Nature，1993，364(6433):121-126.
酵母单杂交系统原理
• 在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交 系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的 DNA序列取代DNA Gal4结合位点。 • 该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白 质结合位点。 • 靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gal4 P 的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其 特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作 为表型选择性标志的报告基因的表达。
克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）
β-半乳糖苷酶
鉴定
（三）阴性干扰
两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表 达程度甚低以至于检测不出来。
原因：
融合蛋白的表达对细胞有毒性，该怎么办？
应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体
蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌 株或多拷贝载体。
蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正 确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。
三、酵母双杂交系统的优点
1. 高敏感性。 2. 真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力
无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。 3. 简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和
纯化蛋白质的繁琐步骤。 4. 广泛性。采用不同组织器官细胞适用于部分细胞质、细胞核及膜结合 蛋白。
酵母双杂交筛选与杨树Subgroup 4 MYB转录因子相互作用的蛋白质
酵母双杂交筛选与杨树Subgroup 4 MYB转录因子相互作用的蛋白质宫宇;魏建华;张少斌;王宏芝【摘要】MYB转录因子在次生细胞壁合成转录调控过程中发挥重要的作用.为了深入研究杨树Subgroup 4MYB转录因子的作用机制,应用酵母双杂交的方法,以杨树Subgroup 4 MYB基因Poptr_ 0004s18020.1 (MYB221)、Poptr_0009s 13640.1 (MYB 156)和Poptr_0019s00750.1 (MYB057)为诱饵蛋白,从毛白杨次生维管组织均一cDNA文库中筛选互作蛋白,获得了9个与Subgroup 4 MYB互作的蛋白质,并通过生物信息学方法分析候选蛋白可能的生物学功能.为进一步研究杨树Subgroup 4 MYB转录因子的作用机制奠定了基础.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2014(041)011【总页数】6页(P157-162)【关键词】MYB转录因子;酵母双杂交;互作蛋白【作者】宫宇;魏建华;张少斌;王宏芝【作者单位】沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110866;北京市农林科学院/北京农业生物技术研究中心,北京100097;北京市农林科学院/北京农业生物技术研究中心,北京100097;沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110866;北京市农林科学院/北京农业生物技术研究中心,北京100097【正文语种】中文【中图分类】Q946.1MYB蛋白是植物中成员最多的转录因子超家族之一，广泛参与植物生长发育、胁迫响应以及次生代谢过程的转录调节[1-2]。
近几年的研究表明，转录调节是木材次生生长的核心，在木材形成中起重要作用。
植物次生细胞壁形成的转录调控网络中，除了NAC家族转录因子外，R2R3-MYBs类转录因子广泛参与其中[3-5]。
植物的次生生长是一个复杂的细胞分化、发育的过程，主要是维管形成层启动的一系列活动，主要包括维管组织形成、次生细胞壁形成、木质化（木质素沉积）、细胞程序化死亡等。
酵母双杂交实验报告
酵母双杂交实验报告一、实验目的酵母双杂交技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的分子生物学方法。
本次实验的目的是通过构建酵母双杂交载体，转化酵母细胞，筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而深入了解蛋白质在细胞内的功能和调控机制。
二、实验原理酵母双杂交系统基于真核转录调控因子的结构和功能特点。
转录调控因子通常由两个结构域组成：DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。
这两个结构域单独存在时不能激活转录，但当它们在空间上足够靠近时，则能够协同作用，激活报告基因的表达。
在酵母双杂交系统中，将编码目标蛋白（“诱饵”蛋白）的基因与BD 构建融合表达载体，将待检测的蛋白（“猎物”蛋白）的基因与 AD 构建融合表达载体。
如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，那么 BD 和 AD 就能够在空间上靠近，从而激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达情况，就可以判断“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白是否存在相互作用。
三、实验材料与试剂1、菌株与载体酵母菌株：AH109载体：pGBKT7（含 BD 序列）、pGADT7（含 AD 序列）2、工具酶与试剂盒限制性内切酶：EcoRI、BamHI 等T4 DNA 连接酶质粒提取试剂盒PCR 试剂盒3、培养基YPD 培养基SD 缺失培养基（Leu、Trp、His、Ade 等）4、试剂氨苄青霉素卡那霉素XαGal3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）5、实验仪器恒温培养箱离心机PCR 仪电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、目的基因的扩增通过 PCR 技术从 cDNA 文库或基因组 DNA 中扩增出目标蛋白和待检测蛋白的编码基因。
设计合适的引物，在引物的 5'端引入限制性内切酶的酶切位点。
2、载体的构建分别用限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，然后通过 T4 DNA 连接酶将目的基因连接到载体上。
将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证。
酵母双杂交技术筛选与HCMV-UL146编码产物相互作用蛋白
酵母双杂交技术筛选与HCMV-UL146编码产物相互作用蛋白何蓉;丛树艳;齐莹;马艳萍;阮强;蒋树娟【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2012(22)4【摘要】目的应用酵母双杂交技术,在人胎脑文库中筛选与人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV) UL146基因编码蛋白相互作用蛋白,以探讨HCMV-UL146的生物功能.方法应用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-UL146诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人胎脑cDNA文库质粒的酵母相互作用,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌,提取质粒DNA进行测序分析.结果 pGBKT7-UL146构建成功.经严格筛选,共有200余个阳性克隆,分离测序80个克隆,成功筛选出30个与HCMV-UL146特异性相互作用的蛋白.结论 HCMV-UL146与多种蛋白有相互作用,提示其生物学功能复杂.此结果为进一步研究HCMV-UL146基因功能提供依据.【总页数】5页(P1-5)【作者】何蓉;丛树艳;齐莹;马艳萍;阮强;蒋树娟【作者单位】中国医科大学附属盛京医院临床遗传科,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院神经内科,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院病毒研究室,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院病毒研究室,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院病毒研究室,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院临床遗传科,辽宁沈阳110004【正文语种】中文【中图分类】R72;R3【相关文献】1.酵母双杂交技术筛选人PIF1解螺旋酶相互作用蛋白 [J], 王攀;王建校;李珊珊;刘晓丹;王豫;周平坤;顾永清2.利用酵母双杂交技术筛选草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒VP6和VP38相互作用蛋白的研究 [J], 王龙龙;邱军强;喻飞;王浩;吕利群3.利用酵母双杂交技术筛选人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白 [J], 周晓涛;周文涛;夏开德;刘化蝶;彭震;赵云娟;迪丽娜尔·波拉提;李家大4.酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证[J], 李彦芹;刘扬;梁丽玲;许阳5.酵母双杂交技术筛选人巨细胞病毒UL131A的相互作用蛋白 [J], 任高伟;崔鑫;齐莹;马艳萍;阮强;孙峥嵘因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酵母双杂交技术研究与人孕酮受体B相互作用的蛋白质
酵母双杂交技术研究与人孕酮受体B相互作用的蛋白质张佩景;李慧艳;潘欣;靳宝锋;满江红;李卫华;张学敏;张涌【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2005(16)6【摘要】应用酵母双杂交技术研究与人孕酮受体B(hPRB)发生相互作用的蛋白质,有助于进一步阐明其在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用的调控机制.应用酵母双杂交系统3,以hPRB不同结构域为诱饵,筛选人乳腺cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,并运用X-α-Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆.最终以AF1-DBD 结构域作为诱饵最终筛出了1个阳性克隆,经测序及生物信息学分析,这个克隆所编码的蛋白为PIAS3(活化的STAT3的蛋白抑制剂).结果表明,孕激素受体可以和PIAS3发生相互作用,它们的相互作用有可能参与乳腺癌的生长调控.【总页数】3页(P612-614)【作者】张佩景;李慧艳;潘欣;靳宝锋;满江红;李卫华;张学敏;张涌【作者单位】西北农林科技大学,生物工程研究所,陕西,杨凌,712100;军事医学科学院,仪器分析测试中心,北京,100850;军事医学科学院,仪器分析测试中心,北京,100850;军事医学科学院,仪器分析测试中心,北京,100850;军事医学科学院,仪器分析测试中心,北京,100850;军事医学科学院,仪器分析测试中心,北京,100850;军事医学科学院,仪器分析测试中心,北京,100850;军事医学科学院,仪器分析测试中心,北京,100850;西北农林科技大学,生物工程研究所,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】Q591.2;Q789【相关文献】1.利用噬菌体展示技术研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用——与酵母双杂交方法比较 [J], 张佳娣;石屹峰2.酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质 [J], 张志清;刘晓华;段梦;商艳芬;王立群;冷雪;钱令嘉3.大规模酵母双杂交技术研究蛋白质相互作用的应用 [J], 吴志豪;王建;贺福初4.酵母双杂交法筛选组织蛋白酶B相互作用蛋白质 [J],5.利用酵母双杂交技术筛选炭疽菌中与CsSSK1相互作用的蛋白质 [J], 方思齐;李泽栋;王记圆;何其光;李潇;刘文波;张宇;林春花;缪卫国因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《酵母双杂交筛选FKBP38相互作用蛋白及SQSTM1-p62功能初步研究》范文
《酵母双杂交筛选FKBP38相互作用蛋白及SQSTM1-p62功能初步研究》篇一酵母双杂交筛选FKBP38相互作用蛋白及SQSTM1-p62功能初步研究一、引言蛋白质与蛋白质之间的相互作用在生命活动中扮演着关键的角色，了解蛋白质间相互作用的机制，是探究生命科学的基础和前提。
FKBP38（肽基脯氨酸顺反异构酶）作为一种重要的蛋白质，其相互作用蛋白的筛选与研究对于揭示其生物学功能具有重要意义。
同时，SQSTM1/p62作为一种与多种细胞过程相关的蛋白质，其功能研究也备受关注。
本文旨在通过酵母双杂交技术筛选FKBP38的相互作用蛋白，并对SQSTM1/p62的功能进行初步研究。
二、酵母双杂交技术筛选FKBP38相互作用蛋白1. 材料与方法本部分实验采用酵母双杂交技术，以FKBP38为诱饵，筛选酵母cDNA文库中的相互作用蛋白。
具体步骤包括构建诱饵质粒、转化酵母细胞、文库筛选等。
2. 实验结果通过酵母双杂交技术，成功筛选出与FKBP38相互作用的蛋白。
经过生物信息学分析和文献调研，鉴定出部分与FKBP38相互作用的蛋白质，如某酶类、结构蛋白等。
这些结果为进一步研究FKBP38的生物学功能提供了重要的线索。
三、SQSTM1/p62功能初步研究1. 材料与方法本部分实验主要采用细胞生物学和分子生物学技术，研究SQSTM1/p62在细胞中的功能。
包括构建SQSTM1/p62的过表达和敲除细胞模型、检测相关生物学指标等。
2. 实验结果研究发现，SQSTM1/p62在细胞中具有多种功能，包括参与自噬过程、调节细胞凋亡等。
在过表达SQSTM1/p62的细胞模型中，观察到自噬水平明显提高，而敲除SQSTM1/p62则导致自噬水平降低。
此外，SQSTM1/p62还参与了细胞凋亡的调节，其表达水平的改变可能影响细胞的生存与死亡。
四、讨论通过酵母双杂交技术筛选出的FKBP38相互作用蛋白，为进一步研究FKBP38的生物学功能提供了新的方向。
酵母双杂交RRS筛选系统对已知蛋白间相互作用的验证
酵母双杂交技术
酵母双杂交技术引言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该技术能够检测和分析细胞内发生的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、代谢途径和疾病发生机制。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。
原理酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。
当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。
具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤：1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。
2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。
3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。
4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。
一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。
应用1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白质之间的相互关系和调控机制。
2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。
3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研发过程。
优缺点酵母双杂交技术具有以下优点：•高通量：酵母双杂交技术可以同时检测大量蛋白质之间的相互作用，有助于加速研究的进程。
•对新蛋白质相互作用的发现：酵母双杂交技术可以帮助发现未知的蛋白质相互作用，有助于揭示新的细胞信号传导途径和代谢途径。
•相对简洁易行：酵母双杂交技术不需要复杂的实验设备，相对容易实施。
蛋白与蛋白相互作用的研究方法
蛋白与蛋白相互作用的研究方法引言：蛋白质是生物体内最为重要的大分子，其功能多样且复杂。
蛋白质的功能往往通过与其他蛋白质相互作用来实现。
因此，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用成为了生物学与生物化学领域中的重要课题。
本文将介绍一些常用的蛋白质相互作用研究方法。
一、酵母双杂交技术（Y2H）酵母双杂交技术是一种常用的蛋白质相互作用研究方法。
该技术利用酵母细胞中的转录激活子域（activation domain）和DNA结合域（DNA binding domain）的相互作用来实现蛋白质的检测。
通过将感兴趣的蛋白质A与转录激活子域融合，蛋白质B与DNA结合域融合，当蛋白质A与蛋白质B相互作用时，可以使酵母细胞中的报告基因表达，从而实现蛋白质相互作用的检测。
二、共免疫沉淀法（Co-IP）共免疫沉淀法是另一种常用的蛋白质相互作用研究方法。
该方法利用抗体与特定蛋白质结合的特异性，将目标蛋白质与其他与之相互作用的蛋白质一同沉淀下来。
通过这种方法可以鉴定蛋白质A与蛋白质B之间的相互作用。
此外，共免疫沉淀法还可以用于分析蛋白质复合物的组成及其在细胞中的定位。
三、表面等离子体共振（SPR）表面等离子体共振技术是一种实时监测蛋白质相互作用的方法。
该技术通过将其中一个蛋白质固定在金属膜上，然后将另一个蛋白质溶液流经，利用光学传感器检测蛋白质结合引起的共振角位移，从而实时监测蛋白质的结合与解离过程。
该技术能够提供蛋白质相互作用的结合动力学参数，如结合常数和亲和力等信息。
四、质谱法（MS）质谱法是一种用于鉴定蛋白质相互作用的方法。
该方法通过将蛋白质复合物分离后进行质谱分析，利用质谱仪检测蛋白质的质量与荷电量，从而鉴定蛋白质复合物中的组分。
质谱法在鉴定蛋白质相互作用中具有高灵敏度和高特异性的优势，能够提供蛋白质复合物的组成及其相对丰度等信息。
五、荧光共振能量转移（FRET）荧光共振能量转移是一种基于蛋白质相互作用的实时监测方法。
酵母双杂合系统筛选相互作用的蛋白
酵母双杂合系统筛选相互作用的蛋白一基本原理酿酒酵母Saccharomyces cerevisae的GAL4蛋白881个氨基酸99000 dal是半乳糖降解酶半乳糖激酶半乳糖转移酶半乳糖异构酶基因gal的转录激活因子。
它由两个物理上可以分开功能上独立的结构域组成即N端1-147氨基酸的DNA结合结构域DNA binding domain BD和C端768-881氨基酸的转录激活结构域transcription activation domain AD。
BD可以和gal基因上游专一性的上游激活序列特异结合通过AD激活下游gal基因的转录单独的BD或AD都不能启动gal基因的转录。
研究表明不仅异源的BD与AD融合形成的融合蛋白可以起到转录激活的作用而且由相互作用的蛋白通过非共价键将两个分离的结构域联系起来同样能启动下游基因的转录。
酵母双杂合系统正是利用了GAL4的这一功能特点通过检测下游报告基因是否转录表达来判断与BD和AD融合表达的两个蛋白间是否相互作用。
基本步骤是将已知蛋白X基因与BD重组构建融合表达载体以表达的融合蛋白X-BD为诱饵同时构建与AD融合表达的cDNA文库将已知融合表达载体与文库共转染酵母细胞假如文库中的Y蛋白与X蛋白相互作用就可以通过这种相互作用将BD与AD连接在一起从而激活下游报告基因的转录和表达。
这样我们通过检测报告基因的表达就可以从文库中筛选到与X蛋白相互作用的未知蛋白分子见图1。
利用酵母双杂合系统不仅可以筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白而且在信号传导、细胞凋亡、基因表达调控等方面酵母双杂合系统也发挥着重要作用。
图1 酵母双杂合系统原理示意图A DNA-BD/P-X融合蛋白可与GAL1 UAS特异结合但是不能激活报告基因的转录B AD/P-Y融合蛋白不与GAL1 UAS特异结合不能激活报告基因的转录 C 通过P-X与P-Y的相互作用使DNA-BD与AD连在一起从而激活报告基因的转录二实验材料与方法酵母双杂合系统已有多种体系在此我们以GAL4体系为例介绍该系统所需要的实验材料和实验方法。
蛋白质相互作用的研究方法
蛋白质相互作用的研究方法蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）研究方法可以分为生化方法、细胞生物学方法、生物物理化学方法和计算方法等多个方面。
以下将详细介绍几种常用的研究方法。
1. 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid, Y2H）酵母双杂交法是一种广泛应用的PPI研究方法。
该方法利用酵母细胞中两个蛋白质结合后的活性报告基因表达，从而实现对蛋白质相互作用的筛选和鉴定。
该方法的优点是操作简单、高通量性能强，但也存在一些局限性，如可能存在假阳性结果和只能检测胞内相互作用。
2. 免疫共沉淀法（Immunoprecipitation, IP）免疫共沉淀法是一种常用的生化方法，用于鉴定蛋白质相互作用。
该方法基于抗体的特异性，将靶蛋白及其结合蛋白共同沉淀下来，通过蛋白质分析技术（如质谱分析）鉴定共沉淀的蛋白质。
该方法适用于研究细胞内和细胞间的蛋白质相互作用，但需要针对每个靶蛋白制备特异性抗体。
3. 原位近距离显微镜法（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）FRET是一种用于研究蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过将两个蛋白质分别与一对荧光染料标记，根据能量转移来检测蛋白质间的相互作用。
FRET可以在活细胞和组织中进行，具有高时空分辨率，但需要合适的显微镜设备和特定的染色体系。
4. 表面等离子体共振传感器法（Surface Plasmon Resonance, SPR）SPR是一种用于检测蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过检测表面等离子体共振信号的变化来定量分析蛋白质间的结合动力学和亲和性。
SPR具有高灵敏度和实时监测能力，可用于定量研究蛋白质相互作用，但需要具备专业的设备和表面修饰技术。
5. 结构生物学方法结构生物学方法包括X射线晶体学、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）和电子显微镜（Electron Microscopy, EM）等。
利用酵母双杂交技术筛选卵菌效应因子互作蛋白概述
山东农业大学学报(自然科学版),2019,50(3):357-360VOL.50NO.32019Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science Edition )doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2019.03.001数字优先出版:2019-03-07利用酵母双杂交技术筛选卵菌效应因子互作蛋白概述盛慧,陈姗姗,艾聪聪,冯锐,张修国*山东农业大学植物保护学院;山东省蔬菜病虫生物学省级重点实验室,山东泰安271018摘要:蛋白质是生命活动的执行者，其通过与DNA 、RNA 、蛋白质、脂类以及多糖等物质结合形成复合体以参与信号转导、防卫反应等复杂的生命活动，因此研究蛋白质之间相互作用可为揭示生命现象本质提供依据。
酵母双杂交（Yeast two hybrid,Y2H ）系统是筛选互作蛋白最常用的方法，它具快速、灵敏、简便、高效、广泛的优点。
卵菌是一类危害严重的植物病原菌，可分泌效应因子，直接或间接与寄主体内的蛋白发生作用从而促进病原菌侵染与定植，引起寄主发病或者干扰、抑制寄主的抗病反应，但目前对于病原卵菌效应因子的寄主靶标以及效应因子增加寄主对病原菌的敏感性机制知之甚少，因此，利用酵母双杂交技术筛选植物病原卵菌效应因子互作蛋白，为探明其致病机制显得尤为重要。
关键词:酵母双杂交技术;互作蛋白;卵菌;效应因子中图法分类号:S961.5文献标识码:A 文章编号:1000-2324(2019)03-0357-04A Review of Interaction Proteins of Oomycete Effectors Screened by Yeast Two Hybrid SystemSHENG Hui,CHEN Shan-shan,AI Cong-cong,FENG Rui,ZHANG Xiu-guo *College of Plant Protection/Shandong Agricultural University;Key Laboratory of Vegetable Pest and Biology of Shandong Province,Tai’an 271018,ChinaAbstract:Protein is the executor of life activities,which combines with DNA,RNA,proteins,lipids and polysaccharides to form complexes to participate in complex life activities such as signal transduction and defense reactions.Therefore,studying the interaction between proteins can provide a basis for revealing the nature of life phenomena.The yeast two-hybrid (Y2H)system is the most commonly method for screening interacting proteins,and it has the advantages of being fast,sensitive,simple,efficient and extensive.Oomycetes are a kind of serious plant pathogens,which can secrete effectors,promote the infestation and colonization of pathogens by interacting with proteins in the host,causing host disease or interference and inhibiting the host disease resistance response.However,little is known about the host target of pathogen effector and the mechanism by which the effector increases the host's sensitivity to pathogens.Therefore,it is particularly important to screen the ovarian effector interacting protein by yeast two-hybrid technique.Keywords:Yeast two hybrid system;interaction proteins;oomycetes;effectors生物信息学的发展极大地推动揭示了物种生命活动奥秘的进程，各种生命活动时刻存在着核酸、蛋白质等生物大分子之间的相互作用。
应用酵母双杂交系统筛选LKB1相互作用蛋白
应用酵母双杂交系统筛选LKB1相互作用蛋白徐卿;李洪涛;林峰;姚阳【摘要】目的应用酵母双杂交技术研究与抑癌基因LKB1发生相互作用的蛋白.方法应用酵母双杂交系统,以人 LKB1为诱饵,筛选人类全基因组开放阅读框酵母双杂交文库,寻找能与之相互作用的蛋白,并且通过免疫共沉淀和 GST-Pull down实验证实其之间的相互作用.结果经过酵母双杂交共获得17个克隆,经过验证分析,最终确定1个无重复阳性克隆.结论获得的1个基因编码的蛋白可能揭示LKB1新的作用机制.%Objective To study interaction proteins of LKB1 by yeast two-hybrid system. Methods Using LKB1 as bait, human ORFeome Y2H library was screened and the proteins interacting with LKB1 were searched, and confirmed by immunoprecipitation and GST-Pull down experiments. Results One true positive clones from yeast clones were obtained after verification. The results of Co-IP and GST-Pull downillustrated that HERC3 interacted with LKBl. Conclusion The encoding proteins we obtained may play important roles in finding the new function of LKBl.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2018(053)002【总页数】4页(P232-235)【关键词】LKB1;HERC3;酵母双杂交;泛素化【作者】徐卿;李洪涛;林峰;姚阳【作者单位】苏州大学附属第三医院肿瘤科,苏州 215006;上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科,上海 200233;上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科,上海200233;上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科,上海 200233;上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科,上海 200233【正文语种】中文【中图分类】R730.3;Q816LKB1(liver kinase B1)即STK11(serine/threonine protein kinase 11)，首次是在黑斑息肉综合征研究中被报道的[1]，其在胰腺、肝脏等机体器官组织中广泛表达。
酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝细胞蛋白
酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝细胞蛋白陈婉南;刘玲玲;吴云丽;焦伯延;林万松;林旭【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2010(026)010【摘要】目的筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(Middle hepatitis B surface protein,MHBs protein)相互作用的肝细胞蛋白.方法 PCR扩增MHBs编码基因并将S区起始密码子突变,获得目的基因MHBs-mut,克隆于诱饵载体pGBKT7.在证实MHBs-mut蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用.结果构建酵母双杂交诱饵载体,获得重组质粒pGBKT7- MHBs-mut.Western blot显示其在酵母中表达MHBs-mut蛋白.酵母双杂交筛选并验证,得到与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白:COP9信号体第五个亚单位(COPS5,又名C- Jun结合蛋白 1,c-Jun-activation-domain binding protein 1, JAB1).结论乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白与COPS5在酵母AH109细胞中具有相互作用.【总页数】5页(P907-911)【作者】陈婉南;刘玲玲;吴云丽;焦伯延;林万松;林旭【作者单位】福建医科大学,教育部消化道急性肺瘤得点实验室,福建省肺瘤微生物重点实验室,福州,350004;福建医科大学,教育部消化道急性肺瘤得点实验室,福建省肺瘤微生物重点实验室,福州,350004;福建医科大学,教育部消化道急性肺瘤得点实验室,福建省肺瘤微生物重点实验室,福州,350004;福建医科大学,教育部消化道急性肺瘤得点实验室,福建省肺瘤微生物重点实验室,福州,350004;福建医科大学,教育部消化道急性肺瘤得点实验室,福建省肺瘤微生物重点实验室,福州,350004;福建医科大学,教育部消化道急性肺瘤得点实验室,福建省肺瘤微生物重点实验室,福州,350004【正文语种】中文【中图分类】R373.21【相关文献】1.应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2结合的肝细胞蛋白编码基因 [J], 粱赟磊;洪源;成军;邢卉春;王琦;李越;张斌;樊万虎;袁菊;张黎颖2.CytoTrap酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒HBx蛋白相互作用的肝细胞蛋白 [J], 焦佰海;文艳;刘晓佳;冯悦;张阿梅;刘丽;夏雪山3.酵母双杂交技术筛选肝细胞中与羧基末端截短型乙型肝炎表面抗原中蛋白MHBst167蛋白结合蛋白的研究 [J], 李志群;马英骥;成军4.酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白C-12相互作用蛋白的研究 [J], 梁耀东;陆荫英;成军;李强;王琳;吴君;程明亮5.应用酵母双杂交技术筛选肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-X蛋白结合蛋白基因 [J], 刘敏;王琳;成军;张树林;邵清;张健;杨倩;董菁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酵母双杂交技术筛选人白细胞中与乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因
酵母双杂交技术筛选人白细胞中与乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因梁耀东;成军;李强;王琳;陆荫英;吴君;程明亮【期刊名称】《世界华人消化杂志》【年(卷),期】2003(11)12【摘要】目的:筛选并克隆人白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X 蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,进一步探讨 HBxAg 的生物学功能.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增 HBxAg 基因,连接入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人淋巴 cDNA 文库质粒 pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和 X-α-半乳糖(X-α-gal)上双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出 HBxAg 基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有 X-α-gal 的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落50个,其中含真核翻译延伸因子2基因20个,真核翻译延伸因子1基因1个,真核翻译起始因子3基因2个,急性髓样白血病MTG8蛋白基因2个,髓样关联分化蛋白基因1个,髓样分化主反应蛋白基因1个,皮肤 T 细胞淋巴瘤肿瘤抗原基因1个,大组织相容性复合物 Ib 抗原基因3个,白细胞抗原 CD37基因1个,慢性白细胞性白血病相关抗原基因1个,α白细胞整联蛋白基因1个,生长停止和 DNA 损伤诱导因子34基因1个,转录变异因子1基因2个,蛋白磷酸酶1调控抑制因子15A 基因1个,单核细胞系胞苷脱氨酶基因1个,巨噬细胞钙离子依赖型凝集素2基因1个,KIAA1949蛋白基因3个,尿激酶型血浆素原激活剂基因1个,GDP 分解抑制因子基因3个,软骨素4磺基转移酶基因1个,锌指蛋白1A 亚目基因1个和未知蛋白基因1个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒 X 蛋白的结合蛋白,为进一步研究 HBxAg 的生物学作用提供了新的线索.【总页数】4页(P1866-1869)【关键词】酵母双杂交技术;白细胞;乙型肝炎病毒X蛋白;结合蛋白;生物学功能;生物信息学;克隆;基因表达【作者】梁耀东;成军;李强;王琳;陆荫英;吴君;程明亮【作者单位】中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心;贵阳医学院第一附属医院感染科【正文语种】中文【中图分类】R373.21【相关文献】1.酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4A结合蛋白及CAML基因的克隆 [J], 程勇前;李晓东;王琳;成军;刘妍;徐东平;钟彦伟;曲建慧;田江克;戴久增2.酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4B结合蛋白 [J], 赵平;程勇前;于岩岩;王琳;刘妍;徐东平;钟彦伟;李晓东3.应用酵母双杂交技术筛选肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-X蛋白结合蛋白基因 [J], 刘敏;王琳;成军;张树林;邵清;张健;杨倩;董菁4.酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因 [J], 蔺淑梅;陈天艳;成军;王琳;梁耀东;李克;张树林5.应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因 [J], 李强;梁耀东;成军;王琳;张建;邵清;刘敏;程明亮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证
酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证李彦芹;刘扬;梁丽玲;许阳【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2018(029)009【摘要】目的通过酵母双杂交实验、免疫共沉淀及GST pull down技术筛选并验证肺癌细胞系95D细胞中与肺癌转移相关蛋白1 (lung cancer metastasis-related protein 1,LCMR1)相互作用蛋白,为进一步研究LCMR1在肺癌发生发展中的作用提供科学依据.方法将诱饵质粒pGBKT7-LCMR转化AH109,应用酵母双杂交系统筛选出95D细胞中与LCMR1相互作用的候选克隆;应用反复划线法、X-α-Gal显色法和共转化回复验证法排除假阳性克隆,对真阳性克隆进行测序及生物学分析;构建含Myc标签的LCMR1融合蛋白的重组载体pCMV-Myc-LCMR1载体,以及带flag标签的目标相互作用蛋白载体,共转染细胞,利用免疫共沉淀技术验证LCMR1与相互作用蛋白之前的相互作用;融合蛋白沉降(GST pull-down)法进一步体外验证LCMR1与相互作用蛋白之间的作用.结果诱饵质粒pGBKT7-LCMR1与95D细胞cDNA文库共转化AH109,初步获得20个候选克隆;重复划线法后获得16个阳性克隆,X-α-Gal显色法获得12个蓝色阳性克隆,进一步将文库质粒与诱饵质粒共转化酵母菌回复验证,最终获得6个真阳性克隆;成功构建含标签重组载pCMV-Myc-LCMR1、pcDNA3.0-flag-RPL29及pcDNA3.0-flag-GNG5载体,经免疫共沉淀验证LCMR1与RPL29在细胞内有相互作用,与GNG5在细胞内无相互作用;GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29在体外有相互作用,与GNG5在细胞外无相互作用.结论酵母双杂交技术筛选出95D细胞中相互作用蛋白6个,经免疫共沉淀和GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29体内体外均有相互作用.【总页数】6页(P895-900)【作者】李彦芹;刘扬;梁丽玲;许阳【作者单位】100853北京,解放军总医院呼吸内科;100853北京,解放军总医院呼吸内科;100853北京,解放军总医院呼吸内科;100853北京,解放军总医院呼吸内科【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白的筛选及验证 [J], 许阳;杨震;李春笋;李彦芹;梁志欣2.酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与肺癌转移相关蛋白作用的蛋白 [J], 喻航;王莉洁;吴珍;杨震3.酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与肺癌转移相关蛋白作用的蛋白 [J], 喻航;王莉洁;吴珍;杨震;4.利用酵母双杂交技术筛选人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白 [J], 周晓涛;周文涛;夏开德;刘化蝶;彭震;赵云娟;迪丽娜尔·波拉提;李家大5.酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白C-12相互作用蛋白的研究 [J], 梁耀东;陆荫英;成军;李强;王琳;吴君;程明亮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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Ａ ｓｒ ｃ： Ｍｙ １ ｓ ｅａ ｄｔ Ｐ （ ｐ ｉｇｐｎ ｌ ｒｎ ｓ） ｆ ｖａｂ ａ ｉｅ ｓ ． ｏｓ ｄ ｅ ｕ ｃｉｎｏ ｂ ｔａ ｔＨｂ ｂ ｌ ｅ Ｔ Ｄ ｔ ｐｎ ａ ｅ ｄｙ ｅｓ ｏ ｅ ｒｓｌ ｎ ｉ Ｔ ｔ ｙｔ ｎ ｔ ｆ ｗａ ｒ ｔ ｏ ａ Ｈｅ ｉ ｓ ｕ ｈ ｆ ｏ
选 出转化 成 功 的 克隆 。将 收 获得 到 的转 化 成 功 的
材 料 和 方 法
酵 母双 杂交 系 统试剂 盒（ＧＢ ７ Ｇ Ｔ ． ｐ ＫＴ 、ｐ ＡＤ ７
Ｒｅ ｃ、 ｐＧＢＫ７・ ５３、 ｐＧＢＫＴ７ Ｌａ 、 ｐＧＡＤＴ７ Ｒｅ Ｔ ・ ｍ ・ ｃ
克 隆 悬 浮 在 液 体 培 养 基 中 ，用 血 球 计 数 板 计 数 ， 测 定 文 库滴诱 饵载 体筛选 胶 ￣ Ａ文 ＧＢ Ｔ ． Ｍｙｌ ＬＤＮ ｃ 库 时 ， 用 酵 母 融 合 方 法 筛 选 ， 将 诱 饵 载 体
橡 胶 树死 皮 病 受 到各 植 胶 国 的高 度 重视 。人 们 为 了 寻找死 皮病 的发病 原 因和 探 索 死 皮机 制 ，从 其 病 理 学 （ 慕 容 等 １ ） 解 剖 学 （ ｍｅ 陈 ９１ 、 ９ ＧＯ ｚ和
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ｐ ＧＡＤＴ ． ｃ质粒 含 有 Ｌ ７ Ｒｅ ＥＵ基 因 、Ａｍ ｐ基 因和 ＧＡＬ ４ ＤＮＡ激 活 区（ ＧＡＬ ． ４ ＡＤ） ＧＢ ７ ５ 和 ；ｐ ＫＴ ． ３ ｐ ＤＴ ． ｅＴ为系统 阳性 对照 ；ｐ Ｂ Ｔ ． ａ 为 ＧＡ ７Ｒ ｃ Ｇ Ｋ ７Ｌ ｍ 系统 阴性 对照 。大肠杆 菌 （ｓ ｈ ｒ ｈａｃ ｌ Ｊ １９ Ｅ ｃ ｅｉ ｉ ｏｉ Ｍ ０ ｃ ） 为 本 室保 存 。３ＡＴ、Ｘ．ｃ ｌ 自 Ｓ ｇ ． ０ Ｇａ 购 ． ｉ ｍａ公 司 。 限制 性 内切酶 和连接 酶购 自Ｔ Ｋａ 公司 。巴西橡 ａ Ｒａ 胶树 （ ｖａｂａ ｉｅ ｓ ｅ ． ｒ） Ｈｅｅ ｒｓ ｉｎｉＭｕ ｌ Ａ ｇ无性 系Ｒ Ｉ ０ ｌ ｓ １ Ｒ Ｍ６ ０ 胶 乳 采 自本 院 试 验 农 场 。 诱 饵载 体 的构 建根 据文 献报 道 的 Ｈｂ ｂ Ｍｙ ｌ基
Ｒ ＮＡ，用 Ｏｌ ｏ（ Ｔ 引物 合 成 第 １链 ，再 以第 １ ｉ ｇ ｄ） 链 为模 板 ，用 Ｌ Ｐ Ｒ 方法 合 成 双链 ｃ Ｄ． Ｃ ＤＮＡ，对 得 到 的ｃ ＤＮＡ进 行纯 化后 和载体 ｐ ＧＡＤ ． ｅ 对酵 Ｙ７Ｒ ｃ
母 菌株 ＡＨ１９进 行 共转 化 。在 Ｓ ．ｒ 板上 筛 ０ Ｄ／ ｐ平 Ｔ
学 教 研 室 ，海 口 ５ １ ０ ７ １１
提要 ：Ｈｂ ｂ 是橡胶树 死皮 病相 关基 因，为 了进一步研究 Ｈ Ｍｙ １ Ｍｙ Ｉ ｂ ｂ 的功能，采用酵ｂ ｂ 发生相互作用 的蛋 白，包括 已知 的橡胶延伸 因子和橡胶 小粒子蛋 白等 ，其 中４个分别与 ３ 羟 酰 一 基 ． Ｃ 一 氢酶 、ＮＡ 依 赖的 山梨糖 醇脱 氢酶、氧化还原酶 、假 定的富含 亮氨酸 重复蛋 白具有 同源性 的蛋 白，其余 ４个 Ａ Ｐ脱 Ｄ一
纹 或 者 出现 树 皮爆 裂 症状 。据 估 计 ，全世 界 每 年
并 提 出 了各 种假 说 。但 对 于死 皮 病 发 生 的真 正 原
因，至 今 还 没有 得 到 令人 满 意 的解 释 。 为研 究 橡 胶 树 死 皮 病 发 生 和 发 展 的 分 子 机 制 ，Ｃｈｅ ｎ等 （ ０ ２ 采 用 ＤＤＲＴ— ＣＲ 技 术 从 橡 胶 树 无 性 系 ２０） Ｐ Ｒ Ｉ ０ Ｒ Ｍ６ ０胶乳 中克 隆 了 １ 个类 Ｍｙ 激 活 转录 因子 ｂ
Ｋｅ ｏ ｄ ： ｖａｂａ ｉｅｓｓ ｔ ｐｎ ａ ｅ ｄｙ ｅｓ Ｔ Ｄ ； Ｍ ｙ ｙ ａｔｗｏｈ ｂ ｄｓ ｓ ｍ ｙｗ ｒ ｓ Ｈｅ ｅ ｒｓｌ ｎ ｉ ａ ｉｇｐ ｌ ｒｎ ｓ （ Ｐ ） Ｈｂ ｂ ； ｅ ｓｔ —ｙ ｒ ｔ ｉ ； ｐ ｎ １ ｉ ｙｅ
巴西 橡胶 树（ ｖａｂａｉｅｓｓ是种 重要 的产 Ｈｅｅ ｒｓｉｎｉ ｌ ） 胶 植物 ，也 是天 然 橡 胶 的唯 一 商业 来 源 。 橡 胶树 死 皮病 （ ｐ ｉｇｐ ｎ ｌ ｒｎ ｓ，Ｔ Ｄ） 为天 然橡 ｔ ｐｎ ａ ｅ ｄｙ ｅｓ Ｐ 作 ａ 胶 单 产提 高 的限制 因子 ， 在世 界 各 橡胶 种 植 园普 遍 发 生 ，对 橡 胶种 植 业 危 害很 大 。 橡胶 树 死 皮病 发生 时 ，割 线 的局 部 或 全 部乳 管 堵塞 ，排 胶 量大 大 减 少甚 至 停排 ，严 重 时树 皮 产 生褐 色 斑 点 、斑
Ｔ ｎ ｐ ｏ ｅ ｎ ｎ ｅ ａ ｔ ｄ ｗｉ Ｍ ｖ ｐ ｏ ｅ ｎ ｗｅ ｅｏ ｔ ｉ ｅ ． ｅ ｒ ｔ ｉ ｓｉ ｔ ｒ ｃ ｅ ｔ Ｈｂ ｈ ｂ１ ｒ ｔ ｉ ｒ ｂ ａ ｎ ｄ Ａｍｏ ｇ ｔ ｅ ， ｒ ｔ ｉ ｓｗｉ ｎ ｗｎ ｆ ｎ ｔｏ ｓ ｎ ｈ ｍ ６ ｐ ｏ ｅ ｎ ｔ ｋ ｏ ｕ ｃ ｉ ｎ ｈ ｗｅ ｅｏ ｔ ｉ ｅ ， ｎ ｌ ｄ ｎ ｅｒ ｂ ｅ ｌ ｎ ａ ｉ ｎ ｆ ｃ ｏ ， ｍａ ｌ ｂ ｅ ａ ｔ ｌ ｒ ｔ ｉ ， 一 ｙ ｒ ｘ ａ ｙ — ｃ ｌｃ ｒ ｅ ｒ ｂ ａｎ ｄ ｉ ｃ ｕ ｉ ｇ ｔ ｂ ｒ ｏ ｇ ｔ ａ ｔ ｒ ｓ ｌ ｒ ｂ ｒｐ ｒｉ ｅｐ ｏ ｅ ｎ ３ ｈ ｄ ｏ ｙ ｃ ｌａ ｙ — ａ ｄ ｒ ｈ ｕ ｅ ｏ ｕ ｃ
Ｈ Ｍｙ ｌ ｂ ｂ ，对 该基 因进 行 Ｎｏ ｔｅｎＢｌｔ 析表 明， ｒ ｒ ｏ 分 ｈ Ｈｂ ｂ Ｍｙ 健 康 树 中 表 达 强 ， 在 死 皮 树 中表 达 Ｊ在
弱 ；在抗 死 皮 品种 或 种 质 中表 达 强 ，在 对死 皮 敏
感 品种或 种 质 中表达 弱 ；在 树 皮 中表 达 强 ，在 叶
等穿梭质粒及所有的酵母培养基） 和酵母工程菌株
（ 口 ｃｌｒ，） Ｐ ｅ ｅ ｉｉｅ ｃ ． Ｄ ， ｃ ｒｖｓａ ）ＡＨ１ ９ ｝ ｎ ｃ ０ 、Ｙ１ ７购 自 ８
Ｃ ｏ ｔ ｈ公 司。其 中 ｐ Ｂ Ｔ ｌｎｅ ｃ Ｇ Ｋ ７质粒 含有 豫 Ｐ基 因 、
Ｋａ ｎ基 因 和 ＧＡＬ ４ ＤＮＡ 结 合 区（ ＧＡＬ ． ４ ＢＤ） ；
ＤＥ ＮＧ ｈ ’ ＺＨＡＮＧ ｎ Ｘｉ２ ＣＨＥＮ ｕ — ｕ ， Ｚ ｉ ， Ｙｕ — ａ ， Ｃｈ ｎ Ｌｉ ＣＨＥＮ ｈ ｕ Ｃａ Ｓ ｏ — ｉ，
Ｒ ｂ ｅ ｅｅ ｒｈＩｓｉ ｔ， ｈｎ ｓ ａ ｅ ｙｏ ｏ ｉａ ｇｉｕｔｒｌ ｃｅｃ ｓＫ ｙＬ ｂ ｒｔｒ ｕｔ ａｉｎＰ ｙｉｌｇ ｒ ｕ ｂ ｒ ｓａｃ ｔｕｅ Ｃ ｉｅｅ Ｒ ｎ ｔ Ａｃｄ ｍ Ｔ ｐｃ ｌ ｒ ｌ ａ ｉｎ ｅ， ｅ ａ ｏ ａｏｙｏ Ｃ ｌｖ ｔ ｈ ｓ ｏｙ ｏ ｆ ｒ Ａ ｃ ｕ Ｓ ｆ ｉ ｏ ｏ ｆ Ｔｏ ｉ ｌ ｒｐ 。 ｎｓｒ Ａ ｒ ｕｔｒｌ ｎｈ ｕ Ｈａｎｎ５ ｌ３ ．Ｃ ｉ ；Ｓａ Ｒ ｏ ｉｃｅ ｓｒ Ｈａｎ ｎ ｄｃ ｌ ｏｌ ｅ ｒ ｃ ｏ ｓＭｉｉ ｙ ｏ ｇ ｉ ｌ ａ， ｚｏ ． ｉａ ７ ７ ｈｎ ２ｔｆ ｏ ｍ ｏ Ｂ ｏｈｍｉ ｙ ｐ ａＣ ｔ ｆ ｃ ｕ Ｄａ ７ ａ ｆ ｆ ｔ ， ｉ ｉ ｌｇ ． ａ Ｍｅ ａ Ｃ ｅ
然 有 限 。 本 文 利 用 酵 母 双 杂 交 技 术 ， 寻 找 与 Ｈｂ ｙ １相 互 作 用 的橡 胶 树 胶 乳 相 关 蛋 白分 子 ， Ｍ ｂ 为进 一步 查 ｆＨｂ ｂ 的生物 学功 能和 阐 明其 在橡 １ Ｍｙ ｌ ） ￣ 胶 树 体 内 的作 用 机 制 提 供 参 考 。
相关 基 因 。但 迄今 为 止人 们对 Ｈｂ ｂ Ｍｙ １的认 识 仍
日中等 １９） ９ ７、遗传 学（ 思伟和 杨少 琼 １９ ） 范 ９５和气 候 环境 （ｕｈ ａｅ 等 １７ ） 诸方 面进 行 了研 究 ， Ｐ ｓｐｄ ｓ ５等 ９
收稿 ２ ０ ．７ １ 修 定 ２ ０ ． １１ ０ ７０ ．８ ０ ７１．３
植物生理学通讯 第 ４ ３卷 第 ６期 ，２ ０ ０ ７年 １ ２月
１３ ０１
采用酵母双杂交法筛选 Ｈ Ｍｙ ｌ ｂ ｂ 相互作用蛋 白
邓 治 ，张云 霞 ，陈春柳 ，陈守才 ，
中国热带农业 科学 院橡 胶研究 所 ，农业部热 带作物 栽培生理 学重 点实验室 ，海 南儋州 ５ １ ３ ； 海南 医学 院生物化 ７ ７ ７
为 未 知 蛋 白。
关键词 ：巴西橡胶树 ；死皮 病；Ｈｂ ｂ ；酵母双 杂交 Ｍｙ １
Ｓ ｒ ｅ ｉ ｆ ｈ ｏ ｅｎＩ ｔ ｒ ｃｉ ｎｗｉｈＨｂ ｙ ｉ ｇＹ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｎｇｏ ｅＰｒ ｔｉ ｎ ｅ ａ ｔ ｔ Ｍ ｂｌＵｓｎ ａ ｔ ｔ ｏ Ｔｗｏ ｈ ｂ ｉ ・ ｙ ｒｄ Ｓ ｓｅ ｙ ｔｍ
ｐｒ ｔ ｉ ｅ ｙ ｒ ｔｓ ， ｏ ｅ ｎ ｄ ｈ ｄ ａ ａ ｅ ＮＡＤ— ｅ ｅ ｅ ｔＳ ｒ ｔ ｌ ｈｙ ｒ ｇ ｎ ｓ ｎ ｙ ， ｘｉ ｏ ｅ ｃ ａ ｅ ａ ｕ ａ ｉ ｅｌ ｕ ｉ ｅ ｒｃ ｄ ｐ ｎｄ ｎ Ｏ ｂｉｏ ｄｅ ｄ ｏ ｅ ａ ｅｅ ｚ ｍｅ ｏ ｄ ｒ ｄｕ ｔ ｓ ｎｄ ｐ ｔ ｔｖ ｅ ｃ ｎ —ｉｈ ｒ ｐ ａ ｏ ｅｎ． ｏ ｅｎｓｗｉ ｎｋ ｏｗｎ ｆ ｃ ｉ ｎ ｗｅ ｅ ｆ ｕ ｅ ｅ ｔｐｒ ｔ ｉ ４ ｐｒ ｔ ｉ ｔ ｕ ｎ ｈ ｕｎ ｔｏ ｒ ｏ ｎｄ． ｅｓ ｒ ｃ ｕ ｄ ｈ ｌ ｏ ｈ ｕ ｔ ｒｓｕ ｎ Ｔｈ ｅ ｗｏ ｋ ｏ ｌ ｅ ｐ ｆ ｒｔ ｅ ｆ ｒｈｅ ｔ ｄｙ ｏ ｈ ｕ ｔｏ ｆＨｂ ｔ ｅｆ ｎｃｉ ｎ ｏ Ｍ ｙ ａ ｈ ｌｄｆｃ ｔｏ ｆｍｅ ｈａ ｉｍ ｆｔ ｅＴＰＤ． ｂ１ ｎｄ ｔ ｅ ｃ ａ ｉ ａｉ ｎ ｏ ｃ ｎ ｓ ｏ ｈ