采用酵母双杂交法筛选HbMybl相互作用蛋白

Ｈ Ｍｙ ｌ ｂ ｂ ，对 该基 因进 行 Ｎｏ ｔｅｎＢｌｔ 析表 明， ｒ ｒ ｏ 分 ｈ Ｈｂ ｂ Ｍｙ 健 康 树 中 表 达 强 ， 在 死 皮 树 中表 达 Ｊ在
弱 ；在抗 死 皮 品种 或 种 质 中表 达 强 ，在 对死 皮 敏
感 品种或 种 质 中表达 弱 ；在 树 皮 中表 达 强 ，在 叶
ＨｂＭ ｙｂｌｐｒ ｔ ｉ ｗｅｕｓ ｄ ｙｅ ｓ ｗｏ ｈ ｂｒｄ ａ ｓ ｙ ｔ ｃ ｅ ｎ ａ ｌｔ ｘ ｃ ｏ ｅ ｎ． ｅ ａ ｔｔ — ｙ ｉ ｓ ａ ｏ ｓ ｒ ｅ ａｅ ＤＮＡ ｉ ｒ ｒ ｔ ｆ ｌｌ ｎｇ ｈ ｏ Ｍ ｙ ｌｂ ａ ｙ ｗｉ ｕｌ—ｅ ｔ ｆＨｂ ｂ１． ｈ
Ｔ ｎ ｐ ｏ ｅ ｎ ｎ ｅ ａ ｔ ｄ ｗｉ Ｍ ｖ ｐ ｏ ｅ ｎ ｗｅ ｅｏ ｔ ｉ ｅ ． ｅ ｒ ｔ ｉ ｓｉ ｔ ｒ ｃ ｅ ｔ Ｈｂ ｈ ｂ１ ｒ ｔ ｉ ｒ ｂ ａ ｎ ｄ Ａｍｏ ｇ ｔ ｅ ， ｒ ｔ ｉ ｓｗｉ ｎ ｗｎ ｆ ｎ ｔｏ ｓ ｎ ｈ ｍ ６ ｐ ｏ ｅ ｎ ｔ ｋ ｏ ｕ ｃ ｉ ｎ ｈ ｗｅ ｅｏ ｔ ｉ ｅ ， ｎ ｌ ｄ ｎ ｅｒ ｂ ｅ ｌ ｎ ａ ｉ ｎ ｆ ｃ ｏ ， ｍａ ｌ ｂ ｅ ａ ｔ ｌ ｒ ｔ ｉ ， 一 ｙ ｒ ｘ ａ ｙ — ｃ ｌｃ ｒ ｅ ｒ ｂ ａｎ ｄ ｉ ｃ ｕ ｉ ｇ ｔ ｂ ｒ ｏ ｇ ｔ ａ ｔ ｒ ｓ ｌ ｒ ｂ ｒｐ ｒｉ ｅｐ ｏ ｅ ｎ ３ ｈ ｄ ｏ ｙ ｃ ｌａ ｙ — ａ ｄ ｒ ｈ ｕ ｅ ｏ ｕ ｃ
学 教 研 室 ，海 口 ５ １ ０ ７ １１
提要 ：Ｈｂ ｂ 是橡胶树 死皮 病相 关基 因，为 了进一步研究 Ｈ Ｍｙ １ Ｍｙ Ｉ ｂ ｂ 的功能，采用酵母 双杂 交方法 ，从胶 乳 ｃ ＤＮＡ文库 中筛选 出 １ ０个与 Ｈ Ｍｙ ｌ ｂ ｂ 发生相互作用 的蛋 白，包括 已知 的橡胶延伸 因子和橡胶 小粒子蛋 白等 ，其 中４个分别与 ３ 羟 酰 一 基 ． Ｃ 一 氢酶 、ＮＡ 依 赖的 山梨糖 醇脱 氢酶、氧化还原酶 、假 定的富含 亮氨酸 重复蛋 白具有 同源性 的蛋 白，其余 ４个 Ａ Ｐ脱 Ｄ一
因橡胶 树 死皮 病损 失 的干 胶产 量 为 ５ １ ｔ × ０ ，价 值
相 当于 ４亿 美 元 （ 菊 生和 周 钟 毓 １ ９ ） 因此 ， 蒋 ９９。
中表 达 弱 ；在 远 离 死 皮 树 割 线 的树 皮 中 表达 强 ，
在 割 线 附近 表 达 弱 ， 因 此认 为 该基 因是 死 皮抗 性
等穿梭质粒及所有的酵母培养基） 和酵母工程菌株
（ 口 ｃｌｒ，） Ｐ ｅ ｅ ｉｉｅ ｃ ． Ｄ ， ｃ ｒｖｓａ ）ＡＨ１ ９ ｝ ｎ ｃ ０ 、Ｙ１ ７购 自 ８
Ｃ ｏ ｔ ｈ公 司。其 中 ｐ Ｂ Ｔ ｌｎｅ ｃ Ｇ Ｋ ７质粒 含有 豫 Ｐ基 因 、
Ｋａ ｎ基 因 和 ＧＡＬ ４ ＤＮＡ 结 合 区（ ＧＡＬ ． ４ ＢＤ） ；
ｐｒ ｔ ｉ ｅ ｙ ｒ ｔｓ ， ｏ ｅ ｎ ｄ ｈ ｄ ａ ａ ｅ ＮＡＤ— ｅ ｅ ｅ ｔＳ ｒ ｔ ｌ ｈｙ ｒ ｇ ｎ ｓ ｎ ｙ ， ｘｉ ｏ ｅ ｃ ａ ｅ ａ ｕ ａ ｉ ｅｌ ｕ ｉ ｅ ｒｃ ｄ ｐ ｎｄ ｎ Ｏ ｂｉｏ ｄｅ ｄ ｏ ｅ ａ ｅｅ ｚ ｍｅ ｏ ｄ ｒ ｄｕ ｔ ｓ ｎｄ ｐ ｔ ｔｖ ｅ ｃ ｎ —ｉｈ ｒ ｐ ａ ｏ ｅｎ． ｏ ｅｎｓｗｉ ｎｋ ｏｗｎ ｆ ｃ ｉ ｎ ｗｅ ｅ ｆ ｕ ｅ ｅ ｔｐｒ ｔ ｉ ４ ｐｒ ｔ ｉ ｔ ｕ ｎ ｈ ｕｎ ｔｏ ｒ ｏ ｎｄ． ｅｓ ｒ ｃ ｕ ｄ ｈ ｌ ｏ ｈ ｕ ｔ ｒｓｕ ｎ Ｔｈ ｅ ｗｏ ｋ ｏ ｌ ｅ ｐ ｆ ｒｔ ｅ ｆ ｒｈｅ ｔ ｄｙ ｏ ｈ ｕ ｔｏ ｆＨｂ ｔ ｅｆ ｎｃｉ ｎ ｏ Ｍ ｙ ａ ｈ ｌｄｆｃ ｔｏ ｆｍｅ ｈａ ｉｍ ｆｔ ｅＴＰＤ． ｂ１ ｎｄ ｔ ｅ ｃ ａ ｉ ａｉ ｎ ｏ ｃ ｎ ｓ ｏ ｈ
ｐ Ｋ ７Ｈｂ ｂ ＧＢ Ｔ ． Ｍｙ ｌ和文库 宿主菌 液放在 同一 长颈瓶 中融 合 ２ ，用 显 微镜 观 察 有无 融 合子 出现 。酵 ０ｈ 母融 合后将 菌液涂 布在三 缺平板 Ｓ ． ｓ Ｌ ｕ－ｒ， Ｄ／ ， ｅ ／ ｐ Ｈｉ － Ｔ ３ＡＴ和 四缺 Ｓ ． ｅ． ｓ Ｌ ｕ．ｒ／． Ｔ平板上 ， ． Ｄ／ Ａｄ ／ ／ ｅ， ｐ３Ａ Ｈｉ ． Ｔ
选 出转化 成 功 的 克隆 。将 收 获得 到 的转 化 成 功 的
材 料 和 方 法
酵 母双 杂交 系 统试剂 盒（ＧＢ ７ Ｇ Ｔ ． ｐ ＫＴ 、ｐ ＡＤ ７
Ｒｅ ｃ、 ｐＧＢＫ７・ ５３、 ｐＧＢＫＴ７ Ｌａ 、 ｐＧＡＤＴ７ Ｒｅ Ｔ ・ ｍ ・ ｃ
克 隆 悬 浮 在 液 体 培 养 基 中 ，用 血 球 计 数 板 计 数 ， 测 定 文 库滴 度 。此 即胶 乳 酵 母双 杂 交 文库 宿 主菌 液 。 ｐ Ｋ ７Ｈｂ ｂ 诱 饵载 体筛选 胶 ￣ Ａ文 ＧＢ Ｔ ． Ｍｙｌ ＬＤＮ ｃ 库 时 ， 用 酵 母 融 合 方 法 筛 选 ， 将 诱 饵 载 体
Ｒ ＮＡ，用 Ｏｌ ｏ（ Ｔ 引物 合 成 第 １链 ，再 以第 １ ｉ ｇ ｄ） 链 为模 板 ，用 Ｌ Ｐ Ｒ 方法 合 成 双链 ｃ Ｄ． Ｃ ＤＮＡ，对 得 到 的ｃ ＤＮＡ进 行纯 化后 和载体 ｐ ＧＡＤ ． ｅ 对酵 Ｙ７Ｒ ｃ
Байду номын сангаас
母 菌株 ＡＨ１９进 行 共转 化 。在 Ｓ ．ｒ 板上 筛 ０ Ｄ／ ｐ平 Ｔ
纹 或 者 出现 树 皮爆 裂 症状 。据 估 计 ，全世 界 每 年
并 提 出 了各 种假 说 。但 对 于死 皮 病 发 生 的真 正 原
因，至 今 还 没有 得 到 令人 满 意 的解 释 。 为研 究 橡 胶 树 死 皮 病 发 生 和 发 展 的 分 子 机 制 ，Ｃｈｅ ｎ等 （ ０ ２ 采 用 ＤＤＲＴ— ＣＲ 技 术 从 橡 胶 树 无 性 系 ２０） Ｐ Ｒ Ｉ ０ Ｒ Ｍ６ ０胶乳 中克 隆 了 １ 个类 Ｍｙ 激 活 转录 因子 ｂ
Ｈａｉ ｏ １ ０１ ｋ ｕ ５７ １ 。Ｃｈｉ ｎａ
Ａ ｓｒ ｃ： Ｍｙ １ ｓ ｅａ ｄｔ Ｐ （ ｐ ｉｇｐｎ ｌ ｒｎ ｓ） ｆ ｖａｂ ａ ｉｅ ｓ ． ｏｓ ｄ ｅ ｕ ｃｉｎｏ ｂ ｔａ ｔＨｂ ｂ ｌ ｅ Ｔ Ｄ ｔ ｐｎ ａ ｅ ｄｙ ｅｓ ｏ ｅ ｒｓｌ ｎ ｉ Ｔ ｔ ｙｔ ｎ ｔ ｆ ｗａ ｒ ｔ ｏ ａ Ｈｅ ｉ ｓ ｕ ｈ ｆ ｏ
ｐ ＧＡＤＴ ． ｃ质粒 含 有 Ｌ ７ Ｒｅ ＥＵ基 因 、Ａｍ ｐ基 因和 ＧＡＬ ４ ＤＮＡ激 活 区（ ＧＡＬ ． ４ ＡＤ） ＧＢ ７ ５ 和 ；ｐ ＫＴ ． ３ ｐ ＤＴ ． ｅＴ为系统 阳性 对照 ；ｐ Ｂ Ｔ ． ａ 为 ＧＡ ７Ｒ ｃ Ｇ Ｋ ７Ｌ ｍ 系统 阴性 对照 。大肠杆 菌 （ｓ ｈ ｒ ｈａｃ ｌ Ｊ １９ Ｅ ｃ ｅｉ ｉ ｏｉ Ｍ ０ ｃ ） 为 本 室保 存 。３ＡＴ、Ｘ．ｃ ｌ 自 Ｓ ｇ ． ０ Ｇａ 购 ． ｉ ｍａ公 司 。 限制 性 内切酶 和连接 酶购 自Ｔ Ｋａ 公司 。巴西橡 ａ Ｒａ 胶树 （ ｖａｂａ ｉｅ ｓ ｅ ． ｒ） Ｈｅｅ ｒｓ ｉｎｉＭｕ ｌ Ａ ｇ无性 系Ｒ Ｉ ０ ｌ ｓ １ Ｒ Ｍ６ ０ 胶 乳 采 自本 院 试 验 农 场 。 诱 饵载 体 的构 建根 据文 献报 道 的 Ｈｂ ｂ Ｍｙ ｌ基
相关 基 因 。但 迄今 为 止人 们对 Ｈｂ ｂ Ｍｙ １的认 识 仍
日中等 １９） ９ ７、遗传 学（ 思伟和 杨少 琼 １９ ） 范 ９５和气 候 环境 （ｕｈ ａｅ 等 １７ ） 诸方 面进 行 了研 究 ， Ｐ ｓｐｄ ｓ ５等 ９
收稿 ２ ０ ．７ １ 修 定 ２ ０ ． １１ ０ ７０ ．８ ０ ７１．３
橡 胶 树死 皮 病 受 到各 植 胶 国 的高 度 重视 。人 们 为 了 寻找死 皮病 的发病 原 因和 探 索 死 皮机 制 ，从 其 病 理 学 （ 慕 容 等 １ ） 解 剖 学 （ ｍｅ 陈 ９１ 、 ９ ＧＯ ｚ和
Ｇ ａ ｄｍａｈ ９ ０ 、 生理 生化 （ ｈ ｅｔ ９ ９ 曾 ｈ ｉ ｔｉ ９ ） ｎ １ Ｃ ｒｓｉ １ ８ ； ｎ
资助 中国热带 农业科 学院 科技基 金（ ｙ ５ ０ ） Ｒｋ ０ ０１ ３ 。 ・ 通讯作者（ ｍａ ｃ０ ＠１３ｃ ｒ；Ｔ １ ０ ９ ． ３ １７ ） Ｂ－ ｉ ｓｃ ７ ６． ｎ ｅ． ８ ８２ ０ １４ 。 ｈ ｏ ３
１ ３ ０２
植物生理学通讯 第 ４ ３卷 第 ６期 ，２ ０ ０ ７年 ｌ ２月
Ｋｅ ｏ ｄ ： ｖａｂａ ｉｅｓｓ ｔ ｐｎ ａ ｅ ｄｙ ｅｓ Ｔ Ｄ ； Ｍ ｙ ｙ ａｔｗｏｈ ｂ ｄｓ ｓ ｍ ｙｗ ｒ ｓ Ｈｅ ｅ ｒｓｌ ｎ ｉ ａ ｉｇｐ ｌ ｒｎ ｓ （ Ｐ ） Ｈｂ ｂ ； ｅ ｓｔ —ｙ ｒ ｔ ｉ ； ｐ ｎ １ ｉ ｙｅ
巴西 橡胶 树（ ｖａｂａｉｅｓｓ是种 重要 的产 Ｈｅｅ ｒｓｉｎｉ ｌ ） 胶 植物 ，也 是天 然 橡 胶 的唯 一 商业 来 源 。 橡 胶树 死 皮病 （ ｐ ｉｇｐ ｎ ｌ ｒｎ ｓ，Ｔ Ｄ） 为天 然橡 ｔ ｐｎ ａ ｅ ｄｙ ｅｓ Ｐ 作 ａ 胶 单 产提 高 的限制 因子 ， 在世 界 各 橡胶 种 植 园普 遍 发 生 ，对 橡 胶种 植 业 危 害很 大 。 橡胶 树 死 皮病 发生 时 ，割 线 的局 部 或 全 部乳 管 堵塞 ，排 胶 量大 大 减 少甚 至 停排 ，严 重 时树 皮 产 生褐 色 斑 点 、斑
ＤＥ ＮＧ ｈ ’ ＺＨＡＮＧ ｎ Ｘｉ２ ＣＨＥＮ ｕ — ｕ ， Ｚ ｉ ， Ｙｕ — ａ ， Ｃｈ ｎ Ｌｉ ＣＨＥＮ ｈ ｕ Ｃａ Ｓ ｏ — ｉ，
Ｒ ｂ ｅ ｅｅ ｒｈＩｓｉ ｔ， ｈｎ ｓ ａ ｅ ｙｏ ｏ ｉａ ｇｉｕｔｒｌ ｃｅｃ ｓＫ ｙＬ ｂ ｒｔｒ ｕｔ ａｉｎＰ ｙｉｌｇ ｒ ｕ ｂ ｒ ｓａｃ ｔｕｅ Ｃ ｉｅｅ Ｒ ｎ ｔ Ａｃｄ ｍ Ｔ ｐｃ ｌ ｒ ｌ ａ ｉｎ ｅ， ｅ ａ ｏ ａｏｙｏ Ｃ ｌｖ ｔ ｈ ｓ ｏｙ ｏ ｆ ｒ Ａ ｃ ｕ Ｓ ｆ ｉ ｏ ｏ ｆ Ｔｏ ｉ ｌ ｒｐ 。 ｎｓｒ Ａ ｒ ｕｔｒｌ ｎｈ ｕ Ｈａｎｎ５ ｌ３ ．Ｃ ｉ ；Ｓａ Ｒ ｏ ｉｃｅ ｓｒ Ｈａｎ ｎ ｄｃ ｌ ｏｌ ｅ ｒ ｃ ｏ ｓＭｉｉ ｙ ｏ ｇ ｉ ｌ ａ， ｚｏ ． ｉａ ７ ７ ｈｎ ２ｔｆ ｏ ｍ ｏ Ｂ ｏｈｍｉ ｙ ｐ ａＣ ｔ ｆ ｃ ｕ Ｄａ ７ ａ ｆ ｆ ｔ ， ｉ ｉ ｌｇ ． ａ Ｍｅ ａ Ｃ ｅ
植物生理学通讯 第 ４ ３卷 第 ６期 ，２ ０ ０ ７年 １ ２月
１３ ０１
采用酵母双杂交法筛选 Ｈ Ｍｙ ｌ ｂ ｂ 相互作用蛋 白
邓 治 ，张云 霞 ，陈春柳 ，陈守才 ，
中国热带农业 科学 院橡 胶研究 所 ，农业部热 带作物 栽培生理 学重 点实验室 ，海 南儋州 ５ １ ３ ； 海南 医学 院生物化 ７ ７ ７
为 未 知 蛋 白。
关键词 ：巴西橡胶树 ；死皮 病；Ｈｂ ｂ ；酵母双 杂交 Ｍｙ １
Ｓ ｒ ｅ ｉ ｆ ｈ ｏ ｅｎＩ ｔ ｒ ｃｉ ｎｗｉｈＨｂ ｙ ｉ ｇＹ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｎｇｏ ｅＰｒ ｔｉ ｎ ｅ ａ ｔ ｔ Ｍ ｂｌＵｓｎ ａ ｔ ｔ ｏ Ｔｗｏ ｈ ｂ ｉ ・ ｙ ｒｄ Ｓ ｓｅ ｙ ｔｍ
然 有 限 。 本 文 利 用 酵 母 双 杂 交 技 术 ， 寻 找 与 Ｈｂ ｙ １相 互 作 用 的橡 胶 树 胶 乳 相 关 蛋 白分 子 ， Ｍ ｂ 为进 一步 查 ｆＨｂ ｂ 的生物 学功 能和 阐 明其 在橡 １ Ｍｙ ｌ ） ￣ 胶 树 体 内 的作 用 机 制 提 供 参 考 。