酵母双杂交

lacZ β-半乳糖苷酶 蓝色
-Trp/-Leu培养基
-Trp/-Leu/+X-gal培养基
5.序列分析 •从酵母中分离质粒然后转化E. coli •从大肠杆菌中提取质粒并测序 •在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性
酵母双杂交系统的应用
•分析、验证已知蛋白之间的相互作用 •确定蛋白质特异相互作用的关键结构域和氨基酸 •筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白 质 •绘制蛋白质相互作用系统图谱 •在药物设计中的应用
常见问题
•2.如果诱饵蛋白DBD-X能直接激活报告基因的表达，该如 何处理？ •该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。可以通过 基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活， 但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。
常见问题
•3.转化效率太低怎么办？ •可以采用以下方法解决： 1) 检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯 化。 2) DNA-BD很可能是有毒的。 3) 不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。 4) 共转化或者单独转化
常见问题
•4.杂交效率不高，该如何处理？ •在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱 饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆 进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进 行计数。密度应该在1 x 109/ml。 一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。使用表达水 平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。 但同时必须作杂交对照实验。
酵母双杂交
学 生 ： Q XCR 专 业 ： @ @@@ 学 号 ： * ************
酵母的特性
•酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） •真核生物的大肠杆菌 •基因组小
•有典型的真核生物的转录后修饰过程
•一个酵母可同时兼容几个不同质粒（带有2μm复制子）
酵母双杂交系统 Yeast two-hybrid system
P
AD
AD
LEU2
DBD P
Y
TFra Baidu bibliotek
3.转化筛选
Promoter 启动子
Terminator 终止子
X
X
Y
DBD
DBD
AD
酵缺 母陷 菌型 第一次转化 -Trp培养基 筛选 第二次转化 -Trp/-Leu培养基 筛选
4.检测——蓝白斑
激活转录 UAS 上游激活序列 报告基因 lacZ 表达 X-gal 白色
•敏感性高
常见问题
•1.如果DBD-X对酵母细胞是有毒的，该怎么办？ •某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固 体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp， 接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板，在30℃ 下温浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5×YPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样 就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。
•6.除了在酵母中应用外，双杂交体系也已扩展到哺乳动 物细胞。
改进
•7. 构建Sos 恢复系统(Sos recruitment system,SRS). •人的鸟苷酸交换因子（GEF）-Sos 蛋白是一种胞质蛋白， 而酵母的鸟苷酸交换因子-cdc25 蛋白定位在内膜上，可 将相关受体信号传导给Ras 蛋白。 •酵母细胞的一种温度敏感菌株-ras途径突变体由于缺乏 鸟苷酸交换因子cdc25，致使该酵母突变体在36 ℃不能 存活，如果引入正常的GEF(Sos 蛋白)，并且使得GEF 能 与Ras 蛋白足够接近，则可以弥补这一缺陷. •将GEF蛋白与蛋白质X融合，将蛋白质Y与Ras相连，使Y 定位于膜上. 这样，若X 与Y 结合，X 连同的蛋白(GEF)就 会定位于膜上，从而得以靠近膜上的Ras 蛋白，激活ras 途径，完成Sos 过程，在36℃生长。
酵母双杂交系统的优点
•根据目标蛋白的基因序列 即可筛选与其作用的目的蛋白， 不需分离靶蛋白 •蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相 互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合 也可被检测出来，真实反应体内蛋白质间相互作用情况
•可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断 目的蛋白的结构和功能。
推荐了解
•酵母单杂交体系 •反向酵母双杂交系统 •酵母三杂交系统
谢谢！
UAS 上游激活序列
报告基因 lacZ β-半乳糖苷酶基因
2.构建载体
用X的cDNA构建DBD-X穿梭表达载体
酵母细胞 复制起始点
用Y的cDNA构建AD-Y穿梭表达载体
酵母细胞 复制起始点
Ampr
2μ ori
Ampr
2μ ori
X
Y
Terminator 终止子
T X
DBD
TRP1
Promoter 启动子
•3.用于双杂交筛选的文库
◦ ◦ ◦ ◦ 应有代表每一基因的足够丰富的多样性 提供尽可能多地与AD连接位点 插入片段不能过大，否则因为非特异结合所导致的假阳性增多 选用更适宜的限制性内切酶以构建适用于双杂交体系的文库是综 合提高双杂交技术的一个重要方面。
改进
•4.利用酵母交配（yeast mating）可以很方便地将两种不 同的质粒转入同一酵母菌株。据此已发展出一套快速鉴 定假阳性的方法。 •5.体内进行的双杂交检测往往需要体外的其他方法来验 证。
•虽然双杂交系统可筛选出大量蛋白质相互作用，但其中 部分蛋白质可能处于不同的细胞类型、细胞空间或生长 发育的不同时期，生理状态下是不可能发生相互作用的。 因此，对于筛选对象和范围，应有一个合适的选择。
改进
•1.发展酵母菌株的多重筛选机制 •2.表达载体的构建
◦ 可被诱导的启动子 ◦ DBD或AD与作用蛋白质的连接方式
X DBD-X 融合蛋白 DBD Y
Y
AD-Y AD 融合蛋白
AD
报告基因产物 激活转录 构建 表达
UAS 上游激活序列
报告基因 即：DBD-X为诱饵蛋白，AD-Y为猎物蛋白
一般步骤
1.改造酵母
使用特定的营养缺陷型菌株 例：Trp与Leu缺陷型，即酵母菌自身不能合成Trp和Leu，需 要从培养基中吸收Trp和Leu。
GAL4激活转录过程
GAL4转录激活因子基因 转录翻译GAL4
DNA binding domain DBD AD Activating domain 转录激活结构域 结合结构域
Gene
DBD AD
激活转录
UAS 上游激活序列
AD
激活转录
DBD
设计思路
蛋白 构建 DBD X AD Y 是否相互作用？
•1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质 相互作用的方法。 •以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。
转录激活因子GAL4的特点
•N端含有核定位序列（NLS）和与酵母GAL1基因启动子上 游激活序列(UAS)相结合的DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD) •C端含转录激活结构域 (activating domain, AD) •功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在 一起才具有完整的转录因子活性
酵母双杂交系统的局限性
•表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符， 造成结果的不准确 •假阳性，本身就具有转录激活活性的目标蛋白不适合于 该系统 •并非对所有蛋白质适用，不能定位于核内的兴趣蛋白不 适合于该系统 •需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统
酵母双杂交系统的局限性
•大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株 生长及报告基因的表型 •在某些酵母菌株中。为了抑制背景表达而在培养基中添 加的3-AT也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的 相互作用可能会因此而被掩盖