微生物学实验报告——双歧杆菌分离
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作双歧杆菌（Lactobacillus）是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛存在于人体的肠道、口腔、阴道等部位，对人体具有重要的生理功能和健康益处。
在实验室中，通过培养双歧杆菌，我们可以进一步研究它的特性、代谢途径、功能以及应用价值。
以下是一个关于双歧杆菌实验操作的示例，包括菌株的分离、培养、保存和鉴定等步骤。
1.菌株的分离和纯化从人体标本或商业产品中获得含有双歧杆菌的样品，例如：粪便、口腔漱口水、乳制品等。
将样品悬浮于无菌PBS（磷酸盐缓冲溶液）中，并进行10倍序列稀释。
将适量的悬浮液均匀涂布在含有适宜培养温度和营养成分的琼脂平板上。
经过孵育后，从单个菌落中刺取分离得到的单菌株。
2.菌株的培养将分离得到的单菌株接种到含有适宜培养基（如MRS培养基）的液体培养物中。
培养条件包括适宜的温度（通常在30-37℃之间）、PH值和氧气供应等。
静态培养通常在试管中进行，而摇床培养则需提供常规的摇床条件。
3.菌株的保存为了长期保存双歧杆菌菌株，常常采用冷冻保存和干燥保存。
其中，冷冻保存利用甘油或液氮冷冻对菌株进行保藏。
干燥保存是将菌株培养物在适当的保护剂（如蔗糖、蛋白质）的作用下，通过真空或喷雾冻干处理。
冷冻保存要求贮存于低温（-70℃至-80℃）环境中，而干燥保存则可在室温下进行。
4.菌株的鉴定确定菌株是双歧杆菌的一种，需要通过鉴定方法进行确认。
传统的鉴定方法包括菌落形态观察、革兰氏染色、形态学特征、生理和生化试验等。
另外，分子生物学技术也可以用于鉴定双歧杆菌，如PCR扩增特定的双歧杆菌基因片段或测序分析菌株的16SrRNA基因序列。
5.功能研究在鉴定菌株后，可以进一步研究双歧杆菌的功能特性和代谢途径。
例如，可以采用培养基成分和环境参数的调整来研究双歧杆菌的生长条件。
也可以评估双歧杆菌在产生保健益生素、抑制致病菌、增强免疫等方面的功能。
总结：通过以上的实验操作，可以实现对双歧杆菌菌株的分离、培养、保存和鉴定。
食品微生物学检验 双歧杆菌检验
食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验1 范围本标准规定了食品用双歧杆菌（Bifidobacterium）的鉴定及计数方法。
本标准适用于食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。
本标准适用于食品中仅含有单一的双歧杆菌菌种的鉴定；以及食品中仅含有双歧杆菌属的计数，双歧杆菌属可包含一种或多种不同的双歧杆菌菌种。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 天平：感量0.1 g。
2.4 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
2.5 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及配套吸头。
2.6 无菌培养皿：直径90 mm。
3 培养基和试剂3.1 双歧杆菌培养基：见附录A.1。
3.2 PYG培养基：见附录A.2。
3.3 甲醇：分析纯。
3.4 三氯甲烷：分析纯。
3.5 冰乙酸：分析纯。
3.6 乳酸：分析纯。
3.7 乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。
3.8 乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。
4 检验程序双歧杆菌的检验程序见图1。
图1 双歧杆菌的检验程序5 操作步骤5.1无菌要求：全部操作均应遵循无菌操作程序。
5.2 食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数5.2.1 鉴定5.2.1.1 接种：半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板。
真空冷冻干燥菌种，先加适量灭菌生理盐水，溶解菌粉，然后接种在双歧杆菌琼脂平板。
平板在36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。
5.2.1.2 涂片镜检：双歧杆菌为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢、无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究乌云;刘红霞;李洪亮;母智深【摘要】为丰富发酵剂及益生菌菌种资源,从内蒙古阿拉善盟采集7份新生婴儿粪便样品,在传统细菌分离方法的基础上,通过添加莫匹罗星锂盐和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)改良基础培养基,快速有效地分离获得双歧杆菌.结合全自动微生物分析系统和API20A试剂条鉴定菌种.结果共分离获得6株双歧杆菌,其中3株动物双歧杆菌,2株青春双歧杆菌,1株短双歧杆菌.试验验证甘油浓度为70%时冷冻保藏效果最佳.%In order to enrich more types of leavening agents and probiotics resources, faeces collected from sev-en infants(Alashan, Inner Mongolia) were investigated. On the basis of traditional bacterial separation method, Mupirocin lithium salt and X-Gal were added to the basic medium, to separate the bifidobacterium effectively. Automatic microorganism analytical system and API20A reagent strip were applied to identify the bifidobacteri-um. In total, six strains of bifidobacterium were obtained from infacts' faeces, among which three strains were Bifidobacterium lactis, two strains were Bifidobacterium adolescentis, and one strain was Bifidobacterium breve, and the optimum storage condition for the bifidobacterium is 70%glycerol.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)023【总页数】6页(P171-176)【关键词】双歧杆菌;全自动微生物分析系统;API20A试剂条;冷冻保藏【作者】乌云;刘红霞;李洪亮;母智深【作者单位】内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500【正文语种】中文双歧杆菌是存在于人体肠道中的益生菌，在长期进化过程中与宿主形成了互惠共存的关系，具有改善肠道健康、增强免疫功能、防治便秘腹泻、缓解乳糖不耐、促进营养物质吸收、降三高和抗肿瘤等多种保健功能[1-4]。
双歧杆菌的分离与鉴定_吴拥军
作者单位:贵州农学院食品科学系 贵阳 550025 中国收稿日期:1997-01-03双歧杆菌的分离与鉴定吴拥军 王嘉福 尹峻峰摘 要 研究了适宜的双歧杆菌分离方法,从婴儿、成人粪便中分离到36株疑似双歧杆菌,经过属和种的系统生化鉴定,确认为青春双歧杆菌(B if idobacterium adoles -centis )20株和长双歧杆菌(Bif idobacterium longum )6株。
关键词 双歧杆菌 分离 鉴定 双歧杆菌是人类肠道正常菌群中一种重要的微生物,它有益于健康的原因被逐渐弄清。
它以生成醋酸为主,同时生成乳酸和少量的甲酸,在肠道中造成低pH 环境,抑制肠道中有害菌和致病菌的生长[1]。
双歧杆菌不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐,其代谢产物可抑制肠道中的硝酸盐还原细菌,可消除或显著减少亚硝酸盐致癌物质对人体的危害,并能合成多种维生素,促使酪蛋白消化,调节菌群失调,激活吞噬细胞活性,消除自由基、过氧化脂质及腐败菌产生的吲哚胺、氨、硫化氢有害物质[6]。
双歧杆菌为专性厌氧菌,对营养条件要求很高,对低pH 的抵抗能力极差,活性保持比较困难。
目前文献报道的方法[2][3][6]大多需要较高的实验条件或重复性差。
因此,研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 样品 分离样品采自贵阳地区婴儿、成人的粪便。
1.1.2 培养基分离培养基(%):蛋白胨2.0,酵母浸膏粉0.25,葡萄糖0.5,磷酸氢二钠0.25,氯化钠0.5,硫代乙醇酸钠0.1,L -半胱氨酸0.1,天冬氨酸0.01,重铬酸钾0.2,琼脂 1.5,牛肉汤50ml,肝汤50ml 。
调至p H7.5,0.7×105Pa 灭菌20min,冷至55℃加入5%～6%的无菌兔血或羊血制成培养皿平板。
增殖、纯化培养基:参照 1.2.1(不加兔血或羊血)。
糖发酵培养基(%):氯化钠0.5,蛋白胨 1.0,酵母浸膏0.25,硫代醇酸钠0.1,20%糖溶液 5.0m l,调节pH7.5,1kg /cm 2,30min 。
双歧杆菌的分类鉴定
双歧杆菌的分类鉴定双歧杆菌是一种常见的乳酸细菌，具有很多种类，其分类鉴定过程是微生物学中一个重要的部分。
下面将按照流程分步骤阐述双歧杆菌的分类鉴定。
第一步：样本收集首先，需要从目标样品中收集双歧杆菌。
样品可以来自不同的来源，包括人体肠道、动物肠道、泥土、水样等。
在收集样品时，要严格按照规定的方法进行，避免污染和杂质的干扰。
第二步：预处理样品收集到的样品可能包含大量杂质和其他微生物。
因此，在进行分类鉴定之前，必须对样品进行预处理。
处理过程中，需要对样品进行消毒、滤液、大肠杆菌的去除等。
只有经过预处理后的样品才能进行后续的分类鉴定工作。
第三步：菌落分离通过培养，将目标微生物分离出单个菌落。
在分离时要保证菌落的纯度，尽可能地去除其他细菌的干扰。
为了提高鉴定的准确性，建议在分离时同时留取多个单克隆，每一个都应该经过相同的操作来验证。
第四步：生理生化特性判定生理生化特性是鉴定双歧杆菌的关键部分。
常见的生理生化特性包括菌种的形态特征、代谢途径、对培养基的需求等。
对菌落气味、颜色和形态等方面进行观察，测量它们的生长特性。
这一步是识别双歧杆菌是否出现新物种的关键所在。
第五步：分子生物学检测为了提高鉴定的准确性，建议在第四步生理生化特性判定后进行分子生物学检测。
这包括测序、PCR等操作。
通过这些操作可进一步鉴定目标细菌的种类、品种。
在这一步中借助了现代的科研技术，为双歧杆菌的分类鉴定提供了非常有力的支持和助力。
综上所述，双歧杆菌的分类鉴定涉及许多步骤，包括样品的收集和预处理、分离菌落、生理生化特性分析和分子生物学检测等。
这一过程需要技术经验和实验操作配合，具有较高的技术难度和风险性。
只有通过严格流程的操作和准确安排，才能确保双歧杆菌的分类鉴定具有科学性、合法性和完整性。
双歧杆菌的分离与培养_秦玲玲
B 3种碳源质量比
1︰1︰1 1︰1︰2 1︰2︰1 2︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3 0.5 0.7 0.9
注：4种氮源比例为：m（大豆蛋白胨）︰m（胰蛋白胨）︰m（酪蛋白水解物）︰m（牛肉浸膏）； 3种碳源比例为：m（葡萄糖）︰m（异麦芽糖）︰m（乳糖）。
2 结果
2.1 菌落与菌体形态特征 含有双歧杆菌的酸奶制品，经过系列稀释、涂布、分离纯
固定维生素、矿物质、L-半胱氨酸、吐温-80的用量，采用正交实验设计(L16(43))优化氮源（A）、碳源 （B）和酵母浸出粉（C）的用量，因素水平见表1。
表1 基础培养基优化正交实验因素水平表(L16(43))
水平
1 2 3 4
A 4种氮源质量比
1︰1︰1︰2 1︰1︰2︰1 1︰2︰1︰1 2︰1︰1︰1
双歧杆菌只生长在接种的穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性。
2.4 生长曲线的绘制
单一菌株的生长曲线如图 5 所示。
由图 5 可知，12 h 之前菌体数量大量增长，12 h 时达到对数生长期，随后菌体数量基本保持不变。 OD 值虽然不能直接准确地反映活菌数，但是可以大 致反映菌液中菌体的多少、菌液的浓度。OD 值越大 表明菌液中菌体含量越多。 2.5 培养基的优化
1︰1︰1
0.5
1.892
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌的分离与鉴定一、实验背景双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。
双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。
双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。
因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。
二、实验步骤（一）材料1、分离源母乳喂养的健康婴儿粪便2、培养基和试剂TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红液）、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠）、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺）、双蒸水、TaKaRa Taq、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。
（二）实验内容1、样品的采集与处理（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成1∶10 的均匀稀释液。
另取1 mL 灭菌的移液管吸取1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1∶100 的均匀稀释液。
按上述操作顺序，依次做成1×10- 3～1×10- 7 梯度的均匀稀释液。
（2）分别取1×10- 1~1×10- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验），37℃厌氧培养24~48h观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌的分离与鉴定一、实验背景双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。
双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。
双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。
因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。
二、实验步骤（一）材料1、分离源母乳喂养的健康婴儿粪便2、培养基和试剂TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红液）、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠）、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺）、双蒸水、TaKaRa Taq、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。
（二）实验内容1、样品的采集与处理（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成1∶10 的均匀稀释液。
另取1 mL 灭菌的移液管吸取1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1∶100 的均匀稀释液。
按上述操作顺序，依次做成1×10- 3～1×10- 7 梯度的均匀稀释液。
（2）分别取1×10- 1~1×10- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验），37℃厌氧培养24~48h观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。
实验方案(双歧杆菌的分离)
1双歧杆菌的分离1.1样品取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。
1.2培养基根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。
选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。
1.2.1缓冲蛋白胨水溶液（BP）成份：蛋白胨10gA磷酸氢二钠2g葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g氯化钠5g 蒸馏水1000ml制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121°C，杀菌15min后置4°C的冰箱中备用。
1.2.2选择性改良NPNL培养基（苏世彦）成份：酵母膏5g淀粉0.5g蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g胰蛋白胨5g溶液A10ml大豆蛋白胨5g溶液B5ml葡萄糖10g溶液C50ml乳糖3g琼脂A15g吐温801g pH7.2牛肝提取液150ml制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121C杀菌10min，备用。
溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g 溶于蒸馏水100ml。
溶液B：FeSO ・7H O 0.2g、MgSO ・7H O 4g、MnSO ・4H O4 2 8^42$ 4 20.135g、NaCl 0.2g 溶于蒸馏水100ml。
溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。
1.2.3 NPNL培养基（孙雪）培养基成分及用量：牛肉浸汁粉（oxoid）3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，植胨3g,酵母浸出汁5g,肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml,溶液B 5ml,吐温80 1g,盐酸半胱氨酸0.5g, 琼脂15g，蒸馏水815ml, X-Gal（5-漠-4-氯-3』引噪-。
-D-半乳糖苷）60mg。
pH 7.2, 121 °C, 15min 高压灭菌。
溶液A：K2HPO4 25g, KH2PO4 25g，蒸馏水250ml。
双歧杆菌检验(食品微生物学检验)
食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验1范围本标准规定了双歧杆菌(B i f i d o b a c t e r i u m)的鉴定及计数方法㊂本标准适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数㊂本标准适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种鉴定㊂本标准适用于食品中仅含有双歧杆菌属的计数,即食品中可包含一个或多个不同的双歧杆菌菌种㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂2.2冰箱:2ħ~5ħ㊂2.3天平:感量0.01g㊂2.4无菌试管:18mmˑ180mm㊁15mmˑ100mm㊂2.5无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器(200μL~1000μL)及配套吸头㊂2.6无菌培养皿:直径90mm㊂3培养基和试剂3.1双歧杆菌培养基:见A.1㊂3.2 P Y G培养基:见A.2㊂3.3 M R S培养基:见A.3㊂3.4甲醇:分析纯㊂3.5三氯甲烷:分析纯㊂3.6硫酸:分析纯㊂3.7冰乙酸:分析纯㊂3.8乳酸:分析纯㊂4检验程序双歧杆菌的检验程序见图1㊂图1双歧杆菌的检验程序5操作步骤5.1无菌要求全部操作过程均应遵循无菌操作程序㊂5.2双歧杆菌的鉴定5.2.1纯菌菌种5.2.1.1样品处理:半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂固体菌种或真空冷冻干燥菌种,可先加适量灭菌生理盐水或其他适宜稀释液,溶解菌粉㊂5.2.1.2接种:接种于双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂5.2.2食品样品5.2.2.1样品处理:取样25.0g(m L),置于装有225.0m L生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ10的样品匀液㊂冷冻样品可先使其在2ħ~5ħ条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45ħ的条件解冻,时间不超过15m i n㊂5.2.2.2接种或涂布:将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板,或取0.1m L适当稀释度的样品匀液均匀涂布在双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂5.2.2.3纯培养:挑取3个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板或M R S琼脂平板㊂36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂5.2.3菌种鉴定5.2.3.1涂片镜检:挑取双歧杆菌平板或M R S平板上生长的双歧杆菌单个菌落进行染色㊂双歧杆菌为革兰氏染色阳性,呈短杆状㊁纤细杆状或球形,可形成各种分支或分叉等多形态,不抗酸,无芽孢,无动力㊂5.2.3.2生化鉴定:挑取双歧杆菌平板或M R S平板上生长的双歧杆菌单个菌落,进行生化反应检测㊂过氧化氢酶试验为阴性㊂双歧杆菌的主要生化反应见表1㊂可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统㊂表1双歧杆菌菌种主要生化反应编号项目两歧双歧杆菌(B.b i f i d u m)婴儿双歧杆菌(B.i n f a n t i s)长双歧杆菌(B.l o n g u m)青春双歧杆菌(B.a d o l e s c e n t i s)动物双歧杆菌(B.a n i m a l i s)短双歧杆菌(B.b r e v e)1L-阿拉伯糖--+++-2D-核糖-+++++ 3D-木糖-++d++ 4L-木糖------5阿东醇------6D-半乳糖d+++d+ 7D-葡萄糖++++++ 8D-果糖d++d d+ 9D-甘露糖-++---10L-山梨糖------表1(续)编号项目两歧双歧杆菌(B.b i f i d u m)婴儿双歧杆菌(B.i n f a n t i s)长双歧杆菌(B.l o n g u m)青春双歧杆菌(B.a d o l e s c e n t i s)动物双歧杆菌(B.a n i m a l i s)短双歧杆菌(B.b r e v e)11L-鼠李糖------12卫矛醇------13肌醇-----+ 14甘露醇----a--a 15山梨醇----a--a 16α-甲基-D-葡萄糖甙--+---17N-乙酰-葡萄糖胺-----+ 18苦杏仁甙(扁桃甙)---++-19七叶灵--+++-20水杨甙(柳醇)-+-++-21D-纤维二糖-+-d--22D-麦芽糖-+++++ 23D-乳糖++++++ 24D-蜜二糖-+++++ 25D-蔗糖-+++++ 26D-海藻糖(覃糖)------27菊糖(菊根粉)--a--a--a 28D-松三糖--++--29D-棉籽糖-+++++ 30淀粉---+--31肝糖(糖原)------32龙胆二糖-+-+++ 33葡萄糖酸钠---+--注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性;d表示11%~89%以上菌株阳性;a表示某些菌株阳性㊂5.2.3.3有机酸测定:测定双歧杆菌的有机酸代谢产物(可选项),见附录B㊂5.3双歧杆菌的计数5.3.1纯菌菌种5.3.1.1固体和半固体样品的制备:以无菌操作称取2.0g样品,置于盛有198.0m L稀释液的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或置于盛有198.0m L稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ100的样品匀液㊂5.3.1.2液体样品的制备:以无菌操作量取1.0m L样品,置于9.0m L稀释液中,混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂5.3.2食品样品5.3.2.1样品处理:取样25.0g(m L),置于装有225.0m L生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ10的样品匀液㊂冷冻样品可先使其在2ħ~5ħ条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45ħ的条件解冻,时间不超过15m i n㊂5.3.3系列稀释及培养用1m L无菌吸管或微量移液器,制备10倍系列稀释样品匀液,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n㊂每递增稀释一次,即换用1次1m L灭菌吸管或吸头㊂根据对样品浓度的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递增稀释时,吸取1.0m L样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂同时,分别吸取1.0m L空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照㊂及时将15m L~20m L冷却至46ħ的双歧杆菌琼脂培养基或MR S琼脂培养基(可放置于46ħʃ1ħ恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n内完成㊂待琼脂凝固后,将平板翻转,36ħʃ1ħ厌氧培养48hʃ2h,可延长至72hʃ2h㊂培养后计数平板上的所有菌落数㊂5.3.4菌落计数5.3.4.1可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量㊂菌落计数以菌落形成单位(c o l o n y-f o r m i n g u n i t s,C F U)表示㊂5.3.4.2选取菌落数在30C F U~300C F U之间㊁无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数㊂低于30C F U 的平板记录具体菌落数,大于300C F U的可记录为多不可计㊂每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数㊂5.3.4.3其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数㊂5.3.4.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数㊂5.3.5结果的表述5.3.5.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果㊂5.3.5.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:N= C(n1+0.1n2)d (1)式中:N 样品中菌落数;C 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂5.3.5.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300C F U,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算㊂5.3.5.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30C F U,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂5.3.5.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算㊂5.3.5.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30C F U~300C F U之间,其中一部分小于30C F U或大于300C F U时,则以最接近30C F U或300C F U的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂5.3.6菌落数的报告5.3.6.1菌落数小于100C F U时,按 四舍五入 原则修约,以整数报告㊂5.3.6.2菌落数大于或等于100C F U时,第3位数字采用 四舍五入 原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按 四舍五入 原则修约后,采用两位有效数字㊂5.3.6.3称重取样以C F U/g为单位报告,体积取样以C F U/m L为单位报告㊂5.4结果与报告根据5.2.3.1㊁5.2.3.2,5.2.3.3结果,报告双歧杆菌属的种名㊂根据5.3.6菌落计数结果出具报告,报告单位以C F U/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.1双歧杆菌琼脂培养基A.1.1成分蛋白胨15.0g酵母浸膏2.0g葡萄糖20.0g可溶性淀粉0.5g氯化钠5.0g西红柿浸出液400.0m L吐温801.0m L肝粉0.3g琼脂粉20.0g加蒸馏水至1000.0m LA.1.2制法A.1.2.1半胱氨酸盐溶液的配制:称取半胱氨酸0.5g,加入1.0m L盐酸,使半胱氨酸全部溶解,配制成半胱氨酸盐溶液㊂A.1.2.2西红柿浸出液的制备:将新鲜的西红柿洗净后称重切碎,加等量的蒸馏水在100ħ水浴中加热,搅拌90m i n,然后用纱布过滤,校正p H7.0ʃ0.1,将浸出液分装后,121ħ高压灭菌15m i n~ 20m i n㊂A.1.2.3制法:将A.1.1所有成分加入蒸馏水中,加热溶解,然后加入半胱氨酸盐溶液,校正p H至6.8ʃ0.1㊂分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.2P Y G液体培养基A.2.1成分蛋白胨10.0g葡萄糖2.5g酵母粉5.0g半胱氨酸-H C l 0.25g盐溶液20.0m L维生素K1溶液0.5m L氯化血红素溶液5m g/m L2.5m L加蒸馏水至500.0m LA.2.2制法A.2.2.1盐溶液的配制:称取无水氯化钙0.2g,硫酸镁0.2g,磷酸氢二钾1.0g,磷酸二氢钾1.0g,碳酸。
双歧杆菌分离培养鉴定
双歧杆菌的分离、培养及鉴定一实验目的1 掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。
2 观察双歧杆菌的形态特征并了解双歧杆菌的生长特性。
3了解双歧杆菌鉴定的一般方法。
二基本原理厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。
双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。
初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生长。
其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。
双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。
该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。
该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。
双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。
这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。
本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
肠道微生物的分离与鉴定方法
肠道微⽣物的分离与鉴定⽅法⼀、有益菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽孢杆菌（枯草、地⾐）。
5种有害菌：⼤肠杆菌，沙门⽒菌，产⽓荚膜梭菌，空肠弯曲杆菌。
4种⼆、厌氧菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，产⽓荚膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。
5种需氧菌：芽孢杆菌。
1种兼性厌氧菌：⼤肠杆菌，沙门⽒菌。
2种注：境中⽣长最好。
最适温度为37～42℃。
在正常⼤⽓或⽆氧环境中均不能⽣长。
肠道正常菌群中95%以上为专性厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧菌在正常菌群中所占⽐例较少。
三、⼀般检测菌株包括厌氧菌中的双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌、消化性球菌、乳杆菌及梭菌。
需氧菌中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌，及酵母菌等。
四、⽆氧环境的简易操作：1、⽅法来⾃⽂献《健康⽺驼粪球中主要正常菌群的分离与初步鉴定》采⽤⼲燥器培养，1m3空间⽤焦性没⾷⼦酸10g、10%氢氧化钠溶液l00mL，按⽐例取10%的氢氧化钠液置于⼲燥器⽫底部，然后放置2到3个略⾼于液⾯的青霉素⼩瓶，再按⽐例称取焦性没⾷⼦酸⽤纸包好，放在圆柱上。
继⽽放上隔板,将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放美蓝指⽰剂⼀管。
盖上缸盖并⽤⽯蜡封闭。
再轻轻摇动⼲燥器，使焦性没⾷⼦酸掉⼈氢氧化钠液中，反应后，⼲燥器内⽆氧，美蓝指⽰剂由蓝变⽩。
置于温箱37℃培养24⼀48h观察结果。
2、⽅法来⾃⽂献《健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析》后者先拧紧瓶盖,放⼊密封性较好的玻璃罐(⽤凡⼠林封⼝)，通过蜡烛燃烧法制作简易厌氧装置。
五、CO2培养箱不可代替⽆氧培养箱厌氧箱⼀般是组合⽓体90%氮⽓+5%氢⽓+5%⼆氧化碳，厌氧箱⾥⾯培养的微⽣物都是厌氧微⽣物；⽽⼆氧化碳培养箱⾥⾯是5%⼆氧化碳+95%空⽓，⾥⾯是有⼀部分氧⽓的。
⼀般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中O2的浓度必须⼩于1000ppm（千分之⼀），更严格的环境是⼩于300ppm（万分之三），本实验室CO2培养箱CO2浓度范围为280-2000ppm，所以CO2培养箱是不能⽤来培养严格厌氧菌。
人源双歧杆菌的分离纯化及鉴定_熊强
生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering
doi：10． 3969 / j． issn． 1672 － 3678． 2013． 06． 008
人源双歧杆菌的分离纯化及鉴定
熊 强，杨青丽，韩 浩
（ 南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 211800）
表 2 利用 Biolog 自动微生物分析系统进行菌株鉴定的结果 Table 2 Ｒesults of the Biolog automated microbial analysis system on candidate Bifidobacterium
笔者通过在乳酸细菌（MＲS）培养基中添加不同的 物质，选择性抑制一些肠道细菌，并根据双歧杆菌的菌 落形态和色泽达到双歧杆菌快递分离和筛选的目的， 以期为以后的科研和生产构建良好的种质资源基础。
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器 1. 1. 1 试样来源
新鲜粪便：采自南京工业大学的健康学生。
收稿日期：2013 － 01 － 05 基金项目：国家重点基础研究发展计划（973 计划） （2011CB200906） 作者简介：熊 强（1970—） ，男，江苏南京人，副教授，研究方向：微生物与发酵工程，E-mail：xiongqiang@ njut． edu． cn
首先对筛选出的双歧杆菌疑似菌株进行需氧 性鉴定，然后对需氧性鉴定阴性菌株进行接触酶试 验、甲基红试验、吲哚试验、V． P． 试验、硝酸盐还原 试验、明胶 液 化 试 验、脲 酶 试 验，淀 粉 水 解 试 验［7］。 在上述试验的基础上，利用 Biolog 自动微生物分析 系统进行鉴定［8］。
2 结果与讨论
肠道细菌测定实验报告
一、实验目的1. 了解肠道细菌的基本特征及其在人体健康中的作用。
2. 掌握肠道细菌分离、培养和鉴定的基本方法。
3. 学会使用微生物学实验技能，提高实验操作能力。
二、实验原理肠道细菌是一类广泛存在于人体肠道内的微生物，它们在维持人体健康、促进营养吸收、抑制有害菌生长等方面具有重要作用。
本实验通过分离、培养和鉴定肠道细菌，了解其种类和数量，为后续研究肠道细菌与人体健康的关系提供基础数据。
三、实验材料1. 实验仪器：恒温培养箱、高压灭菌锅、无菌操作台、接种环、移液枪、试管、试管架、培养皿、酒精灯等。
2. 实验试剂：肠道细菌分离培养基、营养肉汤、生理盐水、乳酸菌鉴定试剂、革兰氏染色试剂等。
3. 实验样品：人体粪便样本。
四、实验方法1. 样本处理：将粪便样本用生理盐水稀释，制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4四个浓度的稀释液。
2. 分离培养：将稀释液分别接种于肠道细菌分离培养基，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
3. 菌落计数：选取生长良好的菌落，进行革兰氏染色，观察细菌形态，并用计数板计数。
4. 鉴定：根据革兰氏染色结果和菌落形态特征，对分离得到的细菌进行初步鉴定。
五、实验结果1. 菌落计数：在10^-2、10^-3、10^-4浓度稀释液中发现菌落生长，菌落数量分别为3.2×10^8、2.5×10^7、1.8×10^6。
2. 革兰氏染色结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
3. 鉴定结果：根据菌落形态特征和革兰氏染色结果，初步鉴定分离得到的细菌为乳酸菌、大肠杆菌和双歧杆菌。
六、实验讨论1. 肠道细菌在人体健康中具有重要作用，如维持肠道菌群平衡、促进营养吸收、抑制有害菌生长等。
2. 本实验通过分离、培养和鉴定肠道细菌，初步了解了肠道细菌的种类和数量。
3. 在实验过程中，应注意无菌操作，避免污染。
4. 本实验结果可作为后续研究肠道细菌与人体健康关系的参考数据。
动物微生物实践报告
动物微生物实践报告一、实验目的本实验旨在通过实践操作，掌握动物微生物学的基本实验技能，了解动物体内微生态平衡的重要性，以及微生物对动物健康的影响。
二、实验原理动物微生物学是研究动物体内外正常菌群的一门科学，这些微生物在正常情况下对动物是无害的，甚至是有益的。
然而，当这些微生物的数量或种类发生变化时，可能会引发一系列健康问题。
本实验通过采集动物样本，进行微生物分离培养和鉴定，以了解动物体内微生物的分布与数量，评估其健康状况。
三、实验步骤1.实验材料准备：采集动物样本，包括粪便、皮肤、口腔等部位；培养基、显微镜、接种环、恒温培养箱等实验器材。
2.样本处理：将采集的动物样本进行处理，如稀释、搅拌、涂布等，以便于微生物的分离培养。
3.微生物分离培养：将处理后的样本接种于适宜的培养基上，在恒温培养箱中培养一段时间，使微生物生长繁殖。
4.微生物鉴定：观察培养出的微生物的形态、染色、生长情况等特征，结合显微镜观察结果，对微生物进行鉴定。
5.数据记录与分析：记录实验数据，包括微生物的种类、数量、生长情况等，分析微生物在动物体内的分布与数量变化，评估动物健康状况。
四、实验结果与分析经过实验操作，我们成功分离培养出了多种动物体内的微生物，并对其进行了鉴定。
以下是实验结果与分析：1.微生物种类与分布在粪便样本中，我们分离出了大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌等肠道微生物；在皮肤样本中，分离出了葡萄球菌、链球菌等皮肤微生物；在口腔样本中，分离出了口腔链球菌、乳杆菌等口腔微生物。
这些微生物在动物体内具有不同的生态位和生理功能，对维持动物微生态平衡具有重要作用。
2.微生物数量变化通过对不同部位样本中微生物数量的统计，我们发现肠道中的大肠杆菌和肠球菌数量较多，而双歧杆菌数量较少；皮肤上的葡萄球菌和链球菌数量变化较大；口腔中的口腔链球菌和乳杆菌数量相对稳定。
这些数据表明，不同部位的微生物数量存在差异，可能与动物的生理状态和环境因素有关。
双歧杆菌分离培养鉴定
双歧杆菌分离培养鉴定1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 气相色谱仪配FID检测器。
2.3 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.4 天平：感量0.1 g。
2.5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
2.6 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器（200μL～1000μL）及配套吸头。
2.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。
2.8 显微镜2 培养基和试剂3.1 BS培养基3.2 PYG培养基3.3 TPY培养基3.4 NPNL 培养基3.5 X-GAL 培养基3.6 氟化钠：化学纯。
3.7 碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。
3.8 果糖-6-磷酸盐：化学纯。
3.9 盐酸羟胺(Hydroxy Lamine-HCl)：化学纯。
3.10 三氯乙酸(TCA)：化学纯。
3.11 三氯化铁（FeCl3·6H2O）：化学纯。
3.12 甲醇:分析纯。
3.13 三氯甲烷：分析纯。
3.14 硫酸：分析纯。
3.15 冰乙酸：分析纯。
3.16 乳酸：分析纯。
3.17 乙酸标准溶液: 吸取分析纯冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.1,此溶液浓度约为1mol/L。
3.18 乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3.19 乳酸标准溶液: 吸取分析纯乳酸8.4mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.2，此溶液浓度约为1mol/L。
3.20 乳酸标准使用液: 将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3 双歧杆菌的分离和培养在无菌室内无菌称取1g双歧杆菌制剂，根据标示的活菌数量，用灭菌稀释液进行10倍梯度稀释至104-107，然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL琼脂平板上，放于厌氧培养箱内培养48到72小时.然后挑选菌落特征为光华、凸圆、边缘整齐、白色或乳脂色、质地柔软的中小菌落，接种于TPY琼脂平板上厌氧培养。
肠道益生菌分离鉴定及应用研究
肠道益生菌分离鉴定及应用研究一、引言肠道微生物群落对人体健康的重要性日益受到关注，其中益生菌在维持肠道平衡、促进营养吸收和增强免疫功能等方面发挥着关键作用。
肠道益生菌的分离鉴定及应用研究成为了当前微生物学和医学领域的热门课题。
二、肠道益生菌的分离方法（一）样本采集要分离肠道益生菌，首先需要从健康个体的粪便样本中获取。
在采集过程中，需要确保样本的新鲜度和无污染，通常使用无菌容器进行收集。
（二）选择性培养利用特定的培养基来培养肠道微生物。
例如，一些益生菌如双歧杆菌和乳酸菌在特定的营养条件和环境下能够生长，而其他杂菌则受到抑制。
（三）稀释涂布法将样本进行一系列稀释，然后将稀释液均匀涂布在培养基上，以获得单个菌落。
（一）形态学鉴定观察菌落的形态、大小、颜色和边缘特征，以及菌体的形态、大小和排列方式等。
（二）生理生化鉴定检测微生物的代谢产物、酶活性、对不同物质的利用能力等生理生化特性。
（三）分子生物学鉴定通过 PCR 技术扩增特定的基因片段，如 16S rRNA 基因，然后进行测序和比对分析，以确定其种属。
四、常见的肠道益生菌及其功能（一）双歧杆菌能改善肠道微生态平衡，抑制有害菌生长，增强免疫力，还参与维生素的合成和营养物质的吸收。
（二）乳酸菌产生乳酸降低肠道 pH 值，抑制病原菌生长，促进钙、铁等矿物质的吸收。
（三）芽孢杆菌具有较强的抗逆性，能够调节肠道菌群结构，提高机体抗氧化能力。
（一）食品工业广泛应用于酸奶、奶酪、发酵乳等乳制品，以及饮料、保健品等产品中，为消费者提供营养和健康益处。
（二）医药领域用于治疗肠道疾病，如腹泻、便秘、炎症性肠病等。
还可作为辅助治疗手段，增强药物的疗效，减轻药物的副作用。
（三）畜牧业添加到动物饲料中，提高动物的生长性能、免疫力和饲料利用率，减少疾病的发生。
六、肠道益生菌应用的挑战与展望（一）挑战1、益生菌的存活和定植能力在经过胃肠道的复杂环境后，益生菌的存活数量和在肠道内的定植能力是影响其效果的关键因素。
微生物与人类健康实验报告——酸奶中的微生物
实验报告酸奶微生物的检测与计数实验目的：对酸奶中的乳酸菌进行初步分离和计数实验原理：酸奶主要以乳酸菌为发酵剂，乳酸菌是一类可发酵糖类，产生大量乳酸的细菌的通称，主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属及链球菌属等。
典型的乳酸菌是革兰氏阳性菌，兼性厌氧或厌氧，营养要求严格。
酸奶中主要使用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为发酵剂，部分酸奶中还添加有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等益生菌。
中国食品卫生标准规定，酸奶中乳酸菌含量应满足乳酸菌数≥106CFU/g（ml），其中CFU（菌落形成单位）指单位体积中的细菌群落总数，CFU/g指的是每克样品中含有的细菌菌落总数，CFU/ml指的是每毫升样品中含有的细菌菌落总数。
通过稀释涂布平板法，利用MRS培养基，分离得到超市可购酸奶样品中的乳酸菌，以肉眼可见菌落数代表样品活菌数，分析酸奶中乳酸菌含量CFU／g；通过菌落形态的观察，对酸奶中的乳酸菌进行初步分离和计数。
实验材料和用具：1、培养基乳酸细菌培养基（MRS）蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，琼脂15.0--20.0g，蒸馏水1000mL，pH6.2~6.6，121℃，灭菌15min2、样品光明风味发酵乳：添加保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、干酪乳杆菌；乳酸菌数≥ 1×106CFU/g达能碧悠风味发酵乳：添加乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌；乳双歧杆菌数≥4×107CFU/g养乐多：添加干酪乳杆菌，活菌数≥ 1×108CFU/g3、材料无菌1.5mlEP 管、无菌棉棒、mark 笔4、仪器超净工作台、37℃恒温培养箱、高压灭菌锅、电子天平、微量移液器实验方法与步骤：1) 在超净台中，以无菌操作称取0.1g 酸奶样品，至无菌1.5mLEP 管中，以无菌PBS 定容至1ml，以微量移液器轻轻反复吹打，使之充分混匀，制成1:10样品匀液；2) 以微量移液器吸取100uL1:10 样品匀液，转至装有900ul 无菌PBS 的1.5mLEP 管中，以微量移液器轻轻反复吹打，使之充分混匀，制成1:100 样品匀液；3) 根据步骤2)操作顺序，10 倍系列稀释，获得不同稀释度的样品溶液；4) 根据待测酸奶样品的活菌总数，选择2 个连续的适宜稀释度，各以0.1mL 加入到MRS 平板中进行涂布；5) 在MRS 平板上注明组别、样品、稀释度、姓名、日期，每组6 名同学共同完成3 种不同酸奶，各2 个连续稀释度的涂布；6) 于37℃恒温低氧倒置培养48h；7) 观察MRS 培养基表面菌落形态；8) 菌落计数，计算样品中的CFU/g。
微生物学实验报告——双歧杆菌分离
微生物学实验报告乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化2012/6/5实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。
实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。
双歧杆菌的细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。
因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原电势。
培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚管法(1, 5, 7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧罐法等。
亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。
亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术性很强的操作。
本实验采用的简易厌氧罐法是一种操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性没食子酸除去厌氧罐内的氧气。
该方法的缺点是焦性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。
另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。
本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。
如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择性培养基(7)。
双歧杆菌的生长曲线测定及其氧浓度对细胞浓度的影响
菌种数
装液量为9ml试管中细胞数在0-3h双歧杆菌处于衰亡期， 菌种数不断减少从2.7*107-1.1*107CFU/mL.但3h之后菌细 胞处于生长期不断增长。
菌种数*10^7CFU/m L
4 3 2 1 0 0 3 6 9 培养时间/h 12 15 18 菌种数
装液量为11ml试管中细胞数在0h-3h双歧杆菌处于衰亡期， 细胞数不断减少从2.7*107CFU/mL-1.12*107CFU/mL.但3h之 后细胞数处于生长期不断增长。
双歧杆菌的生长曲线测定 及其氧对细胞浓度的影响
班级： 11生物技术1班 学生：陈婷 指导老师：江胜滔
一 .
双歧杆菌的概况
双歧杆菌 (Bifidobacterium)是由法国 学者Henry Tissierz 在1899年从母乳营 养儿的粪便中分离出的一种厌氧的革兰 氏阳性杆菌，末端常常分叉，故名双歧 杆菌。
培养基装液量为13ml的试管最适合菌种生长。
本实验不足：因为实验的时间不够长，不能准确的测到 双歧杆菌的生长情况。而且在实验过程中没有完全消毒， 操作不熟练等易造成实验误差。
谢 谢！
11ml生长曲线图 4 3
菌种数
2 1 0 0h 3h 6h 9h 培养时间 12h 15h 18h
菌种数
装液量为13ml试管中细胞数在0-3h双歧杆菌处于衰亡期， 细胞数不断减少从2.7*107-1.8*107CFU/mL.但3h之后细胞 数处于生长期不断增长。
11ml生长曲线图 4 3
菌种数
3ml生长曲线图 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0h 3h 6h 9h 培养时间 12h 15h 18h 菌种数
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微生物学实验报告乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化2012/6/5实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。
实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。
双歧杆菌的细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。
因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原电势。
培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚管法(1, 5, 7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧罐法等。
亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。
亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术性很强的操作。
本实验采用的简易厌氧罐法是一种操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性没食子酸除去厌氧罐内的氧气。
该方法的缺点是焦性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。
另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。
本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。
如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择性培养基(7)。
实验材料：蒙牛冠益乳（含bb-12双歧杆菌），伊利酸牛奶（ABLS益生菌），佳宝、光明原味酸牛奶，双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（含长型双歧杆菌Bifidobacterium longum），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）实验方法：1.培养基双歧杆菌琼脂培养基【蛋白胨（鱼粉）10.0g，牛肝浸粉5.0g，牛肉膏3.0g，酵母浸粉5.0g，胰蛋白胨8.0g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，葡萄糖10.0g，乳糖3.0g，L-半胱氨酸0.5g，琼脂15g，吐温80 1g，溶液A （FeSO4·7H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 4.0g，MnSO4·4H2O 0.135g，NaCl 0.2g 于100ml蒸馏水定容）10ml，蒸馏水定容至1L】枯草芽孢杆菌LB琼脂培养基【胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，Nacl10g/L，琼脂粉15g/L】2.简易厌氧罐法将双歧杆菌琼脂培养基倒入培养皿中，待培养基冷却后，先用接种环取LB琼脂培养基上生长的枯草芽孢杆菌菌落接种在培养皿一侧，再于另一侧划线接种酸奶或三联活菌片的稀释液，按照每L容积1.0g 焦性没食子酸、10%NaOH溶液10ml加入厌氧罐后，立即以凡士林和胶带密封，置于37℃恒温培养2-3天。
图1. 实验中使用的简易厌氧罐实验结果：以双歧杆菌乳酸菌三联活菌片为菌源，在厌氧罐中经过72h 恒温培养得到了以双歧杆菌为主的单菌落。
因为双歧杆菌暴露在空气中短时间内即大量死亡，划线分离方法会使双歧杆菌活性大大降低，加之时间所限（由于需要摸索实验条件，寻找合适菌源，首次成功得到双歧杆菌单菌落已是第三周），最终没有获得双歧杆菌的纯培养和相关生化指标。
但仅从形态学特征(3)可以判断，该实验方法已经分离得到双歧杆菌（Bifidoubacterium sp.）。
所以本实验仅就双歧杆菌的形态学特征进行观察总结。
图2. 培养72h 后的双歧杆菌分离培养基。
左侧接种枯草杆菌，几乎没有形成明显的菌落；右侧接种三联活菌片稀释液，有大小不等乳白色半透明光滑圆形菌落，偏小的菌落多为双歧杆菌菌落。
图3. 双歧杆菌革兰氏染色照片（1000×），显示双歧杆菌具有多种特殊形态。
此外，视野中有细杆形杂菌。
图4. 局部放大后观察到的双歧杆菌形态。
可以看到双歧杆菌具有分支形态和末端膨大形态，分支长度和角度因个体而异，没有明显的一致性，末端膨大处最大直径约1μm。
图（a）中有“f”形个体，实为细胞中部向两侧分支的细胞。
图（b）下方的细胞分支较多，其中有三个为主要分支，较长的两个分支长度约5μm，在较长的分支上还有小分支。
图片上方有末端分支的细胞。
图（c）和图（d）显示了双歧杆菌典型的“Y”形分支。
一般具有这种典型形态的双歧杆菌细胞长度约3-4μm，分支长度在1μm左右。
实验反思：1. 成功培养双歧杆菌的关键条件之一是要保证菌源中含有足够数量的活双歧杆菌。
实验最初使用的菌源是市售各种品牌的酸牛奶，但是在对酸奶稀释液进行镜检时，所有的产品都没有看到疑似有双歧杆菌特征的细胞。
以蒙牛冠益乳为例，虽然奶盒标签上标明内含双歧杆菌BB-12的浓度不少于1×109CFU/ml，但镜检中发现链球菌的数量占绝大比例，此外还有少量长杆菌。
以蒙牛冠益乳为菌源，分别用涂布平板法和倾注平板法在厌氧罐中培养48h后，菌落经镜检鉴定几乎全部为链球菌菌落，没有发现双歧杆菌菌落，证明所用菌源中链球菌是绝对优势菌群。
以其它品牌酸牛奶为菌源也有类似情况，虽然链球菌和杆菌的比例不同，但都没有发现双歧杆菌。
考虑到当今技术条件下双歧杆菌的发酵培养并不十分困难，任何一家有资质的乳品企业都有能力保证出厂酸奶中双歧杆菌的添加量，而且像蒙牛冠益乳这样具有世界影响力（第十五届世界食品科技大会“全球食品工业奖”）的酸奶品牌应该没有质量问题，因此可以推测，市售酸奶中分离不到双歧杆菌的主要原因是酸奶出厂后在运输和销售途径中保存不当（主要是保存温度偏高），使绝大部分双歧杆菌失去活性。
所以，若要从添加双歧杆菌的酸奶中分离双歧杆菌，需要使用全程低温保鲜的新鲜酸奶。
相对于酸奶，药店中出售的双歧杆菌活菌片的生产和保存更加严格，而且药片的胶囊化也利于厌氧菌的保藏。
以本实验使用的双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（Live Combined Bifidoubacterium and Lactobacillus Tablets）为例,药片中含有三种常见乳酸菌：长型双歧杆菌（1×107CFU/g），保加利亚乳杆菌（1×106CFU/g），嗜热链球菌（1×106CFU/g）。
经厌氧罐法涂布平板37℃恒温培养72h后，分离得到的菌落主要是保加利亚乳杆菌和双歧杆菌菌落（其中保加利亚乳杆菌菌落较多）。
所以用三联活菌药片作为菌源分离双歧杆菌是实际上可行的。
2. 成功培养双歧杆菌的另一个关键条件是要保证培养过程绝对无氧。
首先是接种时操作要尽量迅速，本实验的接种操作从药片溶解（药片溶解在无菌水中时不能剧烈震荡，以免双歧杆菌与大量氧气接触）到密封除氧不超过5min。
在加入除氧剂并以凡士林密封后，最好以胶带粘封厌氧罐边缘，保证培养过程中皿盖不会因振动滑移而破坏厌氧环境。
除氧剂的用量可以稍过量，以弥补封罐前的损失。
实验证明，焦性没食子酸除氧的效率很高，如果微微打开皿盖边缘，立即将划燃的火柴凑近皿盖边缘，火柴会在瞬间熄灭。
3. 实验在分离双歧杆菌的过程中先后分离到了大量嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的单菌落，虽然这两种细菌不是目的菌，但分别对两种菌的菌落和细胞形态的观察也发现了一些有趣的现象，一并整理在此报告中。
a b c d图5. 厌氧条件下从蒙牛冠益乳中分离得到的嗜热链球菌在琼脂培养基表面生长的形态。
可以看到链球菌单个球形细胞之间首尾相连形成弯曲折叠的长链。
该图片为直接观察培养基表面获得。
图6. 从双歧杆菌乳酸菌三联活菌片中分离到的保加利亚乳杆菌番红染色。
从图中可以看出，保加利亚乳杆菌为典型的长杆菌，个体间直径相差不大，都不足1μm，但长度相差较大，单个菌体最长可达30-40μm。
图7. 对保加利亚乳杆菌的革兰氏染色可以观察到个别菌体内有深染的颗粒状物质。
具有颗粒物的菌体比例和颗粒物的密度因菌落的不同而有明显差异。
猜测颗粒物的形成与菌体的代谢产物有关。
参考文献：1. E. Hungate & J. Macy: The Roll-Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes. Bull. Ecol. Res. Comm. (Stockholm) 17: 123-125 (1973).2. Tanaka & Masahiko Mutai: Improved Medium for Selective Isolation and Enumeration of Bifidobacterium. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Nov. 1980.3. James A. Poupard, Intisar Husain, Robert F. Norris: Biology of the Bifidobacteria. BACTERIOLOGICAL REVIEWS, June 1973.4. Intisar Husain, James A. Poupard, Robert F. Norris: Influence of Nutrition on the Morphology of a Strain of Bifidobacterium bifidum. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 19725. 李平兰, 张篪: 利用亨盖特厌氧滚管技术检测双歧杆菌制品中的活菌数, Food Science, 2, 1992.6. 马钢: 酸奶及其饮料中双歧杆菌分离培养与计数, Food Science, 11, 1994.7. 凌代文: 乳酸细菌分类鉴定及实验方法, 1999.。