SOD及NF-κB在梗阻性黄疸大鼠肝脏损伤中的作用

SOD及NF-κB在梗阻性黄疸大鼠肝脏损伤中的作用【摘要】目的：检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)活力及核因子-κb(nuclear factor-κb， nf-κb)在梗阻性黄疸大鼠肝脏中的表达，探讨其在梗阻性黄疸大鼠肝脏损害中的作用。

方法：采用胆总管结扎法构建梗阻性黄疸大鼠模型，检测血清总胆红素(total bilirubin， tb)、直接胆红素(direct bilirubin，db)和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase， alt)，以及肝脏组织行he病理切片检查鉴定梗阻性黄疸大鼠模型。

肝脏组织匀浆后检测组织中总sod和cuzn-sod活力，以免疫组织化学方法检测nf-κb在肝脏中的表达。

结果：胆道结扎(bile duct ligation， bdl)组血清tb、db及alt明显增高(p<0.01)；胆道结扎组肝组织中总sod和cuzn-sod活力较假手术组明显减低(p<0.01)。

胆道结扎组nf-κb p65蛋白激活并出现核移位，19 d组较7 d组更加显著。

结论：脂质过氧化是梗阻性黄疸器官损伤的最重要的机制之一，而sod活力的降低及nf-κb的激活，在梗阻性黄疸肝脏过氧化损害中具有重要意义。

【关键词】超氧化物歧化酶；核因子-κb；梗阻性黄疸；肝脏roles of sod and nf-κb in liver injury of obstructive jaundice in rats/xu hai-bo， gong peng.//medical innovation of china，2012，9(12)：003-005【abstract】 objective： to determine the activities of sodand the expression of nuclear factor-κb(nf-κb) in rats with obstructive jaundice induced by bile duct ligation(bdl)， and elucidate the mechanisms of hepatic injury due to obstructive jaundice. methods： the animal model of obstructive jaundice in rats were made to be bile duct ligation. all rats were sacrificed on the 7th day and 19th day after bdl. the blood and liver tissue samples were obtained. total bilirubin(tb)，direct bilirubin(db)， alanine aminotransferase(alt) in serum were detected and liver tissue he pathology section were evaluated. sod enzyme activity was detected by sod kit. the detection of activation of nf-kb was performed by an immunohistochemical method. results： in bdl animals serum，tb， db， and alt significantly increased compared with the sham group (p<0.01). by he pathology section， we observed that in the bdl group， in liver significant damage signs occurred ， and the change on 19th day after bdl was more obvious. the activities of normal sod and cuzn-sod decreased compared to the sham group(p<0.01)， and the decrease on 19th day after bdl was more significant. in bdl group， nf-κbp65 activation and nuclear displacement response， on 19th day after bdl， were more significant. conclusion： oxidative stress probably plays an important role in liver injuryinduced by obstructive jaundice. down-regulated expression of sod and nf-κbp65 activation may be the important molecule mechanism in liver damage of obstructive jaundice.【key words】 superoxide dismutase； nuclear factor-κb；obstructive jaundice； liverfirst-author’s address： second affiliated hospital of soochow university， suzhou 215004， chinadoi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.12.002胆道梗阻所致的梗阻性黄疸(obstructive jaundice， oj)是外科常见疾病，可以造成全身多器官功能损害，而肝脏损害常最为显著。

脂质过氧化是梗阻性黄疸器官损伤的最重要的机制之一，而超氧化物歧化酶(sod)为抗过氧化的关键酶[1]。

本实验通过构建梗阻性黄疸大鼠肝脏模型，检测梗黄大鼠肝脏总sod活力与nf-κ b p65蛋白表达，进一步明确sod及nf-κb在梗黄大鼠肝脏损害中的作用。

1 材料与方法1.1 材料健康sprague-dawley(sd)大鼠，120只，雌雄各半，体重200～250 g，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证号scxk(辽)2002-0002。

随机分为四组，手术(bdl)7 d组、假手术(sham)7 d组、手术(bdl)19 d组、假手术(sham)19 d组，每组30只。

1.2 胆道梗阻大鼠模型的建立、标本取材采用胆总管结扎法构建胆道梗阻大鼠模型，于建模术后第7 d和19 d处死，无菌收集血液，液氮低温保存肝脏，部分新鲜组织块福尔马林液固定。

1.3 方法所有免疫组化切片均采用奥林巴斯显微照相系统(10×40倍)在完全同样的拍摄条件下摄片，并采用image-pro plus图像分析系统强度标准化校正后，选定aoi(area of interest)，分析测定iod(integrated optical density)累积光密度及area两参数并计算阳性表达平均光密度。

1.3.1 sod活力测定肝组织块在冰生理盐水中漂洗、拭干，称重0.25 g剪碎。

加入预冷的组织块重量9倍的生理盐水，手工匀浆上下转动研磨8 min，使组织匀浆化。

低温低速离心机3000 g左右离心15 min，取上清液，按1：9比例用蒸馏水稀释，制备成l%的肝组织匀浆液。

按照说明书操作方法进行测定。

1.3.2 肝脏组织切片he染色及免疫组化染色取10%福尔马林固定的肝脏组织，常规石蜡包埋、切片。

he染色切片观察记录肝脏组织的形态学变化，免疫组化染色抗nf-κ b p65多克隆抗体一抗稀释浓度为1：200，采用sp三步法染色。

1.4 试剂与仪器总胆红素及直接胆红素检测试剂盒购自浙江伊利康生物技术公司，nf-κbp65小鼠抗大鼠多克隆抗体购自santa-cruz公司，兔抗小鼠二抗购自迈新生物公司，sod测试盒购自南京建成生物研究所。

总胆红素及直接胆红素检测采用beckman lx-20全自动化生化分析仪。

1.5 统计学处理使用pems 3.1软件进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 模型大体及肝脏组织切片he染色病理改变观察术后7 d及19 d，解剖大鼠见胆总管近肝侧呈囊状扩张，管内充满胆汁，肝脏呈黄褐色，弥漫性肿大，其中19 d组大鼠可见大量黄色腹水。

肝脏组织常规he病理切片光镜下见bdl 7 d组可见肝内胆管广泛扩张、肝细胞肿胀、大量空泡变性；汇管区有可见少量纤维组织及新生胆管增生。

bdl 19 d组可见汇管区周围大片肝细胞变性、坏死，炎性细胞浸润，肝小叶较正常组织形态紊乱，且见小胆管、毛细血管以及纤维结缔组织增生向肝小叶内扩展。

2.2 血清生化检测结果 bdl 7 d组和19 d组血清tb、db及alt 水平均明显高于sham组(p<0.01)，bdl 19 d组与bdl 7 d组比较，tb、db及alt有所下降(p<0.05或p<0.01)，但仍处于较高水平。

见表1。

*与sham组比较，p<0.01；△p<0.05，#p<0.01，与bdl 7 d组比较2.3 胆道梗阻大鼠肝脏中总sod及cuzn-sod活力检测结果 bdl7 d组和bdl 19 d组与sham组比较显著减弱(p<0.01)，与bdl 7 d 组相比，bdl 19 d组降低更加明显，两组酶活性比较差异具有统计学意义(p<0.01)。

见表2。

*与sham组比较，p<0.01；△与bdl 7 d组比较，p<0.012.4 每张切片随机选取5个视野，在显微成像系统下(10×40倍)摄片，所有照片使用image-pro plus图像处理软件计阳性表达的平均光密度。

sham组肝组织nf-κbp65蛋白未表达，或表达呈弱阳性，仅见少量细胞胞浆呈淡黄色，未见胞核着色。

bdl 7 d组见胞浆中染色增强呈棕黄色，并可见胞核着色，与sham组相比差异有统计学意义(p<0.01)，19 d组较7 d组着色显著增强(p<0.01)，阳性细胞数增多。

见表3。

*与sham组比较，p<0.01；△与bdl 7 d组比较，p<0.013 讨论在正常的生理状态下，自由基的生成和清除处于稳态。