苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定

测定每管的 PAL 酶活力，合并 PAL 活力高的试管，记为酶洗脱液。
（ 6 ） DEAL 纤维素柱梯度洗脱
称取 DEAE 纤维素 52 干粉 1 一 1.5g ，加 20m1 的 0.02mol/ I. 磷酸盐缓冲 液 (pH8 . 0) 浸泡 4h 以上（或浸泡过夜）。
装柱：把预处理的 DEAE 纤维素 52 装柱（方法及要求同凝胶层析柱）。装柱完 成后，用 2 一 3 个床体积的 0 . 02 mol/ I_ 磷酸盐缓冲液（ PH8.0 ） 平衡 该柱。
根据硫酸安饱和度用量表，算出从 38 ％到 75 ％饱和度所需硫酸铵用量。按上 述同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。将沉淀溶于 1 ml 酶抽提液中。
（ 5 ） Sephadex G 一 25 层析脱盐
凝胶溶胀：称取 Sephadex G 一 25 5g, 加入适量 0 . 02mol/ I. 磷酸盐缓冲 液，在室温下溶胀。待溶胀平衡后，虹吸去除上清液中的细小凝胶颗粒，这样处 理 2 一 3 次。
从酶粗提液中吸出 0. 5m1 ，以作后面活力测定用。余下酶液根据实际体积、温 度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到 38% 饱和度应加入酶液中的硫酸铵量，并 称硫酸铵。
将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后， 再缓慢搅拌 10min ; 然后于 10 000 g 下冷冻离心 l0 min, 保留上清液于烧杯 内。
上样：让胶床表面几乎不留液层，将 l ml 酶液小心注入胶床而中央，注意不要 冲坏床面，吸取 lm ！磷酸盐缓冲液，把吸附在玻璃壁上的沉淀液洗入柱内，在 床表面仅有 lml 左右液层时，再小心地用滴管加入 5 - 6 cm 高的磷酸缓冲液 洗脱。
洗脱收集：取刻度试管 5 支（包括上面一支），编号，柱床上面不断加磷酸盐 缓冲液洗脱，出水口不断用刻度试管收集洗脱液，每管收集 3m1 。
1. 在 PAL 活力测定中，设置 0 号管和对照管的目的是什么？
2. 如何确定硫酸钱沉淀某所需酶蛋白质的最佳饱和度的范围？
3 . Sephadex G 一 25 柱层析脱盐成功的关键有哪些？ 4. 如果改变 DEAE 纤维素为 CM 纤维素（阳离子交换剂），其他条件均一不变， 问各蛋白的洗脱行为有何变化？
上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，所有注意点和方法也与凝胶层 析中上样相似。上样结束后，在床面以上小心地加入 0.02 niol / I_ 磷酸盐缓 冲液 2-3cm 厚液层。注意上样开始就收集流出液。
洗柱：约用 2 倍床体积的 0.02mol/ L 磷酸盐缓冲液洗柱，收集洗柱液。按洗 脱管编号，每隔 3 管（如 1,4,7 等）取其洗脱液 0.1m1 ，测各管中 PAL 的活 力；合并主要含有 PAL 活力的各管洗脱液，并量出其总体积（ ml ）。
材料：供试植物材料
四、操作步骤
（ 1 ）酶液提取 植物材料 lg ，剪成小段，加入 5 倍体积的酶提取液，于冰 浴上研钵研磨。
(2) 将已匀浆的酶液用三层纱布过滤。滤液转入离心管， 10000g 冷冻离心 30 分钟。
(3) 取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，放置冰浴中备用。
（ 4 ）硫酸铵分级沉淀酶蛋白
苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定
一、 目的
掌握纯化酶的基本操作和方法；学习一种常用的酶活力测定法。
二、 原理
苯丙氨酸解氨酶（ L-phenylalanine ： ammonia lyase, 简称 PAL ； EC4 . 3 . 1 . 5 ）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、 异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌 侵害过程中起重要作用。 PAL 催化 L- 苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式 肉桂酸在 290nm 处有最大吸收值。若酶的加入量适当， A290 升高的速率可在 几小时内保持不变，因此通过测定 A290 升高的速率以测定 PAL 活力。规定 1h 内 A 290 增加 0 . Ol 为 PAL 的一个活力单位。
（ 10 ）考马斯亮蓝 G-250 蛋白质染色液：称取 10 mg 考马斯亮蓝 G - 250, 溶 于 5ml 95 `% 乙醇中，加入 85 ％（ W/V ）磷酸 loml ，混匀后即为母液。用 时，按 15ml 母液加 85m1 蒸馏水的比例稀释，混匀后过滤即为稀释液。
（ 11 ）滴管
(l2) 止水夹
紫外分光光度计预热 lOmin, 于波长 290nm 处测定各管的 A 290 。
(8) 蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）
取酶液 0.I ml ，用蒸馏水稀释至 5ml.
取试管 8 支，按下表加入各溶液：
试管编号 标准白质溶液 ( ml ) 稀释酶液（ mI ）
0 1 2 3 4 5 67 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
11
蒸馏水（ ml ） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 考马斯亮蓝 (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2
将上述各管混匀，静置 2min, 测定各管的 A 595 ,
五、结果处理
PAL 总活力、比活力、蛋自质含量的计算
步骤
蛋白质含量 体积（ ml ）
（ mg ）
总活力（ m ）
比活力
（ m/mg protein ）
粗提
硫酸铵沉淀
凝胶层析
离子交换层析
注：（ 1 ）绘制蛋白质测定的标准曲线：以 1~ 5 号管溶液的 A 59 5 值为纵 坐标，相应管中的蛋自质微克数为横坐标，作图。
(2) PAL 比活力计算：
六、注意事项 1. 往酶液中加固体硫酸铵时，注意不能有大颗粒，加的速度也不能过快。 2. 层析柱要保持与地面垂直，往柱内加样品时要小心，避免冲坏床面。 七、思考事项
三、试剂和材料
(1) 0.l mol 硼酸一硼砂缓冲液 (pH8.7)
(2) 酶提取液 0 .1 mol/ I 硼酸一硼砂缓冲液（含 1 mmol/ I, EDTA, 20mmol/ L β一巯基乙醇）
（ 3 ） 0 . 6m.ol/ I- L 一苯丙氨酸溶液
（ 4 ） 6 mol/ l HCl
(5 ）固体硫酸铵
(6 ） 0. 02mol/l- 磷酸盐缓冲液（ pH8.0, 含 0 . 5 mmol/ L EDTA, 2.5% 甘 油， 20nlmol/ l . β - 巯基乙醇）
（ 7 ） Sephadex G 一 25
（ 8 ） DEAE 纤维素 52
（ 9 ）标准蛋白质溶液（ 100ug/ ml ）：准确称取 I O mg 牛血清自蛋自于烧 杯内，用蒸馏水溶解，完全转移到 100 ml 容量瓶内，定容至刻度，混匀。
(7) 酶活力测定
取试管 3 支，按表中所述加样 (0 号为调零管， 1 号为测定管， 2 号为对照 管)
试管编号
1
0.01mol/l 硼酸缓冲液
4
酶液
0.6mmol/l 苯丙氨酸 (ml)
1
2
3
3.9
4.9
0.1
0.1
1
将各管混匀，放入 40 度恒温水浴保温 1h ，到时加 0.2ml 2mmol/1. HCl 终止 反应。
装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，将 20m1 蒸馏水装入柱内，打开止水夹赶去 出口内气泡，当柱内保留 1 ml 左右水层时，把处理好的 Sephadex G2 5 用玻 璃棒搅匀，尽量一次加入柱内，待胶床表面仅有 1 - 2 cm 液层时，旋紧止水夹、。 装好的胶柱应无气泡、无节痕、床面平正，床面铺 1 张圆形滤纸片。