苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定-(word可编辑)

苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定-（word可编辑）苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定一、目的

掌握纯化酶的基本操作和方法;学习一种常用的酶活力测定法。二、原理

苯丙氨酸解氨酶( L-phenylalanine : ammonia lyase, 简称 PAL ; EC4 . 3 .

1 .

5 )是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异

黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。 PAL 催化 L- 苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸

在 290nm 处有最大吸收值。若酶的加入量适当， A290 升高的速率可在几小时内

保持不变，因此通过测定 A290 升高的速率以测定 PAL 活力。规定 1h 内 A 290 增加 0 . Ol 为 PAL 的一个活力单位。

三、试剂和材料

(1) 0.l mol 硼酸一硼砂缓冲液 (pH8.7)

(2) 酶提取液 0 .1 mol/ I 硼酸一硼砂缓冲液(含 1 mmol/ I, EDTA,

20mmol/ L β

一巯基乙醇)

( 3 ) 0 . 6m.ol/ I- L 一苯丙氨酸溶液

( 4 ) 6 mol/ l HCl

(5 )固体硫酸铵

(6 ) 0. 02mol/l- 磷酸盐缓冲液( pH8.0, 含 0 . 5 mmol/ L EDTA, 2.5% 甘油，20nlmol/ l . β - 巯基乙醇)

( 7 ) Sephadex G 一 25

( 8 ) DEAE 纤维素 52

( 9 )标准蛋白质溶液( 100ug/ ml ):准确称取 10 mg 牛血清自蛋自于烧杯内，用蒸馏水溶解，完全转移到 100 ml 容量瓶内，定容至刻度，混匀。 ( 10 )考马斯亮蓝 G-250 蛋白质染色液:称取 10 mg 考马斯亮蓝 G - 250, 溶于 5ml 95 `% 乙醇中，加入 85 ,( W/V )磷酸 loml ，混匀后即为母液。用时，按 15ml 母液加 85m1 蒸馏水的比例稀释，混匀后过滤即为稀释液。 ( 11 )滴管(l2) 止水夹

材料:供试植物材料

四、操作步骤

( 1 )酶液提取植物材料 lg ，剪成小段，加入 5 倍体积的酶提取液，于冰

浴上研钵研磨。

(2) 将已匀浆的酶液用三层纱布过滤。滤液转入离心管， 10000g 冷冻离心

30 分钟。

(3) 取离心后的上清液(酶粗提液)，量出其体积，放置冰浴中备用。 ( 4 )硫酸铵分级沉淀酶蛋白

从酶粗提液中吸出 0. 5m1 ，以作后面活力测定用。余下酶液根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到 38% 饱和度应加入酶液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。

将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌 10min ; 然后于 10 000 g 下冷冻离心 l0 min, 保留上清液于烧杯内。

根据硫酸安饱和度用量表，算出从 38 ,到 75 ,饱和度所需硫酸铵用量。按上述同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。将沉淀溶于 1 ml 酶抽提液中。

Sephadex G 一 25 层析脱盐 ( 5 )

凝胶溶胀:称取 Sephadex G 一 25 5g, 加入适量 0 . 02mol/ I. 磷酸盐缓冲液，在室温下溶胀。待溶胀平衡后，虹吸去除上清液中的细小凝胶颗粒，这样处理2 一 3 次。

装柱:固定好层析柱，柱保持垂直，将 20m1 蒸馏水装入柱内，打开止水夹赶

去出口内气泡，当柱内保留 1 ml 左右水层时，把处理好的 Sephadex G2 5 用玻璃棒搅匀，尽量一次加入柱内，待胶床表面仅有 1 - 2 cm 液层时，旋紧止水夹、。装好的胶柱应无气泡、无节痕、床面平正，床面铺 1 张圆形滤纸片。上样:让胶床表面几乎不留液层，将 l ml 酶液小心注入胶床而中央，注意不要冲坏床面，吸取 lm ～磷酸盐缓冲液，把吸附在玻璃壁上的沉淀液洗入柱内，在床表面仅有 lml 左右液层时，再小心地用滴管加入 5 - 6 cm 高的磷酸缓冲液洗脱。

洗脱收集:取刻度试管 5 支(包括上面一支)，编号，柱床上面不断加磷酸盐缓冲液洗脱，出水口不断用刻度试管收集洗脱液，每管收集 3m1 。测定每管的 PAL 酶活力，合并 PAL 活力高的试管，记为酶洗脱液。 ( 6 ) DEAL 纤维素柱梯度洗脱

称取 DEAE 纤维素 52 干粉 1 一 1.5g ，加 20m1 的 0.02mol/ I. 磷酸盐缓冲液 (pH8 . 0) 浸泡 4h 以上(或浸泡过夜)。

装柱:把预处理的 DEAE 纤维素 52 装柱(方法及要求同凝胶层析柱)。装柱完

成后，用 2 一 3 个床体积的 0 . 02 mol/ I_ 磷酸盐缓冲液( PH8.0 ) 平衡该柱。

上样:把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，所有注意点和方法也与凝胶

层析中上样相似。上样结束后，在床面以上小心地加入 0.02 niol / I_ 磷酸盐缓冲液 2-3cm 厚液层。注意上样开始就收集流出液。

洗柱:约用 2 倍床体积的 0.02mol/ L 磷酸盐缓冲液洗柱，收集洗柱液。按洗脱管编号，每隔 3 管(如 1,4,7 等)取其洗脱液 0.1m1 ，测各管中 PAL 的活力;合并主要含有 PAL 活力的各管洗脱液，并量出其总体积( ml )。 (7) 酶活力测定取试管 3 支，按表中所述加样 (0 号为调零管， 1 号为测定管， 2 号为对照管 )

1 2 3 试管编号

4 3.9 4.9 0.01mol/l 硼酸缓冲液

0.1 0.1 酶液

1 1 0.6mmol/l 苯丙氨酸 (ml)

将各管混匀，放入 40 度恒温水浴保温 1h ，到时加 0.2ml 2mmol/1. HCl 终止反应。

紫外分光光度计预热 lOmin, 于波长 290nm 处测定各管的 A 290 。 (8) 蛋白质测定(考马斯亮蓝染色法)

取酶液 0.I ml ，用蒸馏水稀释至 5ml.

取试管 8 支，按下表加入各溶液:

0 1 2 3 4 5 6 7 试管编号

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 标准蛋白质溶液

( ml )

1 1 稀释酶液( mI )

2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 蒸馏水( ml )

2 2 2 2 2 2 2 2 考马斯亮蓝 (ml)

将上述各管混匀，静置 2min, 测定各管的 A 595 , 五、结果处理

PAL 总活力、比活力、蛋自质含量的计算

比活力