苯丙氨酸解氨酶活力测定
苯丙氨酸脱氨酶实验报告
一、实验目的1. 了解苯丙氨酸脱氨酶（Phenylalanine Dehydrogenase，简称PAH）的基本性质和作用。
2. 掌握苯丙氨酸脱氨酶活性的测定方法。
3. 通过实验验证不同条件下苯丙氨酸脱氨酶活性的变化。
二、实验原理苯丙氨酸脱氨酶是一种参与生物体内氨基酸代谢的酶，其活性对于许多生物学过程至关重要。
本实验采用邻苯二胺法测定苯丙氨酸脱氨酶活性。
该方法原理是：苯丙氨酸脱氨酶将苯丙氨酸脱氨后，产生苯丙酮酸，苯丙酮酸在反应中与邻苯二胺反应，生成深蓝色化合物。
该化合物的蓝色深浅与苯丙酮酸的浓度成正比，可以通过分光光度计测量吸光度来测定苯丙酮酸的生成速率，从而计算苯丙氨酸脱氨酶的活性。
三、实验材料1. 实验试剂：苯丙氨酸、邻苯二胺、氢氧化钠、三氯化铁、蒸馏水等。
2. 实验仪器：分光光度计、恒温水浴锅、移液器、试管等。
四、实验方法1. 配制苯丙氨酸溶液：称取苯丙氨酸0.1g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成1mg/ml的苯丙氨酸溶液。
2. 配制邻苯二胺溶液：称取邻苯二胺0.1g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成1mg/ml的邻苯二胺溶液。
3. 氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠0.5g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成5%的氢氧化钠溶液。
4. 三氯化铁溶液：称取三氯化铁0.1g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成1%的三氯化铁溶液。
5. 样品处理：取适量样品，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成一定浓度的样品溶液。
6. 实验步骤：a. 取试管一支，加入苯丙氨酸溶液2ml。
b. 加入样品溶液2ml。
c. 加入邻苯二胺溶液2ml。
d. 加入氢氧化钠溶液2ml。
e. 混匀，置于恒温水浴锅中，在特定温度下反应一定时间。
f. 取出试管，加入三氯化铁溶液1ml。
g. 混匀，用分光光度计在特定波长下测定吸光度。
h. 根据吸光度计算苯丙氨酸脱氨酶活性。
五、实验结果与分析1. 苯丙氨酸脱氨酶活性随温度升高而升高，在50℃时达到峰值，随后随温度升高而降低。
苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定
粗提
硫酸铵沉淀
凝胶层析
离子交换层析
注：（ 1 ）绘制蛋白质测定的标准曲线：以 1~ 5 号管溶液的 A 59 5 值为纵 坐标，相应管中的蛋自质微克数为横坐标，作图。
(2) PAL 比活力计算：
六、注意事项 1. 往酶液中加固体硫酸铵时，注意不能有大颗粒，加的速度也不能过快。 2. 层析柱要保持与地面垂直，往柱内加样品时要小心，避免冲坏床面。 七、思考事项
上样：让胶床表面几乎不留液层，将 l ml 酶液小心注入胶床而中央，注意不要 冲坏床面，吸取 lm ！磷酸盐缓冲液，把吸附在玻璃壁上的沉淀液洗入柱内，在 床表面仅有 lml 左右液层时，再小心地用滴管加入 5 - 6 cm 高的磷酸缓冲液 洗脱。
洗脱收集：取刻度试管 5 支（包括上面一支），编号，柱床上面不断加磷酸盐 缓冲液洗脱，出水口不断用刻度试管收集洗脱液，每管收集 3m1 。
紫外分光光度计预热 lOmin, 于波长 290nm 处测定各管的 A 290 。
(8) 蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）
取酶液 0.I ml ，用蒸馏水稀释至 5ml.
取试管 8 支，按下表加入各溶液：
试管编号 标准蛋白质溶液 ( ml ) 稀释酶液（ mI ）
0 1 2 3 4 5 67 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
材料：供试植物材料
四、操作步骤
（ 1 ）酶液提取 植物材料 lg ，剪成小段，加入 5 倍体积的酶提取液，于冰 浴上研钵研磨。
(2) 将已匀浆的酶液用三层纱布过滤。滤液转入离心管， 10000g 冷冻离心 30 分钟。
(3) 取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，放置冰浴中备用。
（ 4 ）硫酸铵分级沉淀酶蛋白
1. 在 PAL 活力测定中，设置 0 号管和对照管的目的是什么？
茶鲜叶苯丙氨酸解氨酶的提取及其活性测定
茶鲜叶苯丙氨酸解氨酶的提取及其活性测定
刘鸿年;刘发敏
【期刊名称】《中国茶叶》
【年(卷),期】1989(000)001
【摘要】苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物次生代谢中三个关键酶之一,它催化L-苯丙氨酸形成反-肉桂酸这一不可逆反应,因此它是一种限速酶。
该酶在进入芳香族二级代谢的起始酶的生物合成中起着关键的作用。
茶树具有很强的生物合成酶类化合物的能力,使幼叶中积累的可溶性多元酚含量高达35％(干重)。
由于酶类化合物及其衍生物与茶的品质,即滋味、香气、色泽等关系密切,而且该酶又与茶树品种、生育条件等有关,研究茶叶的PAL就有其重要的意义。
【总页数】2页(P4-5)
【作者】刘鸿年;刘发敏
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S571.1
【相关文献】
1.酶解法提取大别山苦荆茶鲜叶茶汁的工艺 [J], 项俊;王晓玲;方元平;钟玉林
2.茶鲜叶萎凋中苯丙氨酸解氨酶活性的研究 [J], 刘鸿年;刘发敏
3.固相萃取和分散固相净化-串联质谱测定茶鲜叶和干茶中的农药残留 [J], 杨洁; 周利; 余焕; 孙荷芝; 王新茹; 张新忠; 杨梅; 陈宗懋; 罗逢健
4.茶与茶制品紧密堆积密度测定仪和茶鲜叶氟素快速测定仪介绍 [J],
5.酸化茶鲜叶原料对鲜茶汁压榨提取的作用 [J], 龚淑英;张堂恒
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苯丙氨酸解氨酶的测定
苯丙氨酸解氨酶的测定一、实验目的利用无土栽培技术培育不同pH下水芹，使用离心技术粗提取苯丙氨酸解氨酶，用分光光度计测不同的吸光值。
二、实验原理无土栽培是用人工配制的培养液，供给植物矿物营养的需要。
离心技术的应用是将样品放入离心机的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一向外的离心力。
由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。
分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。
三、仪器与试剂仪器：高速离心机、分光光度计、玻璃瓶、研钵、烧杯、量筒、试管、剪刀和纱布等。
试剂：霍格兰营养液，磷酸缓冲液,0.02mol/L苯丙氨酸,硼酸缓冲液，高锰酸钾材料：水芹幼苗，0.1mol/LNaOH溶液四、操作步骤一、水芹的无土栽培1.配好无土栽培营养液，准备7个玻璃瓶，分别加入15ml营养液。
再加NaOH溶液把玻璃瓶中pH值调成5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，贴上标签。
2.把水芹幼苗从玻璃瓶中取出经过洗净，用高锰酸钾消毒处理后，分别移入盛有营养液的玻璃杯中，放在光照培养箱培养3.定期观察并注意加霍格兰营养液和NaOH溶液使玻璃瓶中pH保持不变。
二、水芹中苯丙氨酸解氨酶的粗提取1.等到水芹大概张到20cm左右，就把它们分别从玻璃瓶中取出，在30℃暗中培养5小时。
然后分别把同一pH值的水芹分别剪成根，茎，叶，根茎，根叶，叶茎，根茎叶七个部分均为0.5g。
2.加预冷的pH7.2磷酸缓冲液5mL，冰浴下充分研磨，均匀混合，用4层纱布过滤。
4000rpm 离心15min，弃沉淀。
获上清液用磷酸缓冲液稀释5倍，作为酶测定的粗提液，置于冰浴下保存备用。
三、水芹中苯丙氨酸解氨酶的吸光度测定设计对照试验：A：取粗水芹酶液0.1mL，加入2.5mL 0.02mol/L苯丙氨酸B：取0.1mL硼酸缓冲液，加入2.5mL 0.02mol/L苯丙氨酸（对照）。
苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸比色法)
苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸比色法)简介：苯丙氨酸解氨酶(L－phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。
该酶多存在于高等植物、酵母、菌类可溶性部分物质，是1961年J.Koukol在大麦中发现的，推测其分子量约为，这是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的酶。
在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化，用光照、病伤害、植物激素处理等会使活性显著增加。
在多数情况下，在组织中活性增加时，酶发生失活作用，这时组织中具有活性酶的量很快就会减少，据认为这种失活是与类蛋白质物质作用有关。
测定细胞木质素合成途径中间代谢物及关键酶活性，可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
Leagene苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸比色法)检测原理是以苯丙氨酸作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于分光光度计检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。
该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的苯丙氨酸解氨酶活性，尤其适用于检测水果中苯丙氨酸解氨酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、蒸馏水2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、低温离心机5、水浴锅或恒温箱6、比色杯7、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TE040350TStorage试剂(A):PAL Lysis buffer250ml4℃避光试剂(B):PAL Assay buffer30ml4℃避光试剂(C):PAL终止液5ml RT使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：取植物组织或水果中层果肉，加入PAL Lysis buffer，冰浴情况下充分捣碎研磨或匀浆，离心，留取上清液，冻存，用于苯丙氨酸解氨酶的检测。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于苯丙氨酸解氨酶的检测。
生物化学实习报告
生物化学实验报告生物化学综合实验摘要：本次实验包括苯丙氨酸解氨酶的纯化及其活性测定和大米粉中营养成分的测定两个实验。
关键词：苯丙氨酸解氨酶、Sephadex G—25层析、DEAE纤维素层析、活力、比活力、大米粉、凯式定氮法、索式提取法、3，5—二硝基水杨酸比色法。
实验一苯丙氨酸解氨酶的纯化及其活性测定一、实验目的1.学习掌握分离纯化生物大分子的方法；2.学习掌握酶活性的测定方法；3.了解在分离纯化过程中酶活性的变化；4.了解高速冷冻离心机及蛋白质检测仪的操作步骤。
二、实验原理苯丙氨酸解氨酶（L—phenylalanine: ammonia lyase,简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切相关，在植物生长发育和抵制病菌侵害过程中起重要作用。
PAL催化L—苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。
规定1h 内增加0.01为PAL的一个活力单位。
酶的比活力是指样品中每毫克蛋白质所含的酶活力单位数。
在实验中将会看到随着PAL的逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。
在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析。
溶液的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和溶液称100%饱和度。
沉淀一种酶所需的具体浓度需要经实验确定。
Sephadex(交联葡萄糖凝胶)是有细菌葡聚糖长连，用交联剂1—氯2—，3—环氯丙烷交联而成。
凝胶商品名后面的G值表示每克干胶吸水量（毫升数）的10倍。
交联度大，网孔小；交联度小，网孔大。
交联度的大小还与凝胶颗粒的机械强度有关，交联度大，机械强度也大（硬胶），在柱层析中流速快。
根据需要，选用一定型号的的凝胶柱做柱层析介质（蛋白脱盐一般用G—25或G—50，G—100~G—200分离不同分子质量的蛋白组分）。
由于被分离物质的分子大小和形状不同，分子质量大的进入凝胶网孔中被阻滞，从而后流出层析住，达到分离的目的。
植物五种酶活性检测方法
欢迎阅读选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。
1、多酚化酶（Polyphenoloxidase ，PPO ）活性的测定适量茶鲜叶（3g ）,料液比1:2，加入内含5%PVP （w/v ）经遇冷的pH 为7.2的柠檬酸-，取上取 1.2ml （（37℃恒合液。
0.01为2离心20min 取酶提取液0.2ml ，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/LL-苯丙氨酸，2.8ml 蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min ，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。
PAL 的酶活性以每小时在290nm 处吸光度变化0.01OD 为一个活力单位。
3、脂氧合酶(linoleate:oxygenoxidoreductase ，LOX )活性的测定取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。
4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。
Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。
4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP[取2-3ml5分ΔA470积（ml，5取（含1%PVP12h。
1000r/min离心20min,得到酶初提液。
取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。
取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）。
（测定30s读数一次，5分钟）。
酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物中的作用及其活性测定方法
苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物中的作用及其活性测定方法生命科学实验117篇原创内容公众号苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化 L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，也是苯丙氨酸代谢途径的关键酶和限速酶。
莽草酸途径产生的莽草酸通过分枝酸、预苯酸经转氨作用生成苯丙氨酸，从而进入苯丙烷类代谢途径，苯丙烷类代谢可生成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物，这些中间产物可进一步转化为香豆素、绿原酸，也可以形成 CoA酯，再进一步转化为木质素、黄酮、异黄酮、生物碱、苯甲酸酯糖苷等次生代谢产物。
一切含苯丙烷骨架的物质都由该代谢途径直接或间接生成。
在生物次生物质代谢中具有防紫外线伤害、抵抗病原体的侵害、保持花粉生活力及形成植物花青素等多种重要作用。
该酶在不同组织中、不同的内外因素调节下，含量水平及其基因表达的时空方式均有所不同。
1.PAL对植物生理代谢的意义植物的代谢分为初级代谢和次级代谢。
植物的次级代谢有多条途径，苯丙烷类代谢途径是其中很重要的一条。
苯丙烷类途径生成的黄酮、异黄酮、生物碱等次生代谢产物在植物的生长发育过程中起着重要的作用，所以PAL对植物的生理意义非常重大。
1.1在木质化中的作用在植物的木质化组织中含有较高的PAL活性。
用分离的百日草叶肉细胞研究了苯丙烷类代谢酶类与木质素、管状分子形成和细胞分化的关系，发现在百日草细胞分化过程中，木质素的合成及管状分子形成与PAL 活性的增加成正相关，细胞溶质中的 PAL 活性在木质化之前迅速上升，微粒体和细胞壁的 PAL 活性在木质化期间快速增加。
1.2在植物色素形成过程中的作用花色素是植物花朵、果实和叶片颜色的重要组成部分，花色素等的合成可由苯丙烷类产物反香豆酰 CoA 经过类黄酮途径生成，该过程与 PAL 密切相关。
如苋红素是中央种子目植物所特有的色素，当用白光、蓝光或红光照射尾穗苋黄化苗后，发现 PAL活性均有不同程度地上升，并有苋红素的积累。
苯丙氨酸解氨酶活性检测试剂盒说明书 BC0215
苯丙氨酸解氨酶（PAL微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0215规格：100T/96S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体110 mL×1瓶4℃保存试剂一液体15 mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×2瓶4℃保存试剂三液体1 mL×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用前取1瓶加入2.5 mL蒸馏水充分溶解待用；现配现用，4℃可保存2周。
产品说明：PAL（EC4. 3 1 5）广泛存在于各种植物和少数微生物中，是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶，在动物体内尚未发现。
与一些重要的次生物质如木质素、类黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切相关，在植物正常生长发育、抗病、抗逆反应中起重要作用。
PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值，通过测定吸光值升高速率计算PAL活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。
10000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至290nm，蒸馏水调零。
2、操作表：（在EP管或96孔板中按顺序加入下列试剂）试剂名称（μL）测定管空白管样本5试剂一145150试剂二4040BC0215 -- 第1 页，共2 页混匀，30℃准确反应30min试剂三1010混匀，静置10min后，290nm处记录测定管吸光值A1和空白管吸光值A2，ΔA=A1-A2。
烟草苯丙氨酸解氨酶活力与多酚含量的关系研究
烟草苯丙氨酸解氨酶活力与多酚含量的关系研究邵伏文;薛宝燕;郭家明;陈学平【摘要】[目的]测定不同品种烟草幼苗中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力、比活力以及多酚含量,研究PAL活力与多酚含量的关系.[方法]3个烟草品种分别为西1#、东2#和中3#.[结果]不同酶提取缓冲液对测定的PAL活力值有影响,其中10％ PVP 的效果最好；烟草幼苗中的多酚含量高,则其PAL活力及比活力都较高,而且PAL 活力与酶提取液中β-巯基乙醇的浓度呈正向相关关系.在试验材料中,多酚含量没有达到抑制PAL活力的水平.[结论]该研究可为探索改进PAL活力测定方法,明确多酚含量与PAL酶活力间的关系提供参考依据.%[Objective] The purpose was to determine the activity of phenylalanine ammonia lyase (PAL) , specific activity and polyphenol content in different varieties of tobacco seedling, and study the relationship between PAL activity and polyphenol content. [ Method] Three tobacco variety was west 1#, east 2# and middle 3#, respectively. [ Result] The enzyme extraction buffers had some effects on PAL activity value, in which 10% PVPs effects was the best. The PAL activity of the tobacco variety seedling with higher polyphenol content was higher, and PAL activity showed a positive correlation with the concentration of β-mercaptoethanol in enzyme extraction buffer. Polyphenol content could hardly inhabit the activity of PAL. [Conclusion] The study provides a reference basis for exploring modified determination method of PAL activity , and confirm the relationship between PAL activity and polyphenol content.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)012【总页数】3页(P7009-7011)【关键词】PAL;活力;比活力;多酚含量【作者】邵伏文;薛宝燕;郭家明;陈学平【作者单位】安徽省烟草公司,安徽合肥230022;安徽省烟草公司,安徽合肥230022;中国科学技术大学烟草与健康研究中心,安徽合肥230051;中国科学技术大学烟草与健康研究中心,安徽合肥230051【正文语种】中文【中图分类】S124+.1近年来研究表明，烟草中相当多的香气物质是在生长前、中期积累，而在成熟期调制过程中转化与代谢的［1］。
苯丙氨酸解氨酶活力测定
苯丙氨酸解氨酶活力和比活力测定
苯丙氨酸解氨酶
PAL存在于所有绿色植物,是植物体内次生代谢的关键酶和 限速酶。在植物形成次生物质如木质素、植保素等中起重 要作用。对植物生长发育、抵御病虫害、防紫外辐射及构 成植物支撑系统等方面具有重要意义（抗逆境)。 PAL是一种寡聚酶。 不同的植物，其PAL的氨基酸组成不同。最适pH也不同， 介于8．0～9．5之间。 PAL具有别构酶的特征．是一种典型的胞内诱导酶。 不同来源的PAL其诱导因素不一样。切割伤害、红光照射、 病虫害侵入等能诱导某些PAL活性。
测定原理
* 催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸 在波长290nm处有最大吸收值。如果酶的加入量适当， 反式肉桂酸的生成速率即A290升高的速率可在几小时 内保持不变，规定1小时内A290增加0.01为PAL的一 个活力单位。 * 酶的比活力是指样品中每毫克蛋白质所含的酶活力单 位数。为求得PAL的比活力，除了测定PAL的活力 （用活力单位表示）之外，还必须测定蛋白质含量 （用毫克数表示）。在后面有关PAL纯化的实验中将 会看到，随着PAL逐步被纯化，其比活力也在逐步增 加。因此，比活力可用来比较酶制剂的纯度。
实验步骤 * 酶提取
精确称取小麦幼苗（或根）1克左右，置于研钵 中，加入预冷的酶提取缓冲液共3ml，冰浴上充 分研磨成匀浆 10,000rpm、4℃离心 20min 上清液全部转入小量筒中，准确 记下体积
* 酶活力测定 * 蛋白质测定（考马斯亮蓝G-250染色法）
植物(Plant)苯丙氨酸解氨酶(PAL)-NEWA
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断植物（Plant）苯丙氨酸解氨酶（PAL）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被苯丙氨酸解氨酶（PAL）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。
2.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。
3.植物萃取液或其它相关样本：请1000x g离心20分钟，取上清即可检测。
4.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、1、2、4、8、16U/L试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
超氧化物歧化酶(SOD)过氧化物酶(CAT)苯丙氨酸解氨酶(PAL)实验测定方法总结
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定-----氮蓝四唑（NBT）法依据测定的蛋白含量计算出不同品种葡萄所需的酶液量（mL），并按照表2顺序加入试剂，注意核黄素要最后加入，共做6管。
表2 NBT法测定SOD酶活性50mM pH 7.8磷酸缓冲液（mL）130mM甲硫氨酸溶液（mL）750μM氮蓝四唑溶液（mL）100μMEDTA-Na2（mL）蒸馏水（mL）酶粗提液（mL）20μM核黄素溶液（mL）1 3.2 0.6 0.6 0.6 0.4 0 0.62 3.2 0.6 0.6 0.6 0.4 0 0.63 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.64 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.65 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.66 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.6注：1号为不光照对照管，2号为光照对照管各溶液显色反应用量混合后，将1号管置于黑暗处，其余各管置于光照处，反应约10 min（温度低时，反应时间延长；光照强时，缩短反应时间）。
反应结束后，全部移入暗处，以不光照对照管作为空白对照，在560nm处测定吸光度，记录数据。
以每变化0.1个吸光度为一个酶活单位SOD酶活计算公式：SOD（U/Pr.mg)=(Ack-Ae)/(Ack*0.1*C)式中：C-蛋白含量（mg）Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度Ae-样品管吸光度试剂配制方法：（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
91.5ml0.05MNa2HPO4（1.638582g）+8.5ml0.05M NaH2PO4(0.06630425g)（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。
（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
苯丙氨酸解氨酶活性的测定
实验结果
• 苯丙氨酸解氨酶在290nm处吸光度为1.770
Байду номын сангаас
实验试剂实验步骤马铃薯圆片制备将马铃薯块茎洗净削皮用打孔器直径1cm取圆柱切除两头近表皮处中间部分切成2mm厚的圆片
实验
苯丙氨酸解氨酶活性的测定
实验原理
• 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）催 化苯丙氨酸的脱氨反应，使NH3释放出来 形成反式肉桂酸。此酶的在植物体内次生 物质（如木质素等）代谢中起重要作用。 根据其产物，反式肉桂酸在290nm处吸光 度的变化可以测定该酶的活性。
实验仪器
（一）材料：马铃薯块茎
（二）仪器设备：1. 紫外分光光度计；2. 离心机； 3. 研钵；4. 培养皿；5. 红光装置；6. 打孔器；7. 恒温水浴
实验试剂
1、 0.05mol/L 硼酸盐缓冲溶液（pH8.8）； 2、 0.02mol/L 苯丙氨酸（用0.1mol/L pH8.8硼 酸缓冲液配制）； 3、 5mmol/L 巯基乙醇硼酸缓冲液。
四、 活性测定与计算 1ml酶液加1ml0.02mol/L 苯 丙氨酸，2ml蒸馏水，总体积为4ml。对照不加底物， 代之以1ml含巯基乙醇的硼酸缓冲液。反应液置恒温 水浴30℃中保温，0.5h后用紫外分光光度计在 290nm处测定吸光度。以每小时在290nm处吸光度 变化0.01所需酶量为一单位（相当每毫升反应混合 物形成1μg肉桂酸）。
实验步骤
三、酶粗提液的制备 经诱导处理的马铃薯圆片各 5g，分别加10ml含5mmol/L 的巯基乙醇的硼酸缓冲 液、0.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、少量石英砂在研 钵中研磨。匀浆用尼龙袋过滤，滤液经10000r/min 离心15min，上清液为酶粗提液。上述操作均在0～ 4℃下进行。
苯丙氨酸的脱氨酶法测定
苯丙氨酸的脱氨酶法测定
范长胜;胡宝龙;杨仁根
【期刊名称】《氨基酸和生物资源》
【年(卷),期】1995(17)3
【摘要】方法的原理是：由某些微生物所产生的苯丙氨酸脱氨酶能使苯丙氨酸分子氧化脱氨，生成相应的苯丙酮酸。
在合适的反应体系中，苯丙酮酸与三氯化铁反应生成的化合物呈蓝绿色，这种颜色的深浅与苯丙氨酸含量成正比，制备的标准曲线有良好的线性。
【总页数】3页(P33-35)
【关键词】苯丙氨酸;氨基酸;脱氨酶法;分析
【作者】范长胜;胡宝龙;杨仁根
【作者单位】复旦大学微生物学系
【正文语种】中文
【中图分类】Q517.03
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绞股蓝组培苗添加水杨酸后总黄酮含量及苯丙氨酸解氨酶活性研究
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苯丙氨酸脱氨酶试验
苯丙氨酸脱氨酶试验
苯丙氨酸脱氨酶试验介绍：
苯丙氨酸脱氨酶试验是指如果细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将培养
基中的苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变为绿色。
变形杆菌和普罗菲登斯菌以及莫拉氏菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。
苯丙氨酸脱氨酶试验正常值：
体内菌群的种类和比例正常，人体处于动态平衡。
苯丙氨酸脱氨酶试验临床意义：
异常结果：变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠
杆菌科其它细菌均为阴性。
普罗威登菌属所致的尿路感染、医院感染。
普罗威登菌属所致的
医院感染、尿路结石。
摩根菌属所致的医院感染、尿路感染、腹泻。
需要检查的人群：有上述症状者
苯丙氨酸脱氨酶试验注意事项：
不合宜人群：没有
检查前禁忌：注意劳逸结合，正常的饮食、卫生习惯，特别是注
意尿道的卫生。
检查时要求：积极配合医生
细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应。
若延长时间，会引起退色。
苯丙氨酸脱氨酶试验检查过程：
苯丙氨酸脱氨酶试验
方法：将被检部分取得的培养液中的待检菌大量接种入苯丙氨酸培养基中，35℃孵育18~24h，滴加100g/L三氯化铁试剂4~5滴，立即观察菌落生长处有无绿色出现。
结果：有绿色出现为阳性。
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测定原理
* 催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸 在波长290nm处有最大吸收值。如果酶的加入量适当， 反式肉桂酸的生成速率即A290升高的速率可在几小时 内保持不变，规定1小时内A290增加0.01为PAL的一 个活力单位。 * 酶的比活力是指样品中每毫克蛋白质所含的酶活力单 位数。为求得PAL的比活力，除了测定PAL的活力 （用活力单位表示）之外，还必须测定蛋白质含量 （用毫克数表示）。在后面有关PAL纯化的实验中将 会看到，随着PAL逐步被纯化，其比活力也在逐步增 加。因此，比活力可用来比较酶制剂的纯度。
苯丙氨酸解氨酶活力和比活力测定
苯丙氨酸解氨酶
PAL存在于所有绿色植物,是植物体内次生代谢的关键酶和 限速酶。在植物形成次生物质如木质素、植保素等中起重 要作用。对植物生长发育、抵御病虫害、防紫外辐射及构 成植物支撑系统等方面具有重要意义（抗逆境)。 PAL是一种寡聚酶。 不同的植物，其PAL的氨基酸组成不同。最适pH也不同， 介于8．0～9．5之间。 PAL具有别构酶的特征．是一种典型的胞内诱导酶。 不同来源的PAL其诱导因素不一样。切割伤害、红光照射、 病虫害侵入等能诱导某些PAL活性。
实验步骤 * 酶提取
精确称取小麦幼苗（或根）1克左右，置于研钵 中，加入预冷的酶提取缓冲液共3ml，冰浴上充 分研磨成匀浆 10,000rpm、4℃离心 20min 上清液全部转入小量筒中，准确 记下体积
* 酶活力测定 * 蛋白质测定（考马斯亮蓝Байду номын сангаас-250染色法）
结果计算
• PAL活力计算
酶液中PAL总活力计算（以“活力单位”表示）； 植物样品中PAL活力计算（以“活力单位· -1鲜重” 克 表示）。
• 蛋白质含量计算
用统计方法求出回归方程,计算酶液中蛋白质的总量（以“毫 克.ml-1”表示）。
• PAL比活力计算
酶液PAL比活力：（以“活力单位· 毫克-1蛋白质”表示）