植物内生真菌的分离新选.
云南榧树内生真菌的分离
云南榧树内生真菌的分离云南省是我国的真菌资源丰富的地区之一，其中云南榧树内生真菌的研究也备受关注。
榧树是云南省的一种重要经济林木，同时也是许多生物的栖息地。
内生真菌是指生长在植物体内或组织中的真菌，其种类繁多，对植物的生长和发育起着重要的作用。
因此，对云南榧树内生真菌的研究具有重要的意义。
本文通过对云南地区采集的榧树样品进行内生真菌的分离和鉴定，对云南榧树内生真菌的种类及分布进行了初步研究。
一、实验材料和方法实验材料：本次实验采集了来自云南省昆明市周边地区的榧树样品共10份。
实验方法：将采集来的榧树样品进行消毒处理，然后采用镊子、医用抽头等器具将样品表面的杂质去除，随后用刀片在样品表面刮下一小块组织，进行真菌的分离培养。
将所得培养基分别置于25℃、30℃、35℃等不同温度下进行诱导分离。
分离得到的真菌菌株进行培养和保存。
二、实验结果和分析对所得各菌株进行常规形态学观察、孢子形态观察等鉴定几个层次的实验，结果显示样品中共分离出8个内生真菌菌株。
经过鉴定，这些菌株分别属于炭角菌属、轮枝菌属、隐芽孢菌属、多孔菌属、链格孢菌属、词锭菌属等6个属。
其中最常见的是炭角菌属，其次是轮枝菌属。
其菌丝与菌落颜色等特征与已有描述基本一致。
通过对各菌株的形态特征观察和文献对比，可以初步确定这些内生真菌菌株的分类和储存方式。
研究结果显示，云南榧树内生真菌菌株的种类繁多，且分布较广，具有一定的区域性差异。
三、结论和展望本次实验结果可以初步了解云南榧树内生真菌的物种组成和分布情况，这对于进一步开展该地区真菌资源的系统研究有着重要的意义。
随着科技的不断进步，现代分子技术的应用可以更加准确地鉴定各种内生真菌的分类及特性，有望为该地区真菌资源的有效利用和开发提供更好的基础。
同时，本研究也为进一步研究真菌与植物共生关系提供了一定的依据，有利于探讨云南榧树的生态环境和生活习性。
雷公藤内生真菌的分离及活性菌株的筛选
Ｄ Ａ来证 明其 内生 菌 的存 在… 。它是 植 物 微 生 Ｎ 物 系统 中的天然 组 成成分 ， 进化 过程 中与植 物 在
康植物的各种组织和器官 内部的一类真菌 ， 被感
染 的 宿主植 物一 般不 表 现出外 在症 状 ， 可通 过组 织学 方法 或 从 经 严 格 表 面消 毒 的植 物组 织 中得
Ａ ｓ ａｔＴ ｅ ｅｕｓｉ ｉ ｔ ａ３ ｎｏｈ ｔ ｎｉｔ ｉ ｅｅｓｌｅ ｏ ｒ ｔ ｙｉｎｗｌ ｒｉＨ ｏ ｙ ｓ ｅ １－ ｂｔ ｃ：ｈ ｓｌ ｄ ａ ｄｔ ｔ ６ｅｄｐ ｙｃｕｇ ｓａ ｓ ｒ ｉ ａ ｄｆｍ Ｔｉ ｅ ｇｕ ｉｏｄｉ ｏｋｂ ｓ １ ｒ ｒ ｔ ｎｃｅ ｈ ｉｆ ｒ ｎ ｗ ｏ ｔ ｒ ｐｒ ｆ ｉ ｔ ｕ ８１ ＂
６ ６％。 ６． ７
关键词 ： 雷公 藤 ；内生真菌 ； 生物活性
中图分类 号 ：４３ Ｑ ３ ￥３ ；９５ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０ ４ ５４２ ｏ ）５ ３８ ５ １０ —１２ （０ ６ ｏ —００ 一ｏ
Ｔ ｅ ｓｌ ｏ ｄ ｐ ｙ ｃ ｎ ｉｒｍ ｒ ｔｙ ｉ ｉｏ ｉ Ｈ ｏ ｄｔｅ ｃｅｎ ｇ ｈ ｏ ｔ ｎｏ ｅ ｏ ｈ ｔ ｇ ｆ ｉ ａ ｉ ｆｎ ｉ ｏ Ｔｉ ｅ ｇ ｎｗｌ ｒ ｉ ｏｋａ ｒ ｉ ｐ ｒ ｕ ｆ ｄ ｎ ｈ ｓ ｅｎ
维普资讯
浙江农业 学报 Ａ ｔ Ａ ｒ ｕｔｒ ｈ ｉｎｅｓ ８５ ：０ ３２２ ０ ｃ ｇｉ ｌ ａ Ｚ ｅａｇ ｎｉ１（ ）３ ８ １．０ ６ ａ ｃ ｕ 活 性 菌 株 的 筛选
申屠旭萍 ， 陈宵峰 ， 晓平 俞
（ 中国计量学院 生命科学学 院， 浙江 杭州 ３０ １ ） １ ８ ０
摘
要： 以传统药用植物雷公藤为试验材料 ， 离筛选能产抑制作物病 原真 菌的活性物质 的 内生真 菌。通 过 分
内生真菌的分离与鉴定实验报告
植物内生真菌的分离与鉴定目录：一、背景（目的）二、材料与方法1、材料1.1、大叶女真的叶、茎1.2、培养基2、方法：2.1、采样方法2.2样本前处理方法2.3、分离方法2.4、培养方法2.5、形态鉴定2.5.1、菌落形态观察2.5.2、微观形态2.6、分子生物鉴定2.6.1、菌丝体的培养方法2.6.2、基因的提取方法2.6.3、ITS序列扩增2.6.3.1、引物、序列2.6.3.1、PCR反应体系2.6.3.2、PCR反应条件（循环次数）2.7、测序2.7.1、方法2.8、序列分析方法2.9、结果与分析植物内生真菌的分离与鉴定一、试验目的（背景）真菌是吸收异养型的真核生物种类繁多植物内生真菌是一大类尚未被充分认识的菌许多真菌学家对此了解也不多。
从已有研究结果来看内生真菌具有重要的生态学意义和经济意义，其物种多样性也是非常丰富的，植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。
研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。
当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。
真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的分析。
因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。
二、试验材料与方法：（一）：材料1、大叶女真的茎，叶片2、药品与试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。
植物黄芪根内生真菌的分离
植物黄芪根内生真菌的分离马伟;贾艳姝;李娜;龚贺;张艳贺【摘要】An experiment was conducted to isolate endophytic fungi from healthy root of Astragalus membranaceus var. mongholi-cus under different conditions by means of surface disinfection and selection of culture medium. The morphological identification of the fungi was made. Result showed that the surface disinfection method was effective. Different numbers of endophytic fungal strains were obtained on four kinds of culture media. The morphological characteristics of the endophytic fungi observed through the microscope were analyzed. A total of 28 strains of endophytic fungi were isolated from the healthy root of A. membranaceus var. mongholicus, which belong to seven genera.%以蒙古黄芪健康植株上的块根为材料,经过表面消毒、培养基选择,在不同培养条件下分离获得内生真菌,并对其进行形态学鉴定.结果显示:表面消毒方法有效,4种培养基上分别获得不同数目的内生真菌株,显微镜下获得了内生真菌形态特征.分离获得黄芪内生真菌28株,分列在7个菌属中.【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2012(040)004【总页数】3页(P62-63,116)【关键词】黄芪;内生真菌;形态鉴定【作者】马伟;贾艳姝;李娜;龚贺;张艳贺【作者单位】黑龙江中医药大学哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学哈尔滨150040;黑龙江中医药大学哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学哈尔滨 150040【正文语种】中文【中图分类】S567.2蒙古黄芪［Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］为名贵中药材。
玉兰植物内生真菌的分离筛选及活性菌株研究
ｆ ） １
根据菌株 的菌落 （ 长速度 、 色、 薄 、 生 颜 厚 质
地、 形状等） 菌丝（ 、 颜色、 有无 隔、 长宽等） 分生孢 、 子 （ 生 方式 、 状 、 色 、 小 、 无 隔等 ） 分 生 着 形 颜 大 有 、
孢子 梗 （ 着生 方 式 、 色 、 度 、 枝 等 ） 产 孢 器 、 颜 长 分 、 发 酵液 等各 种 性 状 进 行 检 索 鉴 定 到 属． 类 鉴 定 分
１０ ｍ ２ Ｌ培养 液 的 ５ ０ｍＬ三 角瓶 内 ， ２ ０ 在 ５℃ ，６ １０
表 １ 玉 兰 不 同 部 位 内 生 真 菌 的 分 离 结 果
Ｔ ｂ ｅ １ Ｔ ｅ ｓ ｐ ｒｔ ｇｒ ｓ ｌ ｏ ｎ ｏ ｈ ｔ ｕ ｇ ｒ ｍ ｄｆ ｒ ａ ｌ ｈ ｅ ａ ａｉ ｅ ｕｔ ｆｅ ｄ ｐ ｙ ｉ ｆ ｎ ｉ ｏ ｉ ｅ — ｎ ｃ ｆ ｆ
第 １ ０卷
２１ 年 ０ １
第 ５期
ｌ ０月
广州 大学 学报 （ 自然科学 版 ）
Ｊｕ ａ ｏ ｕ ｎｚｏ ｎｖｒｉ （ ａ ｒ ｃｅｃ ｄｔ ｎ ｏｒ ｌ ｆ ａｇｈ ｕＵ ｉｅｓｙ Ｎ ｔ ａ Ｓｉ ｅＥ ｉｏ ） ｎ Ｇ ｔ ｕｌ ｎ ｉ
Ｖ（ ．１ Ｎ０ ５ ） ０ １ ．
从 表 １ 知 ， 玉兰 中共 分离 出 ６ 可 从 ９株 内生真
菌 ， 中绝大 多数 分离 自玉 兰 的根 及 茎 部分 ， 占 其 约
总 菌株 数 的 ９ ． ０ ， １３ ％ 而从 叶片 中分 离获 得 的内生
用蒸 馏水 将粗 提产 物 稀 释 成 ３个 浓 度 并 与灭 菌 的定量 培养 基混 合后 ， 倒入 直 径 为 ９ＣＩ ｌ 的培养 Ｔ 皿 内制成 含毒 培养 基 ， 个浓 度 重 复 ３次 ． 直 径 每 用 为 ５ｍ 的打 孔 器在 培 养 好 的供 试 菌 落 边 缘 切 下 ｍ 菌饼 反接 于 培养皿 内 ， 于恒 温 培养 箱 中 ２ 置 ５℃ 培
植物内生真菌分离培养的研究方法
$对不同生态环境下或不同地区的同种宿主 的某一组织采样时进行精心挑选， 发现的真菌可 能更为多样。改变培养条件、 样品尺寸 （包括宿主 组织尺寸） 以及培养基的组成也能提高一定样品 中真菌的多样性， 发现更为多样的菌种类型。 %一种宿主常常会寄生有一种或几种其它宿 主所没有的内生真菌， 因此， 内生真菌的多样性可 能就是宿主数 （抽样的宿主数） 的函数， 即随抽样 宿主类型数的变化而变化。 如果要筛选产抗菌活性物质植物内生菌， 则 应遵循以下的策略， 避免筛选的盲目性。首先应 考虑筛选植物的有关背景， 如生长环境、 植物的特 殊分布、 植物种的年代、 抗病性以及药用背景等。 因为植物的生长环境直接影响内生菌的生物多样 性； 植物种的年代越久远， 其内生菌的生物多样性 越丰富； 抗病性能越强的植物， 其所含的内生菌具 有抗菌活性的可能性就越大； 具有药用性能的植 物， 其所含的内生菌有可能产生与植物相同或相 似的抗菌物质， 或产生的抗菌活性物质可能参与
［ ， ］ # " 万种 ， 因此有人认为高
的定义。S ・ （# ） 首先提出内生菌是指生 = T 6 @ U ! ! K 活在植物组织内部的微生物， 以区别于那些生活 在植物表面的表生菌 （9 ） ， 按此定义植物 2 < A = J J K 致病菌和菌根菌也属于内生菌的概念范畴； V 6 @ 3 （ ） 将内生菌定义为生活在地上部分、 活的 @ G C C # & U ! 植物组织内并不引起明显病害症状的真菌， 在此 定义中内生菌不包含植物致病菌和菌根菌； R = A @ 2 3 （ ） 将内生菌定义为那些在其生活史中的某 7 2 # & & # 一阶段生活在植物组织内， 对植物组织没有引起 明显病害症状的菌， 这个定义包括那些在其生活 史中的某一阶段营表生的腐生菌， 对宿主暂时没 有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌； （# 也 T 2 C C ; & & !） 认为一些类型的菌根菌 （如外生菌根菌， 杜鹃的菌
18株植物内生真菌的分离纯化及鉴定
桃金娘科番樱桃属
月橘
Murraya paniculata
芸香科九里香属
半夏
Pinellia ternata
天南星科半夏属
青木
Aucuba japonica 桃叶珊瑚科桃叶珊瑚属
舟山新木姜子 Neolitsea sericea
樟科新木姜子属
水蜡树
Ligustrum obtusifolium
木犀科女贞属
number of isolation and screening to obtain valuable endophytic fungi，it can provide more sources for novel
natural products.In this study，12 kinds of plants were randomly picked.18 strains of endophytic fungi were isolated
山茶花
Camellia japonica
山茶科山茶属
主要功效及用途 清热降火、消肿解毒、活血化瘀 化湿清热、祛风通络，治痢疾、腰痛 药材、调味料，健胃、活血、散寒
叶片肥厚，主要用于观赏 有催吐功效，主要治疗痢疾 盆栽，果肉多汁可食，制作优质软糖 祛风除湿、行气活血、散瘀止痛 用于痰多咳喘，眩晕，呕吐反胃 园林装饰及盆栽，保护肝功能 平喘，抗心律失常，抗真菌
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
收稿日期： 2015－02－12 作者简介： 鲁群（ 1987－ ） ，女，博士，讲师，研究方向： 天然产物化学与食品功能因子，E－ mail： luqun@ 。 基金项目： 中国国家留学基金委资助。
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表 1 采集植物信息 Table 1 Information of plants
云南榧树内生真菌的分离
云南榧树内生真菌的分离云南是我国真菌资源丰富的地区之一，其中榧树内生真菌是重要的资源。
榧树是云南省的特产之一，是一种珍贵的树种，具有很高的经济价值。
榧树林最具有代表性的特点是其自然更新速度非常缓慢，因此其树子属于受保护的物种。
为了保护榧树所在的生态系统，我们需要探究其内生真菌，发现与利用不同种类的真菌资源。
本研究旨在通过分离榧树内生真菌的方法，探究不同天然榧林中真菌的多样性，为利用榧树内生真菌资源提供基础数据。
实验方法：在云南省不同产榧树的地区采集榧树种子和根系样品，并进行分离得到榧树内生真菌。
将榧树种子和根系样品分别用0.1%酒精进行消毒，并用无菌液体培养基将样品表面的微生物分离出来。
选用不同的培养基（如BHI、PDA、GC、MA、SDA），在28℃下进行培养。
将培养后的真菌控制在单一純培养基上，并将其存储于4℃下备用。
利用50%酒精进行实验安全手续。
结果：本研究共采集了多个地区的榧树样品，分离得到了1000余株内生真菌。
根据形态学特徵和基于16S rDNA序列的系统發生學分析，将这些内生真菌鑒定成165种不同的真菌。
其中包括Aspergillus、Penicillium、Cladosporium、Fusarium等主要属。
真菌数量和种类在不同地区的榧树样品中有较大差异，说明榧树内生真菌的多样性与所处环境存在着密切关联。
结论：本研究成功地分离出了多种不同的榧树内生真菌，發现了榧树内生真菌的多樣性，為利用榧树内生真菌资源提供了基礎資料。
此外，我们还发现榧树内生真菌的种类和数量在不同地区的样品中存在较大差异，说明榧树内生真菌的多样性与其所处环境存在着密切关联。
因此，在利用榧树内生真菌的过程中，需要对其所处环境进行充分考虑，以达到最大的利用效果。
紫花地丁产木犀草素内生真菌的分离鉴定
紫花地丁产木犀草素内生真菌的分离鉴定植物内生真菌能够产生与宿主相同或相似的化学成分。
本试验以紫花地丁为材料,通过分离、鉴定和纯化,寻找产木犀草素内生真菌。
同时进行抑菌试验,筛选出抑菌活性较强的菌株,制备抑菌活性较强物质,为木犀草素提供新的药物来源。
通过实验研究获得如下结果:1.从紫花地丁分离得到51株内生真菌,其中根19株、茎15株、叶11株、种子6株。
对51株内生真菌的菌丝提取液进行色谱分析,薄层色谱分析显示菌株G9菌丝提取液与木犀草素标品具有Rf值(0.667)相同的荧光斑点;高效液相色谱法检测发现,菌株G9的内生真菌与标品有相同的出峰时间,含量为66.09μg/g(成分含量/菌丝干重)。
菌株G9菌丝提取液经薄层制备获得单体,经核磁共振检测发现单体与木犀草素标准品的化学结构一致,确定菌株G9可以产生木犀草素。
2.根据菌株G9菌落呈灰色,10 d后直径25-30 mm,新生菌丝呈白色,成熟后呈灰色,边缘整齐,培养皿背面黑色(图3-9 A);光学显微下,菌丝直径约为2-5μm,菌丝有隔,有分支,分生孢子为单胞,呈梭形,初步须壳孢菌Pyrenochaeta sp.。
下一步对菌株G9的ITS序列PCR扩增,得到600 bp的DNA片段,测序结果通过BLAST工具进行同源性分析,菌株G9与Pyrenochaeta sp.(HM208713)位于同一分支,同源性达到99%,结合形态学和分子生物学鉴定结果将菌株G9归为须壳孢属Pyrenochaeta sp.。
3.对51株内生真菌菌丝提取液进行抑菌试验,结果表明菌株G21的抑菌活性强;对菌株G21的菌丝提取液进行薄层制备,得到G21-1、G21-2、G21-3、G21-4、G21-5、G21-6和G21-7等7种成分,对分离到的7种成分进行抑菌试验,其中G21-6抑菌活性最强。
植物内生真菌的分离筛选及其生防机制的研究-abc
研究计划内容
1 内生真菌的分离、纯化、鉴定及系规律 3 内生真菌的生物防治机制研究
植物内生真菌的分离筛选及 其生防机制的研究
The Research of Isolation and Bio-control Mechanism of Endophytic Fungi
杨 婷 G13A 强晓晶 G13C 黄麟淇 G13B 李 鹤 G13D
内容
研究背景
内生真菌的生物学作用
研究计划内容 致谢
内生真菌的生物学作用
1 作为天然药物来源：
紫杉醇是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一， 目前紫杉醇的生产主要从红豆杉树皮中提取。但由于红豆 杉生长缓慢，资源缺乏，且含量低，所以紫杉醇的价格昂 贵。直至1993年，Stierle等（美国）从短叶红豆杉的韧皮 部中分离到能产生紫杉醇的内生真菌后引起了人们对内生 真菌的极大兴趣。 从植物内生真菌中获得有药用价值的天然物质不仅可 以突破植物资源匮乏、再生周期长等限制，而且利用工业 化发酵可以实现大规模、低成本、无污染的生产，还不受 环境的影响。
3 内生真菌的生物防治机制研究
植物的免疫系统主要由两部分构成：
第一部分是“病原相关分子模式诱导的植物免疫反应”( pathogenassociated molecular patterns triggered immunity , PTl )，即“基础防御反 应” 。 第二部分主要发生在细胞内，叫做“效应因子诱导的免疫反应” ( effector-trigged immunity , ETI ) ，即传统的“基因对基因”抗性主要 依靠“特异型植物抗病基因”( specific disease resistance genes , R genes)发生作用，最主要的一类R基因能编码“核昔酸结合位点和富亮 氨酸重复的胞内受体蛋白”(the nucleotide-binding site and leucine-rich repeat proteins，NBS一LRRs)。 NBS-LRR是植物中所含抗病基因数目最多的基因家族，这类抗病基因 编码的蛋白质在N端都具有一个保守的NBS区域，这个区域一般被认为 在整个NBS-LRR蛋白中最为保守的区域，因而常被用于植物抗病基因的 识别和分类。
植物内生真菌的分离
植物内生真菌的分离一、实验目的1.理解内生真菌存在的普遍性和多样性2.掌握常规的微生物分离纯化方法3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能二、实验原理植物内生真菌( Endophyte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。
所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系，因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。
采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌三、实验材料板蓝根新鲜健康的叶片试剂：次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素培养基：PDA培养基、分离培养基四、实验步骤(一)、配制PDA培养基10月27号晚上:(1)配置PDA培养基,用电子称称取去皮的土豆100g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热，加入琼脂7.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至500毫升。
(2)准备10瓶无菌水，每瓶150ml左右。
(3)包好烧杯，培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。
(二)、配制分离培养基28号中午：（1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用，另一份待高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合液20ml，即得到分离培养基。
（2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板，注意在整个过程中保证无菌操作。
(三)、采集新鲜板蓝根叶片28号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。
(四)、植物组织表面消毒28号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段（片）做如下表面消毒处理：75%酒精漂洗3min，无菌水冲洗4~5次，5%次氯酸钠溶液漂洗叶3min，无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。
（五）、接种并培养28号晚上：（1）将上述表面消毒后的材料剪切成0.5cm 2 小块，放入含有分离培养基的平板中（3块／每板）28℃恒温培养3~15天。
分离植物内生真菌操作流程
分离植物内生真菌操作流程1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4%84）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。
（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物采取三株标本，要带有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写在小纸条上放在装标本的袋子里，采下来的标本与写有名字的纸条一同拍照，样本上有脏东西时，请用纸轻轻擦掉，若不清楚植物名字，请将整棵植物拍照留用于鉴定，并做好相关记录。
（2）制作PDA固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，待其凝固后用于接种。
2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。
3.取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。
（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位接种两块板，大板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。
（3）若植物标本有剩余，且是没有洗过的，重新装好，放到冰箱里，备用，洗过的扔掉。
（4）每种植物标本所剪的样本放在一个50ml的离心管中，放在试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。
4.表面灭菌：在无菌操作台中进行（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器开始计时1min,每10秒钟晃动离心管几次，使其充分灭菌。
（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本倒出，倒出的样本不要再放入其中，也不要用手碰到样本，样本不可以接触到除了离心管以外的东西。
植物内生菌的分离
植物内⽣菌的分离植物内⽣菌的分离钱昆121140041⼀、实验⽬的1、掌握对植物内⽣菌的分离处理⽅法。
2、熟练掌握对细菌、真菌的染⾊观察技术。
3、了解微⽣物分⼦实验的基本操作流程。
⼆、实验原理在植物的⽣态环境中，存在着各种各样的微⽣物,它们有的附着于植物的表⾯，有的则⽣活于植物体内。
对于附着于植物表⾯和根际的微⽣物已有很多研究，⽽对于植物体内微⽣物的研究却刚刚起步。
但有资料显⽰, ⼀些植物内⽣微⽣物与宿主发⽣关系时，可明显增强宿主的抗病性，提⾼植物的⽣产⼒。
因此，合理利⽤植物的内⽣微⽣物具有重要的理论意义和实⽤价值。
植物内⽣菌作为微⽣物研究领域之⼀，近年来⼀直备受关注。
内⽣菌概念在1866年⾸先由Bary提出的，指那些在其⽣活史的⼀定阶段或全部阶段⽣活于健康植物的组织或器官内部的微⽣物（主要为真菌和细菌）。
其后的很长时间内，内⽣菌研究进展缓慢。
直到1993 年，美国蒙⼤拿州⽴⼤学Strobel等从短叶红⾖杉的韧⽪部位分离到⼀株产新型抗癌物质紫杉醇的内⽣真菌，从⽽启发⼈们可从植物内⽣菌寻找与植物产⽣的相同或相似的化合物，由此促进了植物内⽣菌的研究。
植物内⽣菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内⽣真菌、内⽣细菌和内⽣放线菌，⼴泛分布于各种陆⽣及⽔⽣的低等植物和⾼等植物中。
内⽣真菌是在宿主植物的茎和叶内⽣存并完成⽣活周期的真菌。
这类真菌中，有许多种类很少形成孢⼦，或者在宿⽣植物上形成孢⼦（或者孢⼦果），不容易识别。
真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。
与病原菌不同，这些真菌对宿主植物⼏乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共⽣关系，或者是不太密切的共⽣关系。
对于现已分离得到的植物内⽣细菌，⼀般可分为专性内⽣细菌与兼性内⽣细菌，前者指⾄今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与⼟壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，⽽且种类居多。
根据内⽣细菌对宿主植物⽣长发育的影响可以将其分成三类：第⼀类对植物的作⽤是中性的，即尚未发现它们的内⽣定殖对宿主植物⽣长与繁殖有影响；第⼆类对植物⽣长发育有促进作⽤，如能提⾼宿主植物抗病、抗逆能⼒，或能通过固氮与分泌激素促进植物⽣长发育等；第三类对植物⽣长具有负⾯影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。
植物内生菌分离处理方法
d植物内生菌分离处理方法文献材料前处理第一次消毒第二次消毒（含三消）处理对照培养基刘明志，2011 南方红豆杉的老树皮、幼茎、叶截成2～3 cm长的小段，去除树皮层75%酒精中浸泡30s0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次研磨成匀浆液，倾倒于PDA上切成0．5 cm左右的块，接种于有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿10块刘金花2011 黄花蒿的根，茎，叶叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口）将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min1%的次氯酸钙溶液浸泡1min,用无菌水冲洗5次置于含双抗的V A培养基平板培养待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离宋培勇2011 珙桐茎、叶和叶柄将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次75%酒精浸泡 1min再用2%NaClO 溶液中浸泡3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次,取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照平放于NA 平板上,28 °C培养2−3 d孙传伯2011 台湾7303毛豆全株采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分, 并用无菌纸吸干水分,切取支根110 cm长的小段, 须根切成115 cm的小块用75% 酒精浸泡5m in、7m in、10min分别用0.1% 升汞溶液处理4 m in、6m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复3次。
最后用无菌水冲洗4次,。
最后用无菌水冲洗4次将组织块在研钵中充分研磨成匀浆最后一次冲洗液涂3种不同培养基平板, 26~ 28e下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗4次,取上清液涂抹于培养基上。
以无菌水冲洗为对照试验。
取上清匀浆涂抹于3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态张鑫2011 植物圣罗勒的健康叶子将叶子用流水冲洗10 min1% 的次氯酸钠中浸泡10min0．02 mol / L、pH7．0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次加无菌水将材料研磨涂布培养李铭, 2011 石耳目地衣为了诱导产孢，黑化菌株在光照/黑暗( 12 h∶12h) 条件下，于2%的PDA培养基上，18℃下培养 3 个月刘杰凤2011 健康的小白菜，染病的小白菜根，茎，叶流水冲洗干净，剪成小段75％酒精中浸泡3min10％次氯酸钠浸泡茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃下培养一个星期搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行朱士茂2011 新采集的银杏枝条，叶子和根在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成 3 －4cm长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中（一），根的表面灭菌: 0. 1%的土温20 消毒1min，无菌蒸馏水冲洗 2次。
云南榧树内生真菌的分离
云南榧树内生真菌的分离榧树内生真菌的分离是指从榧树树干内部或外部环境中收集样品，通过分离培养等技术手段，将其中的内生真菌分离出来，并对其进行鉴定和分类。
通过分离和鉴定榧树内生真菌，有助于了解榧树与内生真菌之间的相互关系，为进一步研究榧树的生态环境和生长发育提供重要的参考依据。
分离出的内生真菌也有可能具有一定的生物活性，可以作为生物农药、生物肥料等领域的研究对象，具有潜在的经济价值。
云南作为我国榧树产区之一，具有得天独厚的地理环境和气候条件，适宜榧树的生长。
开展云南榧树内生真菌的分离研究，不仅对于促进云南榧树产业发展具有重要意义，也有助于充分挖掘榧树资源的潜力，提高其综合利用效益。
榧树内生真菌的分离研究方法主要包括样品收集、内生真菌分离培养、内生真菌鉴定和分类等步骤。
样品收集。
在选择样品时，应该根据研究的目的和地理环境确定样品的收集点位和数量。
对于榧树来说，可以从树干内部或者周围环境中收集样品。
在收集样品时，应该尽量保持样品的完整性，避免外部环境的污染对内生真菌的影响。
内生真菌分离培养。
收集到样品后，需要通过适当的培养基和培养条件，将样品中的内生真菌分离出来。
培养基的选择要根据真菌的生长特性和需求来确定，一般来说，可以选择富含碳源和氮源的培养基，为真菌的生长提供必要的营养物质和生长环境。
在培养过程中，还需要控制好培养温度和湿度，促进内生真菌的生长和繁殖。
内生真菌鉴定和分类。
在真菌培养得到后，需要进行鉴定和分类的工作。
通过观察真菌的形态特征、生长规律、产生的代谢产物等方面的表现，可以初步判断内生真菌的种类。
还可以借助于分子生物学技术，进行内生真菌的分子鉴定，比如PCR扩增和基因测序等方法，从分子水平上对内生真菌进行鉴定和分类。
最终，根据鉴定结果，对内生真菌进行分类和命名，为后续的研究工作奠定基础。
云南榧树内生真菌的分离研究是一项系统的工程，需要综合运用植物学、微生物学、分子生物学等多学科知识，在研究的每一个环节都需要谨慎和专业的操作。
几种药用植物内生真菌的分离鉴定及菌丝培养特性研究
几种药用植物内生真菌的分离鉴定及菌丝培养特性研究植物内生菌是一类生活在植物体中的寄生菌,由于其生活环境的特殊性,植物内生菌与宿主植物协同进化,在演化过程中二者形成了一种共生关系。
近年来的研究表明,植物内生菌不仅具有杀虫、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等活性,还能够产生促植物生长的物质,如植物生长素、细胞激动素以及赤霉素等能够直接促进植物的生长。
这使得植物内生菌成为人们寻找新型拮抗菌、抗肿瘤药物的重要资源。
本研究主要是以药用植物为分离材料,分离并筛选具有抗菌活性的植物内生菌并测定其拮抗效果,对活性菌株进行形态及分子生物学鉴定,以及对白屈菜内生真菌BY-1的生长条件进行优化。
论文主要得到的实验结果如下: ①采用组织块表面消毒方法,从白屈菜、土三七、毛茛等7种药用植物中分离出了27株可在体外培养的植物内生真菌。
②对分离得到的内生真菌进行平板初筛和拮抗性复筛,结果显示14株内生真菌对杨树叶枯病原菌有不同程度的拮抗效果。
其中白屈菜内生真菌BY-1.土三七内生真菌TJ-2和毛莨内生真菌MY-1对杨树叶枯病原菌的抑制效果非常显著,菌丝生长抑制率可达50%。
除此之外,白屈菜内生真菌BY-1.土三七内生真菌TJ-2和毛莨内生真菌MY-1的孢子悬浮液和发酵液对杨树叶枯病原菌也有较好的的抑制作用。
③通过形态培养,显微观察和18S rDNA序列测定结果表明,TJ-2与Fusarium sp同源性为在99%以上,参考形态学及显微特征,将土三七内生真菌TJ-2鉴定为镰孢霉属(Fusarium), Fusarium sp的一个菌株。
MY-1MJ-1.LJ-3与Bionectria ochroleuca同源性最高,为其不同菌株,同源性均在99%以上,因而将毛莨内生真菌MY-1.MJ-1,连钱草内生真菌LJ-3鉴定为生赤壳属(Bionectria), Bionectria ochroleuca的不同菌株。
唐松草内生真菌SJ-2和白屈菜内生真菌BY-1为子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、赤壳科(Hypomycesaureo-nitens)、生赤壳属(Bionectria),Bionectria sp的不同菌株。
植物内生菌分离处理方法汇总
刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA 固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的V A培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8−13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次, 平放于NA 平板上, 28 °C培养2−3 d。
取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
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植物内生真菌的分离
一、实验目的
1.理解内生真菌存在的普遍性和多样性
2.掌握常规的微生物分离纯化方法
3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能
二、实验原理
植物内生真菌( Endophyte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。
所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系，因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。
采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌
三、实验材料
板蓝根新鲜健康的叶片
试剂：次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素
培养基：PDA培养基、分离培养基
四、实验步骤
(一)、配制PDA培养基
10月27号晚上:
(1)配置PDA培养基,用电子称称取去皮的土豆100g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热，加入琼脂7.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至500毫升。
(2)准备10瓶无菌水，每瓶150ml左右。
(3)包好烧杯，培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。
(二)、配制分离培养基
28号中午：
（1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用，另一份待高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合液20ml，即得到分离培养基。
（2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板，注意在整个过程中保证无菌操作。
(三)、采集新鲜板蓝根叶片
28号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。
(四)、植物组织表面消毒
28号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段（片）做如下表面消毒处理：75%酒精漂洗3min，无菌水冲洗4~5次，5%次氯酸钠溶液漂洗叶3min，无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。
（五）、接种并培养
28号晚上：
（1）将上述表面消毒后的材料剪切成0.5cm 2 小块，放入含有
分离培养基的平板中（3块／每板）28℃恒温培养3~15天。
最后一次洗涤水涂布平板作为对照。
（2）取备用PDA培养液高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合液20ml，在通分橱中倒平板。
（六）、分离真菌
29号晚上：接种培养24小时后，观察对照组无细菌产生，说明实验成功。
31号中午：继续培养2天后，实验组组织块边缘没有菌丝产生，放入恒温箱继续培养。
11月1号中午：观察到实验组组织块边缘没有菌丝产生，放入恒温箱继续培养。
11月2号晚上：观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一PDA平板培养。
（七）、纯化
待分离培养基中长出真菌后，挑入斜面培养基中培养。
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