植物内生真菌的分离新选.

植物内生真菌的分离

一、实验目的

1.理解内生真菌存在的普遍性和多样性

2.掌握常规的微生物分离纯化方法

3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能

二、实验原理

植物内生真菌( Endophyte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系，因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。

采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌

三、实验材料

板蓝根新鲜健康的叶片

试剂：次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素

培养基：PDA培养基、分离培养基

四、实验步骤

(一)、配制PDA培养基

10月27号晚上:

(1)配置PDA培养基,用电子称称取去皮的土豆100g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热，加入琼脂7.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至500毫升。

(2)准备10瓶无菌水，每瓶150ml左右。

(3)包好烧杯，培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。

(二)、配制分离培养基

28号中午：

（1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用，另一份待高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合液20ml，即得到分离培养基。

（2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板，注意在整个过程中保证无菌操作。

(三)、采集新鲜板蓝根叶片

28号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。(四)、植物组织表面消毒

28号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段（片）做如下表面消毒处理：75%酒精漂洗3min，无菌水冲洗4~5次，5%次氯酸钠溶液漂洗叶3min，无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。

（五）、接种并培养

28号晚上：

（1）将上述表面消毒后的材料剪切成0.5cm 2 小块，放入含有

分离培养基的平板中（3块／每板）28℃恒温培养3~15天。最后一次洗涤水涂布平板作为对照。

（2）取备用PDA培养液高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合液20ml，在通分橱中倒平板。

（六）、分离真菌

29号晚上：接种培养24小时后，观察对照组无细菌产生，说明实验成功。

31号中午：继续培养2天后，实验组组织块边缘没有菌丝产生，放入恒温箱继续培养。

11月1号中午：观察到实验组组织块边缘没有菌丝产生，放入恒温箱继续培养。

11月2号晚上：观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一PDA平板培养。

（七）、纯化

待分离培养基中长出真菌后，挑入斜面培养基中培养。

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