真菌营养亲和群鉴定方法的改进

A bstrac t A regu lar m ethod to charac terize funga l vegeta tive co m pa tible g roups is to obse rve an tagon ism betw een two iso lates cultivated in a P etr i d ish. A lthough s i m p le and low cost , the m ethod is ex tre m ely ti m e consum ing and labori ous when testing a lot o f stra ins because of var ious co m binations o f one stra in w ith each o ther strain in a g roup. In o r der to reduce w ork load and raise efficiency , opti m ization of pa iring sty le was designed w ith this new approach seven iso lates can be paired in all possib le co m bina tions on three P etr i dishes and deter m ined the vegeta tive compatib le re la tions w ith clear results and sav ing m ate rials and ti me , and decrease the r isk o f contam ina tion during inocu la tion . K eywords fung ; i antagonism; m ethod i m provem ent
空间, 造成观察不便; 同一组的 7 个菌株实在是生 长速度差异比较大, 则可以先接种生长慢的菌株, 隔一段时间接种生长快的菌株。 参考文献:
[ 1] [ 2] Lesl ie JF. Fungal vegetat ive com patib ility[ J ] . A nnual R ev iew of Phytopathology, 1993, 31 : 127 -150 . G lass NL, Jacob son D J , Sh iu PK T. The genetics of hyphal fus ion and vegetative incom patib il ity in filam entou s ascomycete fung i [ J] . A nnual R eview of G enetics , 2000, 34 : 165 -186 . [ 3] [ 4] A n agnostak is SL. Ch estnu t bl igh t : The class ica l prob lem of an in troduced pathogen[ J] . M ycolog ia, 1987 , 79( 1 ): 23 -37. Bu rgess T, W ingfield BD, W ingf ield M J . C omparison of genotyp ic d ivers ity in nat ive and introduced populations of Sphaerop sis sapin ea isolated from P inu s rad ia ta [ J] . M ycolog ical R esearch , 2001 , 105 ( 11) : 1331 -1339. [ 5] V an H eerden SW, W ingf ield M J . G en et ic d iversity of Cryph one ctria cubensis isolates in South A frica [ J ]. M ycological R e search , 2001, 105( 1 ) : 94 -99. [ 6] K littich CJR, Leslie JF. N itrate reduction mu tants of F usa rium mon ilif or m e ( G ibberella fujikuroi ) [ J ] . G enetics , 1988, 118 ( 33) : 417 -423. [ 7] Sw ift CE. V egetat ive compat ib ility groups of Fu sarium oxys porum . f sp . cepae from on ion in C olorado[ J ] . Plant D isease , 2002 , 86 ( 6) : 606-610 . [ 8] K athryn M J , O rson KM, Bruce J T. R andom ly am p lified polymor ph ic DN A m arkers are superior to som at ic incom patib il ity tes ts for d iscri m inating genotypes in natural popu lat ion s of the ecto m ycorrh izal fungu s Suil lu s g ranula tus [ J] . PNA S , 1993 , 90 : 9159 -9163 .
微生物学杂志
2010 年 9 月第 30 卷 第 5 期
JOURNAL OF M ICROBIOLOGY Sept . 2010 V o . l 30 N o . 5
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真菌营养亲和群鉴定方法wenku.baidu.com改进
陈 强, 张金霞
*
(中国农业科学院 农业资源与农业区划研究所 , 北京
100081)
摘
要
真菌营养不亲和鉴定 的通常方法是将菌株两两对 接 , 观 察它们 之间是 否产生 拮抗反应 , 此 方法简单
采用图 1 的实验 设计, 7 个 菌株两两间的配 对接触次数见表 1 。能够保障每个菌株之间至少 1 次两两接触 , 完全能够正确反应出 7 个菌株之 间营养不亲和关系。实例证明 ( 如图 2), 采用 3 个培养皿就能判定 7个菌株两两之间的营养不亲 和性。
5期
陈强等 : 真菌营养亲和群鉴定方法的改进
基金项目 : 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( 3 -27 )
[ 1, 3 ]
。真菌 VCG 是研究物种起源、 进化和群
体分化的一种有效手段。应用营养不亲和反应可 用来鉴定菌株 , 特别是在食用菌生产实践中应用 比较广泛 , 一般认 为: 2 个菌株 对峙培养 , 若发生 营养不亲和反应, 则可以认定它们为不同的菌株; 若它们营养亲和, 则不能判定它们相同, 需要采用 其他方法进一步鉴定。在日本的香菇、 平菇、 肺形 侧 耳、 杏鲍菇、 毛木耳、 金针菇、 滑菇、 黄伞、 灰树
An Im proved M ethod to Characterize Fungal Vegetative Compatible G roup
CH EN Q iang , ZHANG Jin -x ia
( Inst. of Agric . R es . and R eg. P lan. , Chn. Acad. of Agric. S ci . , B eijing 100081)
真菌个体被认为属于相同的营养亲种群 ( vegeta t iv e com pat ib le g roup , VCG ) 。相反, 存在一个或 多个 het 或 vic 位点差异的个体不能融合 , 菌丝细 胞接触出现程序性死亡或凋亡的个体属于不同的 VCG 。某些真菌的菌丝分泌色素或颜色深 , 如 葡萄座腔菌 科 ( Bo tryosphaeriaceae ) 和 C ryphonec triaceae 科的多数种 , 菌 丝不能融合 , 在不同的个 体间能观察到一条沟带, 对于这些种而言 , 在培养
且成本低 , 但是因每个菌株要与其余菌株配对 , 若 测试菌株多 , 则工作量大 。 为了减 少工作量 , 提高效 率 , 将配 对方式加以优化 , 仅利用 3 个培养皿即可得到 7 个菌株之间的营养亲和关系 , 结 果直观清 晰 , 可以 大大减少工 作量 , 节省了材料和时间 , 并且降低了接 种过程中污染风险 。 关键词 真菌 ; 拮抗反应 ; 方法改进 Q 93-33 文献标识码 A 文章编号 1005- 7021( 2010) 05- 0045- 03 中图分类号
1 材料与方法
图 1 供试菌株接种点示意图
F ig. 1 Illustrat ion of sites of tested strains inocu lat ion
表 1 供试菌株接触次数
2 结
果
菌株 A B C D E F G
Tab le 1 A /
Pair t i m es of tested strain s B 3 / C 2 2 / D 2 2 1 / E 1 1 1 1 / F 3 2 1 2 3 / G 1 2 2 1 1 1 /
作者简介 : 陈强 男 , 助理研究员。研究方向为食用菌遗传及育种。 E -m ai: l hbchq iang @ yahoo. com. cn * 通讯作者。 Te: l 010 -82106207, E-m ai: l zhangjx1210 @ yahoo. com. cn 收稿日期 : 2010 -03-12; 修回日期 : 2010 -07-11
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图 2 香菇 7个菌株 营养不亲和反应
F ig. 2 V egetat ive com patib le relations of seven L entinu la edod es strain s 上 : 培养皿正面 ; 下 : 培养皿背面 U p: Top of the Petri d ishes ; D ow n : Bottom of the Petri dish es
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微
生
物
学
杂
志
30 卷
花、 斑玉蕈、 真姬菇、 荷叶离褶伞、 茶树菇和砖红离 褶伞 等 14 种 食 用 菌新 品 种 DU S ( D ist in ctness 、 Un iform ity、 Stability, 特异性、 一致性、 稳定性 ) 测试 指南中 , 营养不亲和反应均是测试项目之一。目 前鉴定营养亲和群的方法通常是将群体内的个体 两两配对, 观察个体的接触区域是否产生沟带或 分泌色素, 这个方法简单而且成本低 , 但是它的缺 点就是工作量大 , 1 个菌株要与群体中其他的每 个菌株两两配对 , 若有 N 个菌株 , 则需要的配对 是 CN 个, 当 N > 100 时 , 配 对 的 组合 数 超过 5 000 , 工作量非常大。本文改进配对方法, 减少配 对的工作量 , 大大减少培养皿和培养基的使用量, 节约材料和时间 , 提高配对效率。
2
1 . 1 材料的处理 以香 菇 L entinula edodes 为例 , 取 7 个 菌 株 241 、 879 、 892 、 898 、 910 、 917 、 923 , 将它们分别接种 PDA 培养基上, 25 1 . 2 试验设计 培养活化。
取 3 个装 有 PDA 培 养基 的培 养皿 ( 直径 9 cm ) 。剪一个边长 3 c m 的正六边形纸片 , 纸片中 心留有小孔。把纸片盖在培养皿底的外表面, 用 记号笔在培养皿底上标 记正六边形的顶 点和中 心。将菌株 241 、 879 、 892 、 898 、 910 、 917 、 923 按序 号从小到大重新依次命名为 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G, 按照图 1 的顺序 , 取相同大小的菌种块 ( 直径 0 . 4 cm 左右 ), 分别接种于 3个培养皿的相应的位置, 25 培养 , 培养皿正置。
[ 6-7] [ 4-5]
。而真 菌种内拥有相
同的 异 核 体 ( heterokaryon , het ) 或 营 养 不 亲 和 ( vegetat iv e i m com pat ib ility , vic ) 位点的个体 ( 基因 型 ) 能够融合形成异核体
[ 2]
, 能形成稳定异核体的
致 , 以防生长快的菌株侵占生长慢的菌株的生长
3 讨论与结论
采用本文设计的方法 , 在香菇、 平菇、 白灵菇 鉴定营养不亲和试验中得到了满意的效果, 大大 缩小了工作量。当菌株比较多时, 可以将 7 个菌 株为一组, 分成若干组 , 同时从每组中取出 1 个菌 株 , 组成新的一组 ( 若菌株不够 7 个 , 可以将菌株 重复若干次凑成 7 个 ) , 按照以上的方法 分别判 定组内菌株的营养亲和关系。假设菌株的营养亲 和关系是可以 类推的, 即菌株 A 分别与 B、 C亲 和 , 则推测 B 与 C 亲和。将营养亲和群内的菌株 只保留 1 个 , 与其他营养亲和关系未确定的菌株 一起, 按照以上的方法, 继续判断, 直到所有菌株 的营养亲和关系明确为止。由于并非所有的营养 亲和关 系都 能类 推, 在 点柄 粘盖 牛肝 菌 ( Suilus granu latu s ) 中 曾 发 现 组 织 分 离 物 VT 1993 与 VT 1990、 VT 1994 营养亲和 , 而 VT 1990 与 VT 1994 [ 8] 营养不亲和 。但是这种现象很少见 , 仍可以假 定营养亲和关系可以类推。对于推测营养亲和的 菌株, 再次配对即可验证。在运用此方法时, 要掌 握如下要点 : 若菌株生长速度慢 , 则需要把培养基 倒厚些; 若有条件, 可能用封口膜封口 , 以防培养 基失水过多而影响结果; 同一组的 7 个菌株, 尽量 挑选生长速度相近的菌株, 接种块大小尽可能一
真菌营养亲和现象反映的是同种群体内个体 的表型差异 ( 或相似性 )
[ 1]
皿上测试 它们 的亲 缘关 系 , 很 容易 确定 它们 的 VCG, 它可以为研究群体多样性提供一个有力的 视角 。对于菌丝的颜色浅的某些真菌, 如镰刀 菌 ( Fusarium ) 中的种, 属于不同 VCG 的个体间的 沟带很难辨认 , 它们需要构建 nit突变体才能确定 个体