噬菌体及其研究进展PPT

噬菌体及其应用
Contents
1
噬菌体简介
2
噬菌体应用技术简介
3
噬菌体在食品产业中的应用
4
前景及展望
1、噬菌体简介
❖ 概念：噬菌体是感染细菌、 真菌、螺旋体、支原体、 立克次体及放线菌等微生 物的病毒,属非细胞微生 物。
❖ 特性： ▪ 个体微小，需用电镜观察，
可以通过细菌滤器； ▪ 没有完整的细胞结构，由
大多数为线状双链 DNA噬菌体
少数为环状单链 多数为线状单链 RNA噬菌体 少数为线状双链
化学组成
❖ 核酸：DNA或RNA,基因组大小为2-200kb，某些噬菌体基因 组中还含有异常碱基。 大多数为线状双链 DNA噬菌体 少数为环状单链 多数为线状单链 RNA噬菌体 少数为线状双链
❖ 按与宿主的相互关系，噬菌体可以分为两种类型： 烈性噬菌体，温和噬菌体（溶原性噬菌体）
告噬菌体已经能够成功检测许多菌种，如
E.coli,Salmonella.spp 等 。
简介
利用荧光素酶基因作为报告基因的快速检测技术
对于细菌来说，发光机理可用下式表述：
F M N H 2+ R C H O + O 2 → F M N + H 2O + R C O O H + h ν(490nm)
❖ 在每格中央用灭菌的毛细滴管滴上O-I噬菌体, 待溶液干 后置37 ℃ 6-8 h 培养或过夜, 观察噬菌体裂解情况。
❖ 发现被O-I 噬菌体裂解的菌株, 马上挑取噬斑周围菌苔直 接做沙门氏菌A- F 多价血清凝集试验, 凝集阳性者即可 初步报告结果, 然后转种克氏双糖铁管作进一步鉴定分型。
简例
测定辐射剂量
鉴定细菌分型
预防和治疗 传染性疾病
应用
检测基因 产物的活性
检测病原菌
筛选目的基因
3、噬菌体在食品产业中的应用
❖ 食源性疾病病原的检测技术 ❖ 作为食品添加剂 ❖ 噬菌体展示技术检测真菌毒素
3.1食源性疾病病原的检测技术
食源性疾病病原的检测技术是食源性疾病的预防与控制的关 健的技术环节。数据显示，每年大约有7600 万人因食用了 受污染的食物而患病，其中91% 是由于细菌污染造成。
核酸和蛋白质组成； ▪ 专性活细胞内寄生,具有
严格的寄生特异性。
形态与结构
❖ 形态：蝌蚪形，微球形，细杆形
❖ 噬菌体颗粒在结构上有很
大差别，一般可分成三种
头部
类型，即
无尾部结构的二十面体，
有尾部结构的二十面体和
线状体，迄今已知的噬菌
尾部
体大多数是有尾部结构的
二十面体。
❖ 核酸：DNA或RNA,基因组大小为2-200kb，某些噬菌体基因 组中还含有异常碱基。
简介
A图只有细菌,荧光视野里不见任何发光物质;B图中只有荧光标记O-I噬菌体,视野 下偶尔可见量圆点状的荧光物质,不见菌形;C图是荧光标记O-I噬菌体和沙门氏 菌混合,可见大量杆状物,少量点状物,极少数彗星状杆状物,将杆状物质与沙门氏菌 的革兰氏染色形态进行比较,两者一致。 由此可推知,C图中杆形物是侵有荧光噬菌体的沙门氏菌,点状物是标记的O-I噬菌 体,结合B图可知彗星状杆形物是即将裂解的宿主菌。
反应是在荧光素酶的催化下进行的。细菌的荧光素酶是一个7 7 k D 的 二聚体，其中包含α亚基( 4 0 3 7 k D ) 和β亚基(37kD)。 目前，生物发光基因(lux,luc)在报告噬菌体检测技术中应用最为广泛。
❖ 该技术中，将一个报告基因通过噬菌体插入到目标菌体的 D N A 中，随着报告基因的表达，目标菌体便可快速得到 检测。
❖ 应用在这一技术的报告系统主要有原核生物和真核生物的 荧光素酶(lux,luc)基因，细菌冰核蛋白(inaW)基因，
E.coliβ- 半乳糖苷酶(lacZ)基因和生物素亲和蛋白。报
现存的检测方法包括传统的细菌分离培养法、多聚酶链式反 应(PCR)法、生物芯片技术和免疫学方法等。 缺点：费时费力、价格昂贵、特异性或灵敏度低、国内试剂 供应不配套等，很难适应公共卫生事件应急处理快速反应的 需要。
有必要寻找一种简捷、快速、灵敏度高的检测食源性病原微 生物的方法以及技术平台。
检测方法
❖ O-I噬菌体是作用于沙门氏菌属特异性噬菌体,染色体为双 链DNA,受体是宿主细胞壁上核心多糖的乙酰氨基葡萄糖。 应用O-I噬菌体进行饮食行业及公共场所从业人员带菌调 查结果表明, 沙门氏菌检出率为0. 131%, 与广东省报道 的0. 134%检出率相近, 说明O- I 噬菌体应用对沙门氏菌 的诊断具有较高的特异性和敏感性, 不失为大量从业人员 沙门氏菌调查的较为理想快速诊断方法。
3.1.2荧光染料标记法
❖ 原理：选用一种合适的染色剂，噬菌体的核酸染色标记，
然后用标记过的噬菌体侵染相应的宿主菌，噬菌体吸附在 宿主菌表面后，随即将标记过的核酸注入宿主细胞，随着 越来越多的噬菌体核酸的注入，细胞内荧光随着荧光素的 增多而增强，借助荧光显微镜便能判定宿主菌的存在，从 而实现病原菌的检测。
噬菌斑检测 荧光染料标记 报告基因检测
3.1.1噬菌斑检测
❖ 原理：用噬菌体截获某种 病原菌，随后病原菌被噬 菌体感染，用杀毒剂将胞 外的剩余噬菌体杀死，然 后将噬菌体与被感染细胞 混合并在装有软琼脂的双 层培养基上培养，被感染 的细胞破裂释放出子代噬 菌休，在培养基中就会形 成空斑。
实验方法
❖ 标本采集后置于SC 增菌管中37 ℃ 增菌18 h左右, SS 平 板分离培养37 ℃ 过夜, 然后挑出具有沙门氏菌特征的单 个菌落划线接种于普通琼脂平皿上, 每块平板划格后可接 种8 个菌落左右。
简例
❖ 蒋鲁岩等用此方法快速检测食品源沙门氏菌，检测灵敏度 达10 CFU/100μL;120份食品样品中沙门氏菌的O-I噬菌体 检测与生化鉴定结果的阳性率分别为9.17%和10%,符合率 为91.7%。表明用荧光标记的O-I噬菌体可以快速、直观、 准确、大量地检测食品中沙门氏菌。
3.1.3报告基因检测技术
烈性噬菌体:能在宿主菌内复制增殖，产生许多子代噬菌
体，并最终裂解细菌。
温和噬菌体（溶原性噬菌体）：噬菌体基因组整合于宿主 菌染色体中，不产生子代噬菌体，也不引起细菌裂解，但 噬菌体DNA随细菌基因组的复制而复制，并随细菌的分裂 而分配至子代细菌的基因组中。
烈
性
噬
菌
生物合成
体
的
装配
溶 菌
释放
周 期
2、噬菌体的应用技术