HDV核酶研究近况
酶工程第6章-脱氧核酶2012
图； 9.转染48h； 10. 转染60h； 11. 转染60h后的阴性对
照； 12. 转染72h。
利用核酶或脱氧核酶抑制有害基因的基本原理
对医疗应用来说最主要的还是寻找那些具 有切割特定RNA顺序的核酶，从而可以在体 内抑制某些有害基因。
基因治疗的概念出现在二十几年前，现在已 经在临床上得到了实际应用。基因治疗最早的临 床研究是1990年Blaese 等进行的对腺苷脱氨酶 (ADA)缺乏症的治疗，随后在对遗传病、病毒侵染、 肿瘤等疾病的治疗中得到广泛的应用。中国也是 开展基因治疗比较早的国家，1991年薛京伦等开 展了血友病B基因治疗的临床实验，并取得比较理 想的效果。
结构稳定。生理条件下DNA比RNA稳定106 倍，DNA的磷酸二酯键比蛋白质的肽键抗 水解能力要高100倍。
成本低廉、易于合成和修饰。 脱氧核酶具有催化效率高和高度专一性等
特性。
脱氧核酶(Deoxyribozyme，DRz)的分类
分类依据：借鉴国际酶学委员会对蛋白酶 的分类方法，将DRz 分成4 类:水解酶、转移 酶、合成酶和氧化酶 具有水解酶活性的DRz 1、作用于RNA 的DRz 主要包括水解RNA的“10-23”、“8-17”DRz。
手枪形脱氧核酶自我剪切作用机理
切割点
10
5‘ 20
3‘ C A
茎I(结合部位)
40
茎II (催化部位) 30
手枪形结构脱氧核酶的自身切割位点在第14nt处，其3’端约27个碱基对自身切割活 性的发挥至关重要。
“二分”型结构脱氧核酶
核酶
4、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型 肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作 用的研究
5、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用 发夹核酶抑制HIV-Ⅰ基因表达，并在Ⅰ期临床实验中受到 良好效果。
蓝（N.
Lan）等对镰形细胞贫血突变的β珠蛋白
mRNA（βS RNA）进行了修复 。
4 核酶技术在化妆品方面应用
随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病 的研究。 采用反义技术开发新的生物医学美容产品，使生物医学美容从生理上 完成人体的延缓衰老、抗皱、去痘、美白与健康， 已经成为高科技化妆品研究的一个热点
化学本质是RNA； 底物：RNA、肽键、ā-葡聚糖分支酶 反应特异性(专一性），依据碱基配对； 催化效率低 是一种金属依赖酶
三、核酶（ribozyme）的分类
锤头核酶 发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
根据催化反应 剪接型核酶
RNaseP I内含子
II内含子
2.剪切型核酶
2 白血病是造血系统的恶性肿 瘤,目前尚缺少有效的治疗方法 。核酶的发现，尤其是锤头状 核酶，为白血病的基因治疗带 来了新的希望。
核酶的应用
3 抗肿瘤治疗
核酶是天然的具有催化能力的RNA分 子，能特异性地催化RNA剪接。 针 对某些病原或肿瘤的基因设计特异性 核酶，并将其导入细胞以阻断或降低 这些基因在细胞内的表达，最终可达 到抑制病原增殖、肿瘤扩散的目的。
3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应；
核酶的发现与应用
姓名：乔艳红学号：**********年级：2010级班级：一班学院：生命科学学院时间：2011年11月9日核酶的发现与应用一、核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
核酶的发现在生命科学中具有重要意义，在进化上使我们有理由推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者是一体的，只是在进化的某一进程中蛋白质和核酸分别执行不同的功能。
核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手段，具有重要的应用前景。
二、核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。
核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。
核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DNA, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
U pA G pU 5'3'5'外显子3'外显子内含子三、核酶的分类剪接型（ splicing ）核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
核酶的发现与应用
核酶的发现与应用一、核酶的发现1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以注意。
20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又重复了20年前Francis Crick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。
1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有分子内催化的活性。
1983年，Altman等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度镁离子存在下，与留下的RNA部分(M1 RNA)具有与全酶相同的催化活性。
1986年，Cech又证实rRNA前体的内含子能催化分子间反应。
核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。
1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。
二、核酶的应用（一）应用于生命起源的研究体内选择技术的应用已经找到了一些催化基本生化反应（如RNA 剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这些结果支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。
（二）在医学领域中的应用1、通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。
2、免疫源性低，很少引起免疫反应。
3、针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
4、用于RNA的修复，核酶、反义核酸和小分子RNA（snRNA）是RNA修复的常用工具。
核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特异性地催化RNA剪接。
经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA分子。
5、核酶抗肝炎病毒的研究：目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研究。
质粒中hdvr序列
质粒中hdvr序列
质粒中hdvr序列是指存在于质粒中的丁型肝炎病毒（HDV）的核糖核酸（RNA）序列。
HDV是一种缺陷性RNA病毒，它的感染和病毒颗粒的形成需要依赖于乙型肝炎病毒（HBV）或其他嗜肝性病毒。
在中国，HBV感染是一个普遍的问题，而HDV的重叠感染被认为是乙型肝炎重症化的重要因素之一。
因此，早期明确HDV感染并及时给予临床干预对防止重症肝炎的发生具有重要意义。
为了提高HDV的筛查和检测水平，建立了基于ddPCR方法的HDV RNA精准检测技术，并将其与ELISA检测抗-HDV IgG/IgM方法相结合，对乙肝相关肝病患者进行HDV感染率分析。
质粒中hdvr序列对于HDV的检测和研究具有重要作用，有助于深入了解HDV的感染机制，为HDV的预防和治疗提供了新的思路。
e11-2发夹状核酶、HDV核酶和GlmS核开关核酶
e11-2 发夹状核酶、HDV核酶和GlmS核开关核酶发夹状核酶切割活性所需的最小长度为50个nt，其中15个nt是不变的。
如图e11-2(1)所示，其二级结构由4个螺旋区构成茎（茎A~D）和数个内部环组成。
螺旋A和D的主要功能是与靶序列结合，决定核酶切割部位的特异性。
螺旋C配对碱基及其3′-端的未配对碱基均为切割活性所必需。
图e11-2(1) 发夹状核酶的二级结构与三级结构三级结构分为两个结构域，一个结构域由螺旋A和D以及之间的内部环组成，含有底物和底物识别位点，另一个结构域由螺旋B和C以及之间的内部环组成，含有主要的催化位点A38 。
这两个结构域堆积在一起，形成类似发夹的结构。
这类核酶所催化的反应的基本步骤与锤头状核酶相似，切点也在A和G之间，这是因为在活性中心的这两个相邻的A和G所处的特殊构象，使得A的2′-OH与离去基团（G的5′-O）处于共线排列，特别适合作为亲核试剂进行亲核进攻，发生典型的亲核取代反应。
但与锤头状核酶不同的是，发夹状核酶催化不需要金属离子，而是由活性中心的一个A（A38）作为广义酸碱行使催化。
HDV核酶为人乙型肝炎病毒（HBV）的卫星病毒RNA。
HDV病毒颗粒细小，直径35～37nm，核心含单股负链共价闭合的环状RNA和HDV抗原（HDAg），外面包以HBV的表面抗原（HBsAg）。
HDV必须在HBV或其他嗜肝DNA病毒的辅助下，才能通过“滚环机制”进行RNA 指导的RNA 复制，产生多个拷贝。
然后，HDV 核酶在特定的位点，将复制产生的多拷贝的长链RNA在特定的位点，自剪切成单位长度。
与其他已知的自我剪切的病毒RNA一样，其催化的反应依赖于相邻位置的2′-OH对剪切点的亲核进攻。
图e11-2(2) HDV核酶的二级结构和三级结构HDV核酶是第一种被发现使用广义酸碱催化的核酶，这与核糖核酸酶A相似。
核糖核酸酶A在催化RNA剪切反应时，用两个His来激活亲核基团和稳定离去基团（参看第十章酶的催化机理图10-8），原因是His的pKa为6.8，接近生理pH，因此特别适合这样的催化。
基于反向遗传学操作技术新城疫病毒载体的研究进展
基于反向遗传学操作技术新城疫病毒载体的研究进展林初文;谢金文;王善辉;苗立中;沈志强【摘要】新城疫病毒是严重危害养禽业的重要疫病——新城疫的病原微生物.随着反向遗传学操作技术的快速发展,重组新城疫病毒载体已成为新城疫研究的重点,也是当今病毒载体系统研究的热点之一.笔者在简要综述了新城疫病毒的基因组结构和反向遗传载体的构建等的基础上,重点阐述了新城疫病毒载体在外源基因表达方面的研究概况.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)035【总页数】4页(P17146-17149)【关键词】反向遗传学;新城疫病毒;载体【作者】林初文;谢金文;王善辉;苗立中;沈志强【作者单位】山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600【正文语种】中文【中图分类】G813.1新城疫(Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV）引起的多种禽类易感的一种急性、高度接触性、毁灭性传染病，也是目前严重危害我国养禽业的重要疫病之一。
反向遗传学(Reverse genetics）是相对于经典遗传学而言的。
经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律，而反向遗传学与经典遗传学的研究思路正好相反，是直接从生物遗传物质入手，通过对遗传物质进行加工和修饰来研究基因突变后产生的生物体的特性(表型和性状等），从而确定生物体基因组的结构与功能以及这些突变可能对生物体特性的影响。
与之相关的各种研究技术统称为反向遗传学技术(Reverse genetics manipulation technique）［1－3］，主要包括 RNA 干扰 (RNA interference，RNAi）技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等，是DNA重组技术应用范围的扩展与延伸。
核酶和抗体酶2
内含子
Ⅰ
型
5'外显子
5'
U pA
3'外显子
G pU
3'
内
第一次转酯反应
含
pG-OH
子
pGpA
的 5'
UOH
G pU
3'
自
我
第二次转酯反应
剪
5' pGpA
接
5'
U pU
3'
GOH 3'
I类内含子催化其他RNA分子 反应的几种类型
1、转核苷酸作用
2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC+CpCpCpC
• 这两个位点对于剪接是十分重要的，一旦发 生突变无论在体内还是在体外，会抑制剪接。
• 此法则几乎适合于所有真核生物的核基因， 这意味着它们切除内含子的机制是相同的， 但不适用于Ⅰ类内含子。
RNA的催化功能
• 核酶首先是美国 Colorado 大学Cech在研 究四膜虫rRNA剪接机制时发现的。
–一方面证明了四膜虫rRNA的剪接机制； –另一方面证明了L-19 分子的催化活性。
四膜虫rRNA内含子 ---Ⅰ型内含子
I型内含子的结构特点
1、拼接点序列为 5U··· ···G3
2、中部核心结构 3、内部引导序列 4、剪接通过转酯反应进行
引导序列
保守序列 G结合位点
剪接部位
Ⅰ型内含子二级结构通式
内部引导序列
• 内含子中可与外显子配对的序列称为内部引导序列 • 其作用是决定剪接的专一性。
+ 外显子1 外显子2 内含子1
•剪接产物通过凝胶电泳见到: rRNA前体 + + + + 核抽取物 - + - + GTP - + + -
脱氧核酶分析
10-23脱氧核酶二级结构
催化核心
deoxyribozyme
5 3
RNA substrate
R
YR
切割点
底物识别结构域
R=A or G Y=C or U
8-17脱氧核酶二级结构
切割点
催化核心
底物识别结构域
第四部分 核酶的修饰
核酶修饰
• 修饰的原因：未经修饰的核酶在细胞内迅速被核酶 酶降解，目前解决这个问题的唯一方法就是对核酶 进行修饰。
3、脱氧核酶的分类
按其功能分类有以下七种： 最特别的是具
有RNA切割活
具有RNA切割活性
性的脱氧核酶
具有DNA连接活性
具有DNA激酶活性
具有DNA水解活性
具有卟啉环金属化酶和过氧化酶活性
具有N2糖基化活性
具有DNA戴帽活性
RNA切割活性的脱氧核酶
• RNA切割活性的脱氧核酶能催化RNA特定 部位的切割反应，从mRNA水平对基因灭 活，从而控制蛋白质的表达。
物的切割与连接，具有分子内催化的活性。
核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传 统观念提出了挑战。1989年，核酶的发 现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学 奖。
切赫 (Thomas Robert Cech)
阿尔特曼 (SidneyAhman)
该具有催化活性的RNA的发现改 变了传统上“酶是蛋白质” 的观念，
剪切型 核酸酶
异体催化剪切型或 分子间催化剪切型
核酸酶
自身催化剪切型或 分子内催化剪切型
核酸酶
剪接型 核酸酶
似乎最有应用前景，因为人们 对它的剪切机制和分子结构要 求已经有所了解，可以针对病 毒核酸、不良基因或恶性基因 进行人工设计、合成相应的各 种RNA或DNA片段作为核酸酶基 因，定向地剪切病毒核酸或不 良基因以及它们的转录中间产 物，抑制它们的表达，进行疾
核酶 (2)
3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应；
4、变形剂对活性的影响 5、温度对活性的影响：在65℃范围内随温度升高而增 加，37 ℃时均有适宜的活性。
核酶的应用
一 抗病治疗
二 RNA的治疗 三 核酶在医学上的应用 四 化妆品方面的应用 五 其他
一 抗病治疗
1 对于艾滋病毒HIV的转录信息 来源于RNA而非DNA，核酶能够 在特定位点切断RNA，使得它失 去活性。
蓝（N.
Lan）等对镰形细胞贫血突变的β珠蛋白
mRNA（βS RNA）进行了修复 。
4 核酶技术在化妆品方面应用
随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病 的研究。 采用反义技术开发新的生物医学美容产品，使生物医学美容从生理上 完成人体的延缓衰老、抗皱、去痘、美白与健康， 已经成为高科技化妆品研究的一个热点
2‘
p 5‘
HO-A
Ⅱ 类 内 含 子 的 剪 接 机 制
p
3‘
套环的形成
Mg 2+
3’
OH
p-A
p
第一次转 酯基反应 中利用一 个位于内 含子中的 腺苷酸残 基作为亲 核体
外显子连接 p
P-A
HO 3’
影响核酶活性的因素
1、pH值对活性的影响：pH7.0-7.5时核酶活性最高； 2、二价金属阳离子对活性的影响：如Mg 2+ Mn 2+；
价金属离子参与。
单金属离子催化
双金属离子催化
锤头结构的 五种类型
R示酶，S示底物，箭头示剪切位点
1.剪接型核酶
（1）定义
指RNA分子被磷酸二酯酶水解切割后，伴随着形成新的 磷酸二酯键，即磷酸二酯键的转移反应或称转酯反应。
核酶的22年
收稿日期: 2004 02 07 作者简介: 祁国荣( 1935 ) , 男, 研究员, E mail : qigr@ sibs. ac. cn
自从上世纪 90 年代初建立了核酶体外筛选法 ( 通常称作 SELEX 法) [ 5, 6] 以来, 产生了大量人造核
上面提 到 的 RNase P 和 核糖 体 外, 其 他如 剪 接体 ( spliceosome) 、编辑体( editosome) 、1, 4 葡萄糖分支 酶、马铃薯邻苯二酚氧化酶等, 是否都是以 RNA 为 主体行使生物功能? 已经有一些实验室正在开展这 方面的工作, 并取得一些肯定的结果。
酶。自然界核酶的底物主要是带有磷酸二酯键的核 酸( 非 核酸底 物的 核酶 自然 界是 否存 在? 仍无 定 论) 。但人造核酶的催化对象包括有: 酯键、酰胺键、 碳 碳键, 以及一些特殊的键等。与 6 大类酶相比,
道, 如白 血病( 包 括慢性 骨髓 型、早 幼粒 细胞 白血 病) 、各类肿瘤( 如前列腺癌、肺癌、乳腺癌、神经胶质 瘤等) 。也 有针 对遗 传 疾病 设计 核 酶 的研 究 , 如慢性溶血贫血、肌强直营养不良、成骨不全、
摘要: 核酶发现至今已 22 年了。1989 年的诺贝尔化学奖授于核酶的发现者 S. Altman 和 T. Cech。至 2004 年 2 月发表 有 5000 多篇有 关核酶的研究论文和综述。自然界留存的核酶不多, 但已 能制造出 许许多多人 工核酶。从 1997 年 人 造出 肽基转移核酶 到 2000 年根据一系列证据提出 核 糖体是一种 核酶 , 在理 论上和 应用上 都具有深 远意义。 核 酶出现早于酶( 蛋白质) , 后来让位于酶的 观点, 已为 多数人所 接受。在 应用上, 人们 已经设 计和制 造出各 种各样 的 核酶对付各种各样的疾病, 但目前临床应 用的极少或几乎没有。 关键词: 核酶; RNA 催化剂 ; 核糖核蛋白复合体 中图分类号: Q55
4[新].DNA转录和RNA加工剪接
![4[新].DNA转录和RNA加工剪接](https://img.taocdn.com/s3/m/93c3a40803d8ce2f00662351.png)
核酶技术面临的问题
1、核酶催化切割反应的可逆性问题
2、提高催化效率 3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞 4、使核酶在细胞内有调控地高效表达 5、增强核酶在细胞内的稳定性 6、对宿主的损伤问题有待进一步考察
（五）转录单元
转录单元：启动子到终止子。一个转录单位可以 包含一个以上的基因。 启动子：是一段位于结构基因5‟端上游区的DNA 序列，能活化RNA聚合酶，使之与DNA结合并具 有转录起始的特异性。 转录起点：与新生RNA链第一个核苷酸对应DNA 链上的碱基，通常为嘌呤。 上游与下游
启动子区的识别 酶与启动子的结合
σ因子的结合与解离
原核生物启动子
-10区序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现， 故也称为Pribnow区（Pribnow box）。
保守序列为T80A95T45A60A50 位于-10bp左右，A/T较丰富，易于解链。其功 能是:
(1) RNA pol紧密结合;
转录的延伸
RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使
新生RNA链不断延长的过程就是转录的延伸。
大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般为50～90个
核苷酸/s
转录区为RNA与DNA的杂合分子，解链区的
后面，DNA双链重新形成双螺旋。
转录终止
RNA链延伸到转录终止位点时，不再形成磷
酸二酯键，RNA聚合酶和RNA链从DNA链上 释放出来，转录泡瓦解。
(1) 为RNA pol的识别位点。 σ亚基识别-35序列，为转录选择模板 (2)-35和-10序列的距离是稳定的，此与RNA pol的结构有关。
比较不同原核生物的启动子序列
核酶的研究发展趋势
核酶的研究发展趋势
核酶的研究发展趋势包括以下几个方面：
1. 结构和功能解析：随着生物化学和结构生物学技术的进步，对核酶的结构和功能进行详细解析的研究日益深入。
通过解析其三维结构，可以了解其活性中心和底物结合位点的位置和结构，从而揭示其催化机制，并为设计和优化具有特定功能的核酶提供基础。
2. 催化效率提升：通过改进核酶的催化效率，可以提高其在生物技术和药物研发中的应用潜力。
一种方法是通过结构导向的蛋白工程技术来改变催化活性中心或底物结合位点，从而增强催化效率。
此外，通过蛋白工程中的进化技术，如DNA重组与自然选择，可以筛选出高效的核酶突变体。
3. 多样性和功能扩展：除了天然存在的核酶外，还可以通过工程方法获得具有特定功能的核酶。
例如，通过in vitro选择技术（如SELEX），可以设计出特异性识别和结合特定目标序列的核酶。
此外，近年来出现的CRISPR-Cas9系统的革命性发展，为基因编辑和基因治疗等领域提供了新的工具和方法，也对核酶的研究和应用产生了重要影响。
4. 应用领域扩展：核酶的研究和应用不仅局限于基础生物学领域，还涉及到许多应用领域。
例如，核酶在药物研发中可以用作靶向特定疾病基因的药物靶点，
或作为针对病原体的抗体替代物。
此外，核酶还可以用于环境修复、能源开发等领域，如利用核酶酶切水稻秸秆、生物燃料电池中的酶催化反应等。
随着技术的发展和应用需求的不断增加，核酶的研究和应用领域将继续扩展和深化。
核酶
❖3、核酶作用的特点
❖ 化学本质 RNA ❖ 底物 RNA 肽键 ā-葡聚糖分支酶 ❖ 反应特异性(专一性）碱基 ❖ 催化效率 低 ❖ 产物
4.核酶的分类
锤头核酶
发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
根据催化反应
RNaseP
I内含子
剪接型核酶 II内含子
二、剪接型核酶
❖ 剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方 式除去内含子（Intron).
起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高。
剪切 位点
5 ‘
G U
J1/2
A
CG
GC
GC CG
Ⅰ
CG GC GU UG
G
G
G CAA C G
AU
J1/4 U A
UA
U
CG
CG
Ⅳ
GC AU
GC
GC
GC
GC
A C
U G
L4
c
GC
UA
CG
CG
AU
Ⅲ
CG GC
GC
U
U
C
C
GC
L3 C U
3 Ⅱ‘
A A G C G
抗体酶 abzyme
生物工程酶 核酸类:
Ribozyme Deoxyribozyme
其它：模拟酶
克隆酶 遗传修饰酶 蛋白质工程新酶 、
2、长期以来，人们认为只有某些蛋白质才有生 物催化功能。但近些年研究发现，某些RNA分 子也具有生物催化功能，被称为Ribozyme。 1982年Cech等发现四膜虫细胞大核期间 26SrRNA前体具有自我剪接功能，并于1986年 证明其内含子L-19IVS具有多种催化功能。1984 年Altman等发现RNaseP的核酸组分M1RNA具有 该酶的活性，而该酶的蛋白质部分C5蛋白并无 酶活性。Cech和Altman因发现Ribozyme而获得 1989年度诺贝尔化学奖。
丁型肝炎病毒核酶的结构特点与催化作用机制
丁型肝炎病毒核酶的结构特点与催化作用机制孟斌;温博贵;韩金祥【期刊名称】《中国生物工程杂志》【年(卷),期】2003(23)8【摘要】丁型肝炎病毒 (HDV)核酶是小核酶的一种 ,在分子结构和作用机制等方面都有许多不同于其它核酶的特性。
以其晶体结构的揭示为基础 ,近几年对其立体构型及催化机制方面的研究取得了很大进展 ,尤其是发现HDV核酶的胞嘧啶侧链在生理条件下能发挥一般酸碱催化作用(generalacid basecatalysis) ,引起了极大关注。
对HDV核酶结构和催化机制的研究 ,将使核酶被有目的地改造 ,并极大地推动它在应用方面的研究。
【总页数】5页(P52-56)【关键词】丁型肝炎病毒核酶;结构特点;催化机制;酸碱催化作用;核酶【作者】孟斌;温博贵;韩金祥【作者单位】汕头大学医学院病理系肿瘤分子生物学研究室;山东省医药生物技术研究中心卫生部生物技术药物重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q527;R512.64【相关文献】1.丁型肝炎病毒载体携带核酶在小鼠体内抑制乙型肝炎病毒复制 [J], 李晓娟2.丁型肝炎病毒核酶对丙型肝炎病毒 RNA的抑制活性 [J], 郭焕珍;毛青;李奇芬;王宇明;顾长海;于乐成;蒋业贵3.丁型肝炎病毒核酶在细胞内抑制丙型肝炎病毒RNA活性的研究 [J], 郭焕珍;毛青;李奇芬;王宇明;顾长海;于乐成;蒋业贵4.丁型肝炎病毒核酶结构改建及其对丙型肝炎病毒RNA的剪切活性 [J], 于乐成;顾长海;毛青;李奇芬;王宇明;闵峰5.丁型肝炎病毒载体携带核酶在小鼠体内抑制乙型肝炎病毒复制 [J], 李晓娟;戴炜;况二胜;杨复华;乐晓华;王敏;周伯平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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HDV核酶研究近况国外医学分子生物学分册1999年第21卷第5朔1一{l}fHDV核酶研究近况于乐成毛青综述顾长海李奇芬审阅__,.—～,_.一第三军医大学西南医院全军传染病中心(重庆,400038)了7摘要HDV核酶为HDV双滚环复制所必需,最小序列约85枝苷酸(n’)左右,呈独特的假结样结掏,其结构和功能的关系已得到深入探索反式HDV核酶可能会成为一种新型有效的抗病毒药物键词HDV;核酶;结构和功能;应用丁衔韵研关键词核酶;结构和功能;应用jI竹田0’】/—一-—一J丁型肝炎病毒(HDV)基因组为单负股环状RNA,通过双滚环机制(doublerollingcirclemechanism)进行复制.该过程必须经过病毒前体RNA的自我催化裂解,即必须经过基因组核酶(genomeribozyme,gRz)和抗基因组核酶(antigenomeribozyme.ag. Rz,即复制中间体)的自裂.这一过程与一些植物致病病毒RNA复制特点相似.HDV复制过程中RNA的延伸,由宿主细胞RNA聚合酶II催化;自裂产物连接成环状,可能由宿主细胞RNA连接酶催化”.1HDV核酶的自裂位点及最小序列1988年,Sharmeen等用B『物延伸法证明ag.Rz的自裂位点在C904～G903之间.不久.Kuo等报道gRz的自裂位点在U688~G689之间.gRz36~100(自裂位点端和3’端分别含36nt和1.0nt)活性较高.后来.Perrotta等通过体外试验发现g. Rzl84和ag.Rzl84(j端分别为u和c)能保持较高自裂活性,其序列分别对应于HDV 基因组第688～772nt和抗基因组第904～820nt,提示HDV核酶的最小序列约85lit左右.g.Rzl一82和ag.Rzl一79虽能充分自*国家自然科学基金资助课题裂,但速率大大减慢.Thill等将g.RzI84的5端延长至5nt,去除3端第jl～68nt,得到g.Rz5—66(g.Rz71)仍能自裂,但同等条件下速率明显下降.2HDV核酶切割反应的机理及产物虽然.HDV核酶的结构与锤头状,发夹状核酶等明显不同,但催化反应发生的机理相似.都是转酯化反应.由自裂位点3端的2’-OH或氧原子对自裂位点处的磷原子实施亲核攻击,产物是23环化磷酸二酯和5一OH.倘缺乏2一OH或自裂位点5端为一脱氧核苷酸,则不能发生自裂.3体外HDV核酶切割反应的条件体外HDV核酶切割反应的条件为:①Mg_等二价金属阳离子为切割反应所必需. 其矶理之一可能是中和核酶RNA结构间的阴性斥力.使易于折叠成活性结构.Ca,Mn可替代Mg,有的研究甚至观察到Ca增加反式切割的效率远高于Mgis,v]. Sr”_,CA,Ba,Co,Pb,Zn对某些诱变株的自裂有较弱的辅助作用②一般在65C范围内随温度升高核酶活性增加.温度过高则因破坏HDV核酶的二级结构而使其丧失活性.⑧有的研究观察到HDV核酶裂国外医学分子生物学分册1999’年第2l卷第j期解底物的速率对数在pH4～6范围内呈线性上升,而另有研究发现某些HDV核酶的切割速率在pH5～9.1范围内并无明显变化,但大多数研究均提示pH7.0～7.5时核酶活性最高.①变性剂:G魁-CⅢb2-:’5ol群cJq/一G’1i:i4HDV核酶的结构模型及其结构域g,Rz和ag.Rz二级结构相似,但与锤头状核酶,发夹状核酶及链孢属Vs核酶不同.迄今主要提出3种模型,即假结样结街(pseudoknorstructure),斧头样结构(ax headstructure),三叶草形结构(cloverleaf structure)等模型.诱变分析,光交联,化学修饰等研究证实假结样结构(附图)最为可能’Ⅲ,可划分为9个结构域仅含lnt足可发生自裂,该nt可为U,C,A,但不能为GE]3].4.2Stem皿Lee等[.将g.Rzl0—66此延长2倍,不妨碍核酶折叠+但能增加核酶对甲酰胺的抵抗性,使活性有所增强+而减少lbp就会明显降低自裂活性此区的碱基配对所形成的双螺旋堆集结构主要起稳定核酶活性的作用,不参与构成活性中心,其序列有较大灵活性4.3Stemnl由3bp构成,5侧与stemI51侧共轴,3侧与stemI相邻.破坏其碱基配对或改变其序列均会导致活性下降+某些序列甚至完全无活性.所以此区结构和序列均很重要.4.4L3.与stemⅡ共同构成一个发夹环结构(hairpin—loopstructure).g.Rz和ag.Rz此区序列基本相同,富含嘧啶,唯g.Rz多1个U27.L3有较高的序列特异性+可能参与构或活性中心其5端,特别是CZllZ4附近区域可能靠近裂解位点的磷原子以发挥催化作用.4.5StemⅣ和L4两者共同构成另一个发夹环结构体外试验证明此区可减至4bp而对活性影响不大.但稳定的stmⅣ结构确实有利于活性提高,尤其是其根部的CG配对起着连接儿/4和J4/2的桥梁作用4.6J1/2连接stem【和stemI,对体外自裂反应意义不大,设计反式核酶时可被切断或删去但ag.Rz此区的8nt较保守,可能与核酶活性调节有关.4.7Jl/4连接stem【与stemⅣ,其中的3个G对核酶活性发挥很重要,若G38/40被A,C,u取代,则核酶活性明显下降.此区的G40/国外医学分子生物学分册l999年第21卷第5期42与位于J4/2区的G74/75的同型配对可使核酶结构扭曲,分别使C75/76靠近切割位点4.8J4/2连接stemN与stemI.对此区中G74/75,C75/76,A77/78,A78/79的碱基修饰显着降低核酶活性,C75/76的改变会导致核酶活性完全丧失光交联研究也显示ag.Rz的C76靠近切割位点.因此C75/76很可能直接参与了催化作用.4.9应用x线衍射技术发现g.RzJ1/~区的G38G39可与L3区的C22,C21形成短双链区P1.1.从而使g.Rz呈复杂的巢式双假结样(nesteddouble pseudoknot)高级结构.多种方法研究显示:L3,J1/4,J4/2可能共同参与构成催化中心.进一步研究尚发现: 若在两类HDV核酶间互换L3和J4/2+则活性均下降;但若只互换Jl/4,则活性均有不同程度升高”5反式HDV核酶的设计及意义核酶的自裂是一种分子内切割反应.称为顺式切割(cis—cleavage),核酶对底物的分子间切割则称为反式切割(trans—cleavage). HDV核酶是迄今发现的唯一可通过病毒自然感染而进入哺乳动物细胞中的核酶.所以研究其反式作用的重大意义在于利用它可能优于其它核酶的抗哺乳动物致病病毒作用. Branch等曾以斧头型结构为基础.从相应cDNA上分别转录出相当于”酶和”底物”的RNA分子,在适当条件下将两者混合,确实出现了”酶对”底物”的反式切割.假结样结构最接近实际结构,以它为基础的反式作用体系可分为3类:①”底物”和”酶”通过stemI的碱基配对结合,”底物”相当于stemI5侧序列;②”底物”和”酶”通过stem口,stemⅣ的碱基配对结合,酶由stemⅡ3侧,J4/2,stem～3侧组成;③”底国外医学分子生物学分册1999年第2l卷第5期物”和”酶通过stemI,stemⅡ,stemⅣ的碱基配对结合,”酶”由steml5侧,stemⅡ,L3,stemI3侧,J1/4及stemIV5侧构成,如Lai等设计的RNA73/RNA37(底物/酶)体系口,1个RNA37分子可切割多个RNA73分子,显示了”酶”的特点.后两类体系固核酶”对底物”序列要求过严,几无应用意义.第一类体系中+底物”与”酶”结合只需7nt,且在一定程度上可改变stemI3侧序列以适应底物序列+因此具有用来切割异源RNA分子的潜在价值.6HDV核酶活性的调节目前对HDV核酶活性的调节有这样几点认识:①基于HDV—RNA分子内约7O 碱基互补的事实,Lazinski等0认为互补序列的某些部分可充当”衰减子(attenuator)”的角色,通过碱基配对,使核酶及时失活②丁型肝炎病毒抗原(HDV Ag)虽非HDV核酶自裂所必需,但确能加快自裂和拼接反应1.Razas等1”发现未感染细胞内存在一种HDV Ag类似物,能影响HDV—RNA复制,并具有和HDV Ag相互作用的潜在能力.③新近Perrotta等通过体外试验发现ag.Rz 的第86～89nt(5,GCCA3)可与J1/z区的第10～13nt(5UGGC3)形成一双螺旋区P2a,对ag.Rz具有Na依赖性调节活性:低浓度Na(3mmol/L以下)时可显着抑制ag.Rz活性,但若先用高浓度Na一(100 mmol/L以上)与ag.Rz适当温育后再加入Mg,则使切割活性明显升高;HDV Ag对HDV桉酶活性的调节可能类似这一机制.应当指出,加强对临床分离株序列变异的研究+可更多了解HDV桉酶在体内的结构和功能变化+获取悻外实验研究所不能获取的重要信息,两者结合起来,对深入了解HDV核酶结构,性质,功能具有重要意义. 参考文献LaiMM.AnnuRevBiochem,1995;64:259 SharmeenLeta1.JVjroI,1988;62?2674 KuoMYPa1.JVirol,1988;62:4439 PerrottaATeta1.Nature,1991{350:434 BeenMDeta1.EurJBiochem,1997;247:741 PuttarajuEMeta1.NucleicAcidsRes一1993: 214253SakamotoTeta1.JBioehemTokyo,1997{l21:11238FauziHela1.NucleicAcidsRes,1997;25: 31249LeeCBeta1.Biochemistry,1996;35:12303 10DuhameIJeta1.NucleicAcidsRes,1996:24: 391111JengKSela1.NucleicAcidsRes,1996;70: 240312PerrottaATela1.NucleicAcldsRes.1996: 24:131413PerrotlaATeta1.Biochemistry,1992~31:16 14BravoCa1.NucleicAcidsRes,1996;24: 1351’15BeenMDeta1.RNA,19g5;1:106l16Ferre—D’AmareARa1.Nature,1998,395: 56717WadkinsTSela1.NucleicAcidsRes,1997; 25:408518BranchADa1.ProcNatIAcadScjUSA, 1991;88:1016319KawakamiJeta1.FEBSIe(t,1996{394:l32 20NishikawaFetEurJBicohem,1996:237: 71221LaLYCa1.Biochemistry,1996:35:12422LazinskDWel,a1.JVirol,l995{69:l】90 23JengKSeta1.JVirol一1996:7O:429524RazasR”a1.Science,1996;274:9025PerrottaATeta1.JMotBioI,1998;279:361 (1998一l1—10收稿)。