溶血性链球菌检验

【GB/T 4789.11—1994】

食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验

1 主题内容与适用范围

本标准规定了食品中溶血性链球菌的检验方法。

本标准适用于食品和食物中毒样品中溶血性链球菌的检验。

2 引用标准

GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

3 设备和材料

3.1 温箱：36±1℃。

3.2 水浴：36±1℃。

3.3 显微镜。

3.4 离心机。

3.5 试管架。

3.6 灭菌平皿。

3.7 灭菌小试管。

3.8 载玻片。

3.9 灭菌吸管：1mL、10mL。

3.10 灭菌镊子。

3.11 均质器。

3.12 酒精灯。

3.13 接种环。

4 培养基和试剂

4.1 葡萄糖肉浸液肉汤：按GB 4789.28中4.1规定，在肉浸液肉汤内加入1%葡萄糖。

4.2 肉浸液肉汤：按GB 4789.28中4.1规定。

4.3 匹克氏肉汤：按GB 4789.28中4.62规定。

4.4 血琼脂平板：按GB 4789.28中4.6规定。

4.5 人血浆。

4.6 0.25%氯化钙。

4.7 灭菌生理盐水。

4.8 杆菌肽药敏纸片(含0.04单位)。

5 检验程序

（图略）

6 操作步骤

6.1 样品处理

称取25g固体检样；称取25mL液体检样，加入225mL灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。

6.2 一般培养

将上述混悬液吸取5mL，接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤；或直接划线接种

于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36±1℃培养24h，接种血平板，置36±1℃培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。

6.3 形态与染色

本菌呈球形或卵圆形，直径0.5～1μm，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。

6.4 培养特性

该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.5～0.75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2～4mm界限分明、无色透明的溶血圈。

6.5 链激酶试验

致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。

吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入18～

24h36±1℃培养的链球菌培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL(如氯化钙已潮解，可适当加大至0.3%～0.35%)，振荡摇匀，置于36±1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置，内容物不流动)。然后观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。

草酸钾人血浆配制：草酸钾0.01g放入灭菌小试管中，再加入5mL人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾人血浆。

6.6 杆菌肤敏感试验

挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于36±1℃培养18～24h，如有抑菌带出现即为阳性。同时用已知阳性菌株作为对照。