第4章 高效液相色谱

R-SO3-M+ + H+


阴离子交换：R-NR3+Cl- + X一般形式：
R-NR3+X- + Cl-
R-A + B ＝ R-B + A

达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应 的选择系数）：
K
4. ELSD
原理：样品组分和流动相被雾化，其中高 沸点的物质分子会对检测器的光产生散射 作用，从而引起光强度的改变产生信号
优点：通用性检测器；可用于挥发性低于 流动相的任何样品组分的测定，且各组分 的响应几乎相等；可用于梯度洗脱 主要缺点：灵敏度较紫外低；价格昂贵
5. ECD
原理：根据离子型组分会改变流动相的电导情况
固定相
多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、
氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如
线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多
数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得
最多。
流动相
为一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。对
极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对 极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂
溶剂要与检测器匹配 高纯度。不纯的溶剂会引起基线 对于紫外吸收检测器，应注意选用 不稳。痕量杂质将使截止波长值 的波长比溶剂的紫外截止波长要长 增加50～100nm 对于折光率检测器，要求选择与组 化学稳定性好。不能选与样品发 分折光率有较大差别的溶剂作流动 常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、 生反应或聚合的溶剂 相，以达最高灵敏度 乙腈等；而戊烷、乙醚的粘度过低 低粘度。高粘度溶剂的柱压较高 ，但粘度过于低，易在色谱柱或 检测器内形成气泡
等各种离子交换基团时，就形成了离子性键合固定相； 流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色 谱类相同。
键合固定相的优点与缺点

通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各 种类型化合物（非极性、极性和离子型）。 由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于 梯度洗脱。 据统计，在HPLC法中，约有80％的分离问 题是用键合相色谱法解决。
HPLC的主要类型及选择
按承受高压能力大小可分为： 刚性固体和硬胶两类
刚性固体以SiO2为基质，如果在其表面 键合各种官能团，就是键合固定相，它 是目前最广泛使用的一种固定相。
硬胶由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成 ，主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。
固定相
按孔隙深度可分为：表面多孔 型和全多孔型两类
溶剂对于待测样品，必须具有合适 的极性和良好的选择性
优点：灵敏度高；线性范围宽；是离子型 色谱中使用最广泛的检测器 主要缺点：受温度影响大；流动相pH >7时 不够灵敏
5. 附属系统
包括在线脱气、梯度洗脱、恒温以及馏分 收集等装置。其中梯度洗脱装置是高压液 相色谱仪中尤为重要的附属装置 。 梯度洗脱是指在一个分析周期中，按一定 的程序连续改变流动相中溶剂的组成和配 比，使样品中各组分都能在适宜的条件下 得到分离
对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约1.7m，需用
20多小时才能分离出20种氨基酸；而用HPLC法，
只需lh之内即可完成。

用25cm×0.46cm×5um的Lichrosorb-ODS柱，采用
梯度洗脱，可在30min内分离出尿中104个组分。
2. 与GC法比较
分离对象

流动相作用
分离温度
4. 检测及数据处理系统
液相色谱检测器的种类也很多。根据检 测原理的不同，可将其分为溶质型检测 器和总体型检测器两种：
（2）总体型 对试样和洗脱液总的物理 （l）溶质型 仅对被分离组分的物理或 紫外-可见检测器（UV-Vis D） 化学特性有响应示差折光检测器（RID） 或化学性质有响应 二极管阵列检测器（PDAD） 蒸发激光散射检测器（ELSD） 荧光检测器（FD） 电导检测器（ECD）


仪器基本结构
1. 高压输液系统
由于HPLC所用固定相颗粒极细，对流动相阻力 很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液 罐、过滤器、高压输液泵、压力脉动阻尼器等组 成，其中高压输液泵是核心部件。
对于一个好泵应符合密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。
成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压
入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后备用。
一般在分离柱前备有一个前臵柱（预柱或
保护柱），前臵柱内的填料和分离柱一样。
经过前臵柱的流动相为其中的固定相饱和，减
少对分离柱固定相的洗脱，延长分离柱的柱效。
去除样品中的可溶性杂质，防止因其
强吸附于分离柱的柱头而引起柱效的损失 ，达到延长分离柱柱效的目的。
GC采用流动相是惰性气体，对组分没有亲和力， GC分析对象限于分析气体和沸点较低的化合物， 仅起运载作用。 它们仅占有机物总数的20％。 GC一般都在较高温度下进行的。 HPLC中流动相可选用不同极性的液体，选择余地 HPLC则经常在室温条件下工作。 对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定 大，它对组分可产生亲和力，并参与固定相对组 性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用HPLC进 分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大 行分析。 作用，为选择最佳分离条件提供了极大方便。

采用化学键合固定相的液相色谱称为化学键合相
色谱，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳
定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别
适用于分离容量因子k值范围宽的样品。

由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，
因此它适用于种类繁多样品的分离。
键合固定相类型
用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。 利用硅胶表面的硅醇基（Si-OH）与有机分子可 成键的特性。一般可分三类： （1）疏水基团 不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基
1. UV-Vis D和PDAD
原理：根据物质具有紫外-可见吸收的特性 优点：灵敏度、选择性高；对环境温度、流动相流速
和组成变化不敏感，可用于梯度洗脱分析；PDAD还
可获得三维的色谱-光谱图，功能更强大 主要缺点：被测组分必须具有紫外或可见吸收；单波 长检测器一次只能设定一个波长进行分析；PDAD虽 可进行多波长分析，但价格昂贵
3. 分离系统
色谱柱，包括柱管与固定相两部分。柱 管材料主要是不锈钢。 冲洗时，洗脱液流动的方 一般分析型柱长5～30cm，内径为4～ 向，决定了柱的使用方向。一 5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱 根正常的液相色谱柱必须按其 内径较大，可达25mm 以上。 使用方向安装于仪器上。
一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调
根据所使用的流动相和固定相的极性程度，
将其分为正相色谱和反相色谱。

采用流动相的极性小于固定相的极性，
称为正相色谱，它适用于极性化合物的
分离。其流出顺序是极性小的先流出，
极性大的后流出。

采用流动相的极性大于固定相的极性， 称为反相色谱。它适用于非极性化合物 的分离，其流出顺序与正相色谱相反。
化学键合相色谱法（CBPC）
质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。
它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用
于有机物的分离。
分离原理

利用不同待测离子对固定相亲和力的差别。固定相
采用离子交换树脂，其上分布有固定的带电荷基团
和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的
离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换。

阳离子交换：R-SO3-H+ + M+
对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同 的固定液即可解决分离问题。
为更好解决固定液在载体上的流失问题，产生
了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团
通过化学反应键合到载体表面的一种方法。
流动相
为了避免固定液的流失，对流动相的一个基
本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而
且流动相与固定相的极性差别越显著越好。
2. 进样系统
液相色谱柱比气相色谱柱短得多，所以柱外展宽
（又称柱外效应）较突出。 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽， 主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死 体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。
进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此
HPLC中对进样技术要求较严。
六通阀
Load
Inject
（2）极性基团 氨丙基、氰乙基、醚和醇
（3）离子交换基团
阴离子交换基团的胺基、季镀
盐；阳离子交换 基团的磺酸
反相键合相色谱

固定相是采用极性较小的键合相，如硅胶-
C18H37、硅胶-苯基等；流动相是采用极性较
强的溶剂，如甲醇、乙腈、水以及无机盐的
缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极
性化合物；也可用于分离极性化合物；还可 分离一些易电离的样品，如有机酸、有机碱、 酚类等。
HPLC法的局限性

使用多种溶剂作为流动相，成本高于GC法，且 易污染环境。梯度洗脱操作比程序升温复杂。 不能替代GC法去完成要求柱效高达10万理论塔 板数以上，必须用毛细管柱分析具有多种沸程 的石油产品。 不能代替中、低压液相色谱法分析在 200kPa 至 1MPa 柱压下受压易分解、变性的具有生物活性 的生化样品。
流动相
溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通 过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶 剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸 收测量。
按分离机理可分为以下几类：
液液分配色谱（LLPC） 液固吸附色谱（LSAC） 离子交换与离子色谱（IEC与IC 离子对色谱（IPC） 体积排阻色谱法（SEC）
正相键合相色谱

以极性的基团，如CN和NH2等键合在硅胶表 面作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂