碱性磷酸酶标记方法

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抗核抗体谱检测试剂盒(磁微粒化学发光法)产品技术要求华晟源

抗核抗体谱检测试剂盒（磁微粒化学发光法)适用范围：分别用于体外定量测定人血清中抗SSA抗体IgG，抗核糖体P蛋白IgG抗体，抗SSB抗体IgG，抗nRNP/Sm免疫球蛋白G抗体（IgG），抗Sm抗体IgG，抗着丝点抗体IgG，抗Scl-70抗体免疫球蛋白G(IgG)，抗Jo-1抗体IgG，抗双链DNA IgG抗体，抗组蛋白抗体（IgG），抗核小体IgG抗体，抗线粒体2型（M2）抗体IgG ，抗PM-Scl 抗体免疫球蛋白G（IgG），抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体IgG的含量。

1. 产品规格及其划分说明项目名称组分名称主要成分包装规格及装量25测试/盒50测试/盒100测试/盒SSA （抗SSA抗体IgG）SSA校准品（1,2,3）含抗SSA抗体浓度为2、20、200RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶SSA质控品（1,2）含抗SSA抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±20RU/ml)pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶SSA试剂1含生物素标记的SSA抗原的pH 7.4±0.1磷酸1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶盐缓冲液SSA 试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶SSA 试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶P0（抗核糖体P蛋白IgG抗体）） P0校准品（1,2,3）含抗核糖体P蛋白抗体浓度为g 、20、200 RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶P0质控品（1,2）含抗核糖体P蛋白抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±20RU/ml)的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶P0试剂1生物素标记的P0抗原的pH 7.4±0.11.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶磷酸盐缓冲液P0试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶P0试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶SSB（抗SSB抗体IgG） SSB校准品（1,2,3）含抗SSB抗体浓度为2、20、200RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶SSB质控品（1,2）含抗SSB抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±20RU/ml)的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶SSB试剂1生物素标记的SSB抗原的pH 7.4±0.1磷酸盐缓冲液1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶SSB试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶SSB试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶nRNP/Sm （抗nRNP/Sm免疫球蛋白G抗体（IgG）） nRNP/Sm校准品（1,2,3）含抗nRNP/Sm抗体浓度为2、20、200 RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶nRNP/Sm质控品（1,2）含抗nRNP/Sm抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±20RU/ml)的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶nRNP/Sm试剂1生物素标记的nRNP/Sm抗原的pH 7.4±0.1磷酸1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶盐缓冲液nRNP/Sm 试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶nRNP/Sm 试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶Sm（抗Sm 抗体IgG）Sm校准品（1,2,3）含抗Sm抗体浓度为2、20、200RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶Sm质控品（1,2）含抗Sm抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±20RU/ml)的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶Sm试剂1生物素标记的Sm抗原的pH 7.4±0.1磷酸盐缓冲液1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶Sm试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶Sm试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶着丝点(CENP-B)（抗着丝点抗体IgG）着丝点(CENP-B校准品（1,2,3）含抗着丝点(CENP-B)抗体浓度为2、20、200RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶着丝点(CENP-B质控品（1,2）含抗着丝点(CENP-B)抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±20RU/ml)的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶着丝点(CENP-B生物素标记的着丝点(CENP-B)抗原的1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶试剂1 pH 7.4±0.1磷酸盐缓冲液着丝点(CENP-B 试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶着丝点(CENP-B 试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶Scl-70（抗Scl-70抗体免疫球蛋白G(IgG)） Scl-70校准品（1,2,3）含抗Scl-70抗体浓度为2、20、200RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶Scl-70质控品（1,2）含抗Scl-70抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±20RU/ml)的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶Scl-70试剂1生物素标记的Scl-70抗原的1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶pH 7.4±0.1磷酸盐缓冲液Scl-70试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶Scl-70试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶Jo-1（抗Jo-1抗体IgG）Jo-1校准品（1,2,3）含抗Jo-1抗体浓度为2、20、200RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶Jo-1质控品（1,2）含抗Jo-1抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±20RU/ml)的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶Jo-1试剂1生物素标记的Jo-1抗原的pH 7.4±1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶0.1磷酸盐缓冲液Jo-1试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶Jo-1试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶dsDNA （抗双链DNA IgG 抗体 dsDNA校准品（1,2,3）含抗dsDNA抗体浓度为10、100、800 IU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶dsDNA质控品（1,2）含抗dsDNA抗体两个浓度水平（300±30IU/ml、600±60IU/ml）的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶dsDNA试剂1生物素标记的dsDNA抗原的1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶pH 7.4±0.1磷酸盐缓冲液dsDNA试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶dsDNA试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶组蛋白（His）（抗组蛋白抗体（IgG）组蛋白（His）校准品（1,2,3）含抗组蛋白（His）抗体浓度为2、20、200 RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶组蛋白（His）质控品（1,2）含抗组蛋白（His）抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±20RU/ml)的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶组蛋白生物素标记的组蛋 1.5ml/瓶3ml/瓶×16ml/瓶×1（His）试剂1白（His）抗原的pH 7.4±0.1磷酸盐缓冲液×1瓶瓶瓶组蛋白（His）试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶组蛋白（His）试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶核小体（Nuc）（抗核小体IgG抗体）核小体（Nuc）校准品（1,2,3）含抗核小体（Nuc）抗体浓度为2、20、200 RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶核小体（Nuc）质控品（1,2）含抗核小体（Nuc）dsDNA抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±20RU/ml)的pH 7.4±0.1Tris1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶缓冲液核小体（Nuc）试剂1 生物素标记的核小体（Nuc）抗原的pH 7.4±0.1磷酸盐缓冲液1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶核小体（Nuc）试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶核小体（Nuc）试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶线粒体2型（M2）（抗线粒体2型（M2）抗体IgG）线粒体2型（M2）校准品（1,2,3）含抗线粒体2型（M2）抗体浓度为2、20、200 RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶线粒体2型（M2）质控品（1,2）含抗线粒体2型（M2）抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶pH 7.4±0.1Tris缓冲液线粒体2型（M2）试剂1 生物素标记的线粒体2型（M2）抗原的pH 7.4±0.1磷酸盐缓冲液1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶线粒体2型（M2）试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶线粒体2型（M2）试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶PM-Scl（抗PM-Scl抗体免疫球蛋白G （IgG）） PM-Scl校准品（1,2,3）含抗PM-Scl抗体浓度为2、20、200RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶PM-Scl质控品（1,2）含抗PM-Scl抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶pH 7.4±0.1Tris缓冲液PM-Scl试剂1生物素标记的PM-Scl抗原的pH 7.4±0.1磷酸盐缓冲液1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶PM-Scl试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶PM-Scl试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶PCNA（抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体IgG）PCNA校准品（1,2,3）含抗PCNA抗体浓度为2、20、200RU/ml的pH 7.4±0.1Tris缓冲液1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶1ml/瓶×3瓶PCNA质控品（1,2）含抗PCNA抗体两个浓度水平(30±9RU/ml、100±1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶1ml/瓶×2瓶pH 7.4±0.1Tris缓冲液PCNA试剂1生物素标记的PCNA抗原的pH 7.4±0.1磷酸盐缓冲液1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶PCNA试剂2 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的pH 7.2±0.1的Tris缓冲液3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶12ml/瓶×1瓶PCNA试剂MpH 7.5±0.1的Tris缓冲液配制的链酶亲和素结合着的磁性微粒1.5ml/瓶×1瓶3ml/瓶×1瓶6ml/瓶×1瓶2. 性能指标2.1外观试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；磁分离试剂摇匀后为均匀悬浊液，无明显凝集；液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；包装标签应清晰，易识别。

碱性磷酸酶

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织,。

这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。

但它不是单一的酶，而是一组同功酶。

目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。

其中第 1 、 2 、 6 种均来自肝脏，第 3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。

血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。

生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。

生物化学特征碱性磷酸酶名字alkaline phosphatase (ALP 或 AKP)碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。

每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。

AKP被phoA 基因编码，与很多分泌蛋白一样，在细胞质内合成氨基末端带有信号肽的单体前体，信号肽引导前体跨内膜运输后被切除，同源二聚体形成。

碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。

而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。

碱性磷酸酶是磷酸酶的一种，磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，将磷酸基团加到对应底物分子上。

碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的ALP来说，其最适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。

ALP是一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（最适Ph为10左右）可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物底物。

实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定

即当V=Vmax/2时，Km=[S]
Lineweaver - Burk根据米氏方程，推导出如下直线方程式：（双倒数方程）
—1— = —K—m— ·—1— + —1—
V
Vmax [S] Vmax
以不同的底物浓度—1—为横坐标，
[S]
以—1—为纵坐标，
V
此直线与横轴相交的负截距为-
—1—，
Km
由此可以正确求得酶的Km值。
蒸馏水/mL
1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20
37℃水浴5min
血清/mL
0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
最终基质浓度（[S]）
2.00 4.00 6.00
8.00 16.00 0.00
37℃Байду номын сангаас温15min
碱性溶液/mL
1.1
1.1
1.1
1.1
1.1
0.5％铁氰化钾、0.3％ 4-氨基安替比林、酚标准液（0.1mg/mL） • 器材：恒温水浴锅、可见光分光光度计、移液枪
四、实验步骤
一．酚标准曲线的绘制
(1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。
管号
1
2
3
4
5
6
0.1mg/mL 酚标准溶液/mL
0.0
0.05 0.10 0.20 0.30 0.40
蒸馏水/mL
2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60
37℃水浴5min
碱性溶液/mL
1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10
0.3% 4-氨基安替比林/mL
1.0
1.0

ap标记的二抗显色原理

ap标记的二抗显色原理为了更好地理解AP标记的二抗显色原理，我们首先需要了解什么是二抗以及AP标记的基本概念。

我们将探讨AP标记的作用、原理以及其在研究和诊断中的应用。

我会给出我的观点和理解。

1. 什么是二抗和AP标记？在生命科学中，二抗是指第二抗体，通常是由小型哺乳动物（如鼠）制备的抗体。

它们用于检测和鉴定特定目标分子（抗原）的存在和定位。

与一抗（第一抗体）不同，二抗是针对一抗的抗体。

一抗通常是由大型哺乳动物（如兔子、绵羊或马）制备的。

AP标记是碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase）标记的一种常用技术。

碱性磷酸酶是一种常见的酶，具有灵敏度高、反应稳定等优点。

AP标记的二抗通过与目标分子结合，使得目标分子能够与碱性磷酸酶结合。

通过加入适当的显色底物，可以使目标分子在显微镜下呈现出特定的颜色。

2. AP标记的作用和原理AP标记在生命科学研究和诊断中起着举足轻重的作用。

它可以用来检测和定位特定蛋白质、抗原或核酸序列的存在以及它们的表达水平。

AP标记的原理是基于二抗与目标分子结合，并通过碱性磷酸酶的活性来催化显色底物的反应。

具体来说，AP标记的二抗首先与目标分子结合，形成一个稳定的复合物。

随后，加入含有碱性磷酸酶底物的显色液，这些显色底物会在碱性磷酸酶的催化下发生反应，产生可见的颜色。

3. AP标记在研究和诊断中的应用AP标记的二抗显色技术在生命科学领域有广泛的应用。

以下是一些常见的应用示例：3.1 免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）：AP标记的二抗显色技术可用于检测和定位特定抗原在组织或细胞中的分布情况。

通过显色反应的结果，可以通过显微镜观察到抗原的存在和定位。

3.2 免疫印迹（Western blotting）：AP标记的二抗显色技术也可用于检测和定量目标蛋白质在蛋白质电泳中的表达水平。

通过在蛋白质膜上添加AP标记的二抗以及显色底物，可以观察到特定蛋白质的表达水平。

3.3 原位杂交（In situ hybridization）：AP标记的二抗显色技术在原位杂交中也得到广泛应用。

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。

、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。

其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。

为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。

氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。

这里介绍两种程序。

程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。

(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。

(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。

(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。

(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。

(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。

(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。

酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。

碱性磷酸酶显色剂使用方法

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT (四唑硝基蓝)是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下,BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应,形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

使用方法1. 在膜或组织切片,最后一次洗涤完毕后,加入适量BCIP/NBT染色工作液2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时),直至显色至预期深度.3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应4. 膜标本可干燥后避光保存;组织切片或细胞样品,显色反应终止后,可以用中性红复染染色干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶,同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。

成骨细胞染色方法以ALP为目标物的检测方法:1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下,以镁离子作为激活剂,能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸,磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙,再与硝酸钴作用形成磷酸钴,经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】(1)将无菌的玻片放入培养皿中,传代时加入适量的细胞悬液,作细胞爬片,呆细胞长满玻片后取出。

(2)PBS冲洗后用冷丙醇固定10min,蒸馏水冲洗数次。

(3)入孵育液中,37℃孵育4-6h。

自来水冲洗数次。

(4)2%硝酸钴中浸3-5min,蒸馏水洗数次。

(5)1%的硫化铵中2min,自来水冲洗,自然干燥,封固。

【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2偶氮偶联法:【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液(PH 9.2)50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10,混合后过滤使用。

碱性磷酸酶-抗碱性磷酸

碱性磷酸酶－抗碱性磷酸(APAAP)免疫组化染色技术检测淋巴细胞表面标记撰稿黄传书金伯泉(一) 基本原理APAAP(Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique) 技术的基本原理为: 抗鼠IgG抗体作为桥梁，将鼠源性识别细胞抗原的第一抗体与鼠源性的抗碱性磷酸酶单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物相连接，使之成为Ag，-Ab １－Ab２-anti AP-AP的复合物。

还可通过二抗将APAAP 复合物重复叠加起来，从而使多个碱性磷酸酶标记于组织细胞上第一抗体所识别的抗原部位，提高了敏感性。

图APAAP技术原理(二) 方法分离外周血单个核细胞(PBMC)，洗涤后用含10％FCS犚PMI1640调整细胞浓度约5×10６／ml↓自制制片机上制片，充分干燥↓用含丙酮-福尔马林固定液中固定30秒钟↓自来水、蒸馏水依次冲洗↓用TBS稀释特异性McAb或阴性对照抗体(1∶50～500)，每片加30～50μl↓室温湿盒孵育30min，或4℃冰箱湿盒中过夜↓充分用TBS冲洗后，加1∶50羊(兔)抗鼠IgG(GAM或RAM IgG)30～50μl↓室温湿盒孵育30min↓TBS冲洗后加碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(1∶2000)复合物(APAAP)↓TBS冲洗后可重复叠加GAM或RAM IgG和APAAP2次，每次孵育10min↓冲洗后底物液显色10～15min↓自来水冲洗，苏木精衬染，光镜下观察(三) 试剂器材载玻片，制片机，湿盒，光学显微镜1. APAAP配制：牛肠碱性磷酸酶Ⅶ型(Sigma)4.3μl或粗酶2mg溶于1ml 0.05M,PH7.6的TBS，加抗碱性磷酶单克隆抗体腹水2μl制成，临用时作1∶2～1∶4稀释。

2. AP底物配制：Naphathol(萘酚)AS-MX(Sigma) 25mg溶于1ml二甲基甲酰胺，加PH8.2, 0.1M Tris-HCl缓冲液49ml，再加Fast Red ITR (Sigma) 50mg，充分混匀，用前配制。

碱性磷酸酶（ALP）

碱性磷酸酶（ALP）碱性磷酸酶锁定声明医学内容仅供参考，不能视作专业意见。

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碱性磷酸酶是⼴泛分布于⼈体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，⾻骼、肠、和胎盘等组织，。

这种酶能催化核酸分⼦脱掉5’磷酸基团，从⽽使DNA或RNA⽚段的5’-P 末端转换成5’-OH末端。

但它不是单⼀的酶，⽽是⼀组同功酶。

⽬前已发现有AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与AKP6 六种同功酶。

其中第1 、2 、6 种均来⾃肝脏，第3 种来⾃⾻细胞，第4 种产⽣于胎盘及癌细胞，⽽第5 种则来⾃⼩肠绒⽑上⽪与成纤维细胞。

⾎清中的ALP主要来⾃肝脏和⾻骼。

⽣长期⼉童⾎清内的⼤多数来⾃成⾻细胞和⽣长中的⾻软⾻细胞，少量来⾃肝。

⽬录1化学特征2有何影响3偏⾼的危害4升⾼5来源⼈体内情况研究应⽤6测定⽅法7正常范围8临床意义9药物意义10异常原因11抑制作⽤12肝胆疾病1化学特征碱性磷酸酶名字alkaline phosphatase (ALP 或AKP)细菌ALP⼆级结构现多⽤ALP系统名phosphate-monoester phosphohydrolase (alkaline optimum)其他名称还有alkaline phosphomonoesterase; phosphomonoesterase;glycerophosphatase; alkaline phosphohydrolase; alkaline phenyl phosphatase;orthophosphoric-monoester phosphohydrolase (alkaline optimum);basic phosphatase CAS 号: 9001-78-9碱性磷酸酶(AKP或ALP)属于同源⼆聚体蛋⽩，分⼦量为56KDa。

每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP 分⼦呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有⼀个活性中⼼，活性中⼼区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、⽔分⼦、三个⾦属离⼦及其配体氨基酸组成。

碱性磷酸酶标记的链霉亲和素-生物素法(SAP法).

1、石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3×3min； 2、3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗，PBS浸泡5min； 3、滴加适当比例稀释的胰岛素一抗工作液， 37℃ 孵育1hr； 4、 PBS冲洗，3×3min； 5、滴加HRP标记羊抗小鼠Ig多聚体，37℃或室温孵育20～30min； 6、 PBS冲洗，3×3min； 7、显色剂显色（AEC或DAB）； 8、自来水充分冲洗，封片。
实验原理
ABC法
SAP法
实验方法或步骤

1、石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗，PBS浸泡2min；(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。

2、10％正常羊血清封闭，室温孵育10min；
3、倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的胰岛素一抗或一抗工作液，37℃孵育45min。 PBS冲洗，3×3min；
多聚鳌合物酶法
HRP---多聚化合物---抗体一、Epos法
Enhanced polymer one-step staining
组织抗原一抗
HRP
多聚化合物骨架
EPOS 方法
原理：采用一种具有惰性的多聚
化合物作为骨架，将特异
性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，形成
HRP---多聚化合物---特异
碱性磷酸酶标记的链霉亲和素－生物素法（SAP法）
免疫组织化学实验二
实验材料

Hale Waihona Puke 1、小鼠胰腺的石蜡切片； 2、胰岛素抗体（鼠抗人单克隆抗体）； 3、SAP检测试剂盒； 4、正常羊血清； 5、 0.01M PBS（pH7.2～7.6）； 6、BCIP/NBT显色试剂； 7、孵育湿盒。

标记蛋白质的方法

蛋白质是一类生物大分子，在细胞和生物体的生命活动中具有重要的作用。

标记蛋白质的方法通常用于蛋白质的检测、鉴定、定位和定量分析等方面。

以下是一些常见的标记蛋白质的方法：
1. 放射性同位素标记：使用放射性同位素（如32P、14C 等）标记蛋白质，通过放射性检测来追踪蛋白质的行踪。

2. 荧光染料标记：利用荧光染料与蛋白质结合，使蛋白质发出特定的荧光信号，用于可视化和定量分析。

3. 生物素/亲和素标记：生物素是一种小分子化合物，可以与亲和素结合。

将生物素标记到蛋白质上，然后利用亲和素的特异性结合来检测和分离标记的蛋白质。

4. 酶标记：将酶（如过氧化物酶、碱性磷酸酶等）与蛋白质结合，通过酶的催化反应来检测蛋白质的存在。

5. 金属离子标记：利用金属离子（如铜、锌等）与蛋白质的结合，通过金属离子的特性来检测蛋白质。

这些标记方法各有特点和应用场景，可以根据具体的实验需求选择合适的标记方法。

需要注意的是，在进行蛋白质标记实验时，应严格按照操作规程进行，确保标记效率和实验结果的准确性。

同时，也要注意安全操作，避免放射性物质和有害化学试剂对身体造成伤害。

碱性磷酸酶标记方法

碱性磷酸酶标记方法(戊二醛两部法)将100uL碱性磷酸酯酶加入到300uL10mM PBS（pH7.2），再加入40uL 25%的戊二醛，混匀，4摄氏度活化20小时；透析至10mM PBS（pH7.2），24小时，换液4次；将目的蛋白用10mM PBS（pH7.2）配成4mg/mL；将125uL目的蛋白加入活化过的碱性磷酸酶中（终浓度为5000U AP/mg蛋白），混匀，4摄氏度反应24小时。

参考文献：A蛋白碱性磷酸醋酶的标记及酶联测试Enzyme Linked Immunosorbent Assay Using Alkaline Phosphatase Conjugated withStreptococcal Protein G 使用200mgAP/mg 蛋白2.5mg AP（50IU/mg），加入200uL含1.25%戊二醛的100mM 的PB（pH6.8），混匀，室温反应过夜；4摄氏度条件下，电磁搅动，透析至50mM PBS（pH7.2），12小时，换液4次；1.5mg目的蛋白溶于100uL 1M的CB（pH9.5）；将活化的AP加入配好的蛋白质液体中，混匀，4摄氏度条件下反应24小时；加入10uL 200mM的赖氨酸溶液，混匀，22摄氏度条件下反应2小时；4摄氏度条件下透析至50mM PBS（pH7.2），12小时，换液4次；离心，取上清，用50mM TB7.4+0.6% BSA+0.05% NaN3稀释10倍，-20摄氏度保存。

底物缓冲液：100mM TB9.0+100mM NaCl+1mM MgCl2参考文献：碱性磷酸酶标记链霉亲和素2．戊二醛交联标记法：此法是以双功能交联剂为桥，使酶与抗体(抗原)结合。

最常用的交联剂是戊二醛。

它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上的氨基结合。

戊二醛法又根据试剂加入的方法分为一步法和二步法。

一步法将抗体(抗原)、酶和戊二醛同时混合。

此法操作简便，广泛用于；HRP、AP与抗体(抗原)的交联。

碱性磷酸酶-基因实验

内蒙古大学生命科学学院生物系
基因工程实验室
本科基因工程实验论文开题报告
论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的
构建及在大肠杆菌中的表达
学生姓名：
年级：
专业：
指导教师：
二〇一三年八月十二日
二、实验方案
1．实验内容和实验目标，拟解决的关键问题：
实验内容：包括质粒提取、PCR扩增、转化大肠杆菌、凝胶回收、感受态制备、IPTG 诱导、SDS-PAGE鉴定等。

关键问题：IPTG诱导量及诱导时间的优化；
超声破碎的方案优化。

2. 实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析：
实验思路：依据技术路线完成试验。

实验方法：实验室常用技术。

技术路线：
实验方案：详细方案已于讲义给出。

可行性分析：实验室相关技术成熟，实验人员熟悉相关的实验内容以及方法，
实验的可行性很高。

注：本报告务必在实验开始前交实验室教师审查，审查合格后方可开始实验。

碱性磷酸酶标记抗体说明书

北京索莱宝科技有限公司碱性磷酸酶标记抗体说明书（AP antibody conjugate）
规格：0.1ml
保存：-20℃保存，避免反复冻融，保质期至少为1年；稀释后2～8℃可保存2周。

产品说明：
碱性磷酸酶标记抗体具有发光信号平台期长、背景值低、底物长期稳定的特点，是常用的化学发光分析法之一。

本公司制备的AP标记抗体，可用于多种免疫学实验，如：ELISA﹑WB﹑IHC等。

本品每0.1ml液体中含有AP200g，IgG含量约100g。

抗体浓度：1mg/ml
储存液：0.01M PBS(pH7.4)﹑1%BSA﹑0.03%Proclin300和50%Glycerol.
工作效价：
ELISA：1：2000-10000
WB：1：1000-10000
IHC：1：100-1000
具体效价以产品标签为准，最佳使用浓度需根据所检测样本的抗原及一抗效价优化而定。

显色说明：用BCIP/NBT作为底物进行显色，最终形成不溶性的深蓝色至蓝紫色沉淀。

第1页，共1页。

碱性磷酸酶标记抗人绒毛膜促性腺激素抗体的工艺比较

碱性磷酸酶标记抗人绒毛膜促性腺激素抗体的工艺比较杜晔;李基;彭波【摘要】目的通过测定最低检测限、精密性、热稳定性和临床相关性来比较3种碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)标记抗人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)抗体工艺的优劣. 方法用3种常用的蛋白质标记方法,将碱性磷酸酶和抗HCG的单抗进行偶联,进一步制成HCG的化学发光法定量测定试剂盒. 结果对用3种标记工艺获得的试剂的各项性能指标进行考察,结果过碘酸钠法各指标表现均衡,测值准确;4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯[N-(4-Maleimidobutyryloxy) succinimide,GMBS]法灵敏度高但热稳定性不佳;戊二醛法灵敏度过低且样本比对结果偏高. 结论用过碘酸钠法标记碱性磷酸酶与单抗获得的试剂在最低检测限、精密性、热稳定性及样本测定值比对各项指标中表现良好,是本研究推荐的一种标记工艺.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2015(007)005【总页数】8页(P333-340)【关键词】化学发光;标记;过碘酸钠;碱性磷酸酶【作者】杜晔;李基;彭波【作者单位】上海科华生物工程股份有限公司,上海200233;上海科华生物工程股份有限公司,上海200233;上海科华生物工程股份有限公司,上海200233【正文语种】中文作者单位：上海科华生物工程股份有限公司，上海200233 [ABSTRACT] Objective To compare 3 conjugating processes of alkaline phosphatase(AP) with anti-human chorionic gonadotropin(HCG) monoclonal antibody by determing the limit of detection, precision, thermal accelerated stability and clinical relevance. Methods AP and anti-HCG McAb were conjugated by employing 3 commonly used protein-coupled methods. Further the HCG quantitative detection kit was developed. Results All the performance characteristics of the 3 conjugating processes were compared. The sodium periodate method performed best with accurate measurement; the 4-maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide (GMBS) method performed with high precision but bad thermal accelerated stability; and the glutaral performed with low precision and poor clinical relevance. Conclusion The sodium periodate conjugating method was recommended by this study for it’s well performing in the the limit of detection, precision, thermal accelerated stability and clinical relevance.[KEY WORDS] Chemiluminiscence; Conjugation; Sodium periodate; Alkaline phosphatase化学发光免疫分析法是继放射性免疫分析、酶联免疫分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光后发展起来的一种新的标记免疫分析。