第九章 免疫标记技术(2016)
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《免疫标记技术》PPT课件_OK
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• 如抗原纯度高，可直接包被固相。 • 如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用
捕获包被法。即先包被与固相抗原相应的抗体，再 加入抗原形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质， 然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
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• 捕获包被法：临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获 包被法。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体， 因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将 竞争结合固相抗原而使部份IgM抗体不能结合到固相 上。因此用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体。 此时必须先将标本用抗IgG抗体处理，以除去IgG干 扰。
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• 竞争法：是将特异性抗体吸附于固相载体表面，此 过程称为包被（coated），或叫致敏。经洗涤后分成 两组，一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；另 一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色， 这两组底物的降解量之差，即为所要测定的未知抗 原量。
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竞争法
31
• 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。 因此，常用对小分子抗原如激素和药物类的测定。
– 应用酶标测定仪可作定量分析、敏感度可达ng水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。 这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长 时间。
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23
– 目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。 前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原，后者主要测 定可溶性抗原与抗体。
– 本法既无放射性污染又不需昂贵的测试仪器，且试剂 稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可定 性也可定量分析等，已广泛用于免疫学、微生物学、 寄生虫学、肿瘤学和细胞因子检测等领域。
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• 如抗原纯度高，可直接包被固相。 • 如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用
捕获包被法。即先包被与固相抗原相应的抗体，再 加入抗原形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质， 然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
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• 捕获包被法：临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获 包被法。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体， 因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将 竞争结合固相抗原而使部份IgM抗体不能结合到固相 上。因此用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体。 此时必须先将标本用抗IgG抗体处理，以除去IgG干 扰。
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• 竞争法：是将特异性抗体吸附于固相载体表面，此 过程称为包被（coated），或叫致敏。经洗涤后分成 两组，一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；另 一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色， 这两组底物的降解量之差，即为所要测定的未知抗 原量。
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竞争法
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• 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。 因此，常用对小分子抗原如激素和药物类的测定。
– 应用酶标测定仪可作定量分析、敏感度可达ng水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。 这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长 时间。
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– 目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。 前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原，后者主要测 定可溶性抗原与抗体。
– 本法既无放射性污染又不需昂贵的测试仪器，且试剂 稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可定 性也可定量分析等，已广泛用于免疫学、微生物学、 寄生虫学、肿瘤学和细胞因子检测等领域。
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《免疫标记技术》课件
胶体金标记抗体和抗原的制备
胶体金颗粒的制备： 通过化学方法将金 离子还原为胶体金 颗粒
抗体或抗原的制备： 通过生物技术方法 制备特异性抗体或 抗原
标记反应：将胶体 金颗粒与抗体或抗 原进行标记反应， 形成胶体金标记抗 体或抗原
纯化：通过离心、 过滤等方法对胶体 金标记抗体或抗原 进行纯化，去除杂 质和未结合的胶体 金颗粒
确性
实验室安全与防护
实验室环境：保持清洁、通风 良好
实验操作：遵守操作规程，避 免交叉污染
防护设备：使用防护服、手套、 口罩等防护设备
废弃物处理：妥善处理废弃物， 避免环境污染
07
免疫标记技术的未来发 展
新技术的应用和展望
免疫标记技 术在疾病诊 断中的应用
免疫标记技 术在药物研 发中的应用
免疫标记技 术在食品安 全检测中的 应用
镜ห้องสมุดไป่ตู้察等。
04 免疫酶技术
酶标抗体和酶标抗原的制备
酶标抗体的制 备：通过免疫 反应，将酶与 抗体结合，形
成酶标抗体
酶标抗原的制 备：通过化学 方法，将酶与 抗原结合，形
成酶标抗原
酶标抗体和酶 标抗原的纯化： 通过色谱法、 电泳法等方法
进行纯化
酶标抗体和酶 标抗原的保存： 低温保存，避 免酶的活性降
交叉学科融合与创新
免疫标记技术与生物医学的融合：提高疾病诊断和治疗效果
免疫标记技术与纳米技术的融合：开发新型免疫标记材料和检测方法
免疫标记技术与人工智能的融合：实现自动化、智能化的免疫标记检测和 分析 免疫标记技术与大数据、云计算的融合：提高免疫标记数据的处理和分析 效率，为疾病预防和治疗提供更准确的信息支持。
荧光免疫标记应用： 细胞标记、蛋白质 标记、DNA标记 等
免疫标记技术课件
1. 它不需 ELISA 法中所要求的作用的底物和显色 剂，使操作更简便;
2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;
3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有 效期长; 4.灵敏度高，10-25IU/L。
免疫标记技术
Immunolabeling technique
免疫标记技术
用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）
进行抗原-抗体反应。 标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变 抗体或 抗原的免疫学特性，且极大的提高了反应的灵敏度，可以对 微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术 = 免疫技术+ 标记技术
常用底物： 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、 价高，故应用不如HRP普及。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性；
②酶促反应专一性，保证特异性；
③底物反应放大作用，提高敏感性； ④酶标试剂保存稳定；
⑤操作简便，安全易行。
常用方法: 酶联免疫吸附试验
一、双抗体夹心法检测HBsAg
实验材料
1.HBV诊断试剂盒； 2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。
HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb
乙肝表面抗原,存在于 HBV感染的急性期及慢 性期的血清中,为感染 指标。
HBeAg, HBeAb
HBcAb(IgG,IgM)
实验步骤
层析流方向
G：金标鼠抗人HCG单抗
T：鼠抗人HCG单抗
C：羊抗鼠IgG抗体 B：吸水纸
HCG金标试纸
滴加标本 复溶 固定
反应条带
质控条带
A
G 层析流方向
2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;
3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有 效期长; 4.灵敏度高，10-25IU/L。
免疫标记技术
Immunolabeling technique
免疫标记技术
用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）
进行抗原-抗体反应。 标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变 抗体或 抗原的免疫学特性，且极大的提高了反应的灵敏度，可以对 微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术 = 免疫技术+ 标记技术
常用底物： 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、 价高，故应用不如HRP普及。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性；
②酶促反应专一性，保证特异性；
③底物反应放大作用，提高敏感性； ④酶标试剂保存稳定；
⑤操作简便，安全易行。
常用方法: 酶联免疫吸附试验
一、双抗体夹心法检测HBsAg
实验材料
1.HBV诊断试剂盒； 2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。
HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb
乙肝表面抗原,存在于 HBV感染的急性期及慢 性期的血清中,为感染 指标。
HBeAg, HBeAb
HBcAb(IgG,IgM)
实验步骤
层析流方向
G：金标鼠抗人HCG单抗
T：鼠抗人HCG单抗
C：羊抗鼠IgG抗体 B：吸水纸
HCG金标试纸
滴加标本 复溶 固定
反应条带
质控条带
A
G 层析流方向
免疫标记技术
Pipettes
Incubator
ELISA reader
常用方法：
1. 间接法：最常用来检测抗体。 2. 双抗体夹心法：最常用来检测抗原。 3. 抗原竞争法：可检测抗原或抗体。 4. BAS-ELISA：提高实验敏感性。
1.间接ELISA
原理： 包被抗原，加待检的血清，再加酶标的二抗， 最后加酶的底物催化显颜色，颜色的深浅反映 待检血清抗体的量。
♪ 异硫氰酸荧光素（FITC）--黄绿色荧光 ♪ 罗丹明—桔红色荧光 ♪ 藻红蛋白（PE）：红色荧光 ♪ DAPI：深蓝色
1. 直接免疫荧光法：荧光标记一抗。 2. 间接免疫荧光法：荧光标记二抗。
放射免疫测定法（radioimmunoassay RIA）
以放射性核素为标记物标记Ag或Ab，将同位素分析 的灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合的测定技术。 •优点：灵敏度极高，10-9～10-12克。 •常用放射性核素：125I、 131I。 •主要用途：微量物质测定（胰岛素、甲状腺素等
激素、 核酸、病毒抗原、肿瘤抗原）。
•缺点：需特殊仪器及防护措施，受同位素半衰期限制。
结果
阳性
阴性
免疫标记技术
小结
免疫荧光技术
酶免疫技术
ELISA（酶联免疫吸附试验） 间接法----检测抗体 双抗体夹心法----检测抗原
放射免疫测定法（RIA）
免疫病理实验
免疫血清的制备、鉴定及其在实验中的应用
注意：洗涤应彻底！
1
2
双抗体夹心法ELISA
to detect Ag
洗涤
洗涤
洗涤
包被抗体
加待检抗原
免疫标记技术【30页】
↓加酶底物 Ag-Ab中的酶催化底物进行显色反应 三、据显色情况判断结果
酶免疫测定
➢ELISA p162
包被
载体 显色
固相抗原
标本
双抗体夹心法
酶免疫定位
一、酶免疫组织化学技术 p166
酶免疫定位
二、酶免疫印迹试验 p168 1.SDS－PAGE电泳：将各种蛋白质抗原
分离为不同区带 2.将蛋白质抗原区带转移到NC膜上 3.依次与第一抗体和酶标第二抗体反应 4.加入酶不溶性底物，使抗原区带染色
二、荧光免疫组织化 学技术 p166 标记物：异硫氰酸 荧光素(FITC)等
抗体芯片 p171
抗体芯片
一、信号检测 仪器扫描检测反应信号及其强度
来判断样品中靶分子及其量 激光共聚焦扫描仪
二、高通量、微型化和自动化地对生 物液体、细胞及组织中的成分进行 准确、快速、大信息量的检测
抗原抗体反应的应用
记物检测技术 检测Ag-Ab中
标记物 的有
常用标记物：酶、荧光物 质、放射性同位素、化学
无或多少，来 判断结果
发光物质、胶体金等
免疫标记技术的分类
一、据标记物分 1.酶免疫分析 2.荧光免疫分析 3.放射免疫分析 4.化学发光免疫分析 5.金免疫分析
免疫标记技术的分类
二、据应用分 1.免疫组织化学技术 2.免疫测定
高特异、高灵敏、高通量的抗原 抗体反应检测技术已广泛用于生 命科学的各个领域
抗原抗体反应的应用
一、疾病诊断与研究：感染性疾病、肿瘤、 遗传病、自身免疫病、内分泌疾病等
二、3P医学：预防(preventive)医学、预 测(predictable)医学和个性化 (personal)医疗
三、药物研究、检测和筛选 四、食品科学与安全
酶免疫测定
➢ELISA p162
包被
载体 显色
固相抗原
标本
双抗体夹心法
酶免疫定位
一、酶免疫组织化学技术 p166
酶免疫定位
二、酶免疫印迹试验 p168 1.SDS－PAGE电泳：将各种蛋白质抗原
分离为不同区带 2.将蛋白质抗原区带转移到NC膜上 3.依次与第一抗体和酶标第二抗体反应 4.加入酶不溶性底物，使抗原区带染色
二、荧光免疫组织化 学技术 p166 标记物：异硫氰酸 荧光素(FITC)等
抗体芯片 p171
抗体芯片
一、信号检测 仪器扫描检测反应信号及其强度
来判断样品中靶分子及其量 激光共聚焦扫描仪
二、高通量、微型化和自动化地对生 物液体、细胞及组织中的成分进行 准确、快速、大信息量的检测
抗原抗体反应的应用
记物检测技术 检测Ag-Ab中
标记物 的有
常用标记物：酶、荧光物 质、放射性同位素、化学
无或多少，来 判断结果
发光物质、胶体金等
免疫标记技术的分类
一、据标记物分 1.酶免疫分析 2.荧光免疫分析 3.放射免疫分析 4.化学发光免疫分析 5.金免疫分析
免疫标记技术的分类
二、据应用分 1.免疫组织化学技术 2.免疫测定
高特异、高灵敏、高通量的抗原 抗体反应检测技术已广泛用于生 命科学的各个领域
抗原抗体反应的应用
一、疾病诊断与研究：感染性疾病、肿瘤、 遗传病、自身免疫病、内分泌疾病等
二、3P医学：预防(preventive)医学、预 测(predictable)医学和个性化 (personal)医疗
三、药物研究、检测和筛选 四、食品科学与安全
第九章免疫标记技术2016
讨论课：学会阅读免疫标记技术涉及到的抗体说明 书、文献资料免疫标记技术图片和熟悉免 疫荧光技术的使用。
文献
Targeting estrogen receptor β in microglia and T cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis
2
免疫学依据
＋
抗原
抗体
抗原–抗体复合物
抗原（antigen）:一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应 免疫应答产物(抗体)在体内外发生特异性结合的物质。通常是一种蛋白质，但多糖 和核酸等也可作为抗原。 抗体（antibody）：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
酶
分 解
底物
抗原抗体免疫结合反应 + 酶组织化学反应
某种物质 + 生色原
有色反应物沉淀
辣根过氧化物酶
H2O2
O- + DAB
棕黄色反应物沉淀
ABC法实验步骤
①TBS漂洗3次，每次5 min；用新鲜配制的3%H2O2溶液与切片在室温下孵育20 min，以消除组 织内源性的过氧化物酶的活性； ②0.05 M TBS漂洗3次，每次5 min；加入supermix（0.05 M TBS、0.9%NaCl、0.25%明胶和 0.5%Triton X-100， pH=7.6）稀释的一抗，室温下孵育2 h后于4℃孵育过夜（大于14 h）； ③TBS漂洗3次，每次5 min；加入supermix稀释的二抗，于37℃孵育2 h； ④用Supermix溶液稀释亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（1︰800），混匀后在室温下 让亲和素和生物素预先作用30 min； ⑤将已反应好的亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC）与脑切片在室温下孵育2 h； ⑥0.05 M TBS漂洗6次，每次5 min； ⑦显色系统：切片在新鲜配制加镍的二氨基联苯氨（DAB）显色液中反应5-10 min，其中显色 液含有0.2%硫酸镍铵、0.003%H2O2、0.05%DAB和0.05 M TBS（pH=7.6）； ⑧显色之后，0.05 M TBS漂洗6次，每次5 min； ⑨将切片贴于已涂明胶的载玻片上； ⑩晾干之后，采用酒精梯度脱水，二甲苯透明，后用中性树脂封片，镜下观察。
免疫标记技术
常用的酶及其底物 酶 辣根过 氧化物 酶 (HRP) 底物
邻苯二胺 (OPD) 四甲替联苯胺 (TMB) 5氨基水杨酸 (5AS) 邻联苯甲胺 (OT) 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS )
显色反应 测定波长
橙红色 蓝绿色 棕色 蓝绿色
蓝绿色
492 450 449 425 642
酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大 量的催化过程，所以极为敏感。它的催化过程 有两种基本形式： (1)E十S →(ES)→E十P (2)E十S →＝(ES) (ES)十D1 →E十P十D2 E为酶，S为酶作用的底物，P为底物分解 后的产物，D，为供氢体，D：为D1的氧化型。 如P或D：为有色化合物，即可用呈色反应显示 酶的存在。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2) 和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料 (D)。酶促反应的过程如下: HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如 DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉 淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或 电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA， 但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色， 现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生 鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温 度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时 间内进行测定。
荧光是指一个分子或原子吸收了给 予的能量后，即刻引起发光；停 止能量供给，发光亦瞬即停止。 荧光素是一种能吸收激发光的光能 产生荧光，并能作为染料使用的 有机化合物。目前用于标记抗体 的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄 (FITC)、四乙基罗丹明及四甲基 异硫氰酸罗丹明。
动物免疫学课件：免疫标记技术
較高的敏感性和特異性。 動物糞便、黏膜拭子塗片、病變組織觸
片或切片、尿沉渣等均可作為樣本 對含菌少的樣本，可採用濾膜聚菌法，
然後在濾膜上進行免疫螢光染色
（2）病毒病診斷 直接檢測病變組織中的病毒，是病毒病診
斷的常用手段。如豬瘟、雞傳支 豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎，臨床症狀
相似，但將豬小腸做切片，即可區分 對於豬瘟等不出現細胞病變的病毒，免疫
2 包被 將抗原或抗體吸附於固相表面的過程。 大多數 抗原易吸附在表面。用碳酸鹽緩衝液 包被，4℃過夜或37℃吸附2~3h。 3 洗滌 用含0.05%Tween-80的PBS
4 實驗方法
直接法 用於測抗原 （如沙門氏菌）
（1）待檢抗原包被
（2）洗滌3~5次，每次3~5min
（3）封閉 含1%OVA的PBS（pH7.2，濃 10mmol）
雙抗體夾心法
（1）抗AIV多抗包被 （2）洗滌3~5次，每次3~5min （3）封閉 含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度
為10mmol） （4）洗滌 同上 （5）加待檢抗原，置濕盒中， 37℃作用
1~2h
（6）洗滌 同上 （7）加抗AIV單抗，置濕盒中， 37℃作用
1~2h （8）洗滌 同上 （9）加酶標記抗AIV單抗，置濕盒中， 37℃作
指用螢光素對抗體進行標記，然後用螢 光顯微鏡觀察螢光，以分析示蹤相應的抗 原或抗體的方法。 Coons等1941年建立該技術，當時用螢 光黃標記，但效果不好，故不能推廣。
當發現異硫氰酸螢光素（FITC）被發現後， 以及螢光抗體純化技術的發展，顯著提高了螢 光抗體技術的敏感性和特異性，故得到廣泛應 用。
用於病原檢測、疫病診斷等
1 原理： 螢光素在超微濃度下，亦能被短波長光
片或切片、尿沉渣等均可作為樣本 對含菌少的樣本，可採用濾膜聚菌法，
然後在濾膜上進行免疫螢光染色
（2）病毒病診斷 直接檢測病變組織中的病毒，是病毒病診
斷的常用手段。如豬瘟、雞傳支 豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎，臨床症狀
相似，但將豬小腸做切片，即可區分 對於豬瘟等不出現細胞病變的病毒，免疫
2 包被 將抗原或抗體吸附於固相表面的過程。 大多數 抗原易吸附在表面。用碳酸鹽緩衝液 包被，4℃過夜或37℃吸附2~3h。 3 洗滌 用含0.05%Tween-80的PBS
4 實驗方法
直接法 用於測抗原 （如沙門氏菌）
（1）待檢抗原包被
（2）洗滌3~5次，每次3~5min
（3）封閉 含1%OVA的PBS（pH7.2，濃 10mmol）
雙抗體夾心法
（1）抗AIV多抗包被 （2）洗滌3~5次，每次3~5min （3）封閉 含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度
為10mmol） （4）洗滌 同上 （5）加待檢抗原，置濕盒中， 37℃作用
1~2h
（6）洗滌 同上 （7）加抗AIV單抗，置濕盒中， 37℃作用
1~2h （8）洗滌 同上 （9）加酶標記抗AIV單抗，置濕盒中， 37℃作
指用螢光素對抗體進行標記，然後用螢 光顯微鏡觀察螢光，以分析示蹤相應的抗 原或抗體的方法。 Coons等1941年建立該技術，當時用螢 光黃標記，但效果不好，故不能推廣。
當發現異硫氰酸螢光素（FITC）被發現後， 以及螢光抗體純化技術的發展，顯著提高了螢 光抗體技術的敏感性和特異性，故得到廣泛應 用。
用於病原檢測、疫病診斷等
1 原理： 螢光素在超微濃度下，亦能被短波長光
免疫标记技术
• 1、酶标记抗体免疫组化技术类型： • （1）直接法：■-Ag + Ab*E → ■-Ag-Ab*E
优点：简单、快速、特异 缺点：一种酶标抗体只能测一种抗原，敏感性较差
• （2）间接法：■-Ag + Ab1 + Ab2*E → ■-Ag-Ab1-Ab2*E
优点：一种酶标抗体能测多种抗原，实用性敏感性 较直接法好 缺点：敏感性低于非标记抗体酶法与三步法
酶免疫技术 Enzyme Immunoassay（EIA）
一、概述
• 抗原抗体反应＋酶催化反应 • 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光 光度计 • 特异、敏感 • 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或 抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克 水平上对其进行定量。
酶免疫标记用于抗原检测
（一）基本原理
• 酶标记抗体或抗原： • 抗体或抗原的免疫学反应特异性 ＋ 酶活性 • 酶是一种有机催化剂： • 使底物基质水解而呈色 • 使供氢体由无色还原型变为有色氧化型 • ∴ 可用呈色反应显示酶的存在。 • 很少量的酶即可导致大量的催化过程， 所以极为敏感。
• • • • • • •
步骤： 抗原的提取与纯化 免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化 标记抗体 标本处理 抗原抗体反应和呈色反应 显微镜观察
• 标本 • 取材新鲜、固定及时、形态保存良好、 抗原性不被破坏 • 活体组织切片或印片 • 各种体液、穿刺液（细胞沉淀涂片） • 培养细胞
• 1 标本的固定与保存： • 固定使细胞内蛋白凝固，终止胞内酶活化， 防止细胞自溶，保存抗原性 • 固定剂：乙醇、丙酮、戊二醛等 • 切片：冰冻、石蜡 • 2 酶消化：打开固定过程中由于醛键形成 而被封闭的抗原决定簇（胃蛋白酶等）
•
免疫标记技术
实验内容
• 1．免疫标记技术的原理和常用方法(电教) • 2. 免疫荧光技术（示教）
• 3．ELISA双抗体夹心法测AFP（操作）
• 4．胶体金标记技术（早孕诊断-双抗体夹 心一步法）（示教，操作）
实验报告
ELISA的原理、操作流程、结果及临
床意义。
免疫荧光技术
斑点金免疫层析试验
兔抗鼠IgG
手持端
鼠抗HCG单抗 金标鼠抗HCG单抗 尿液浸湿标志线 吸水材料
斑点金免疫层析试验结果判定
尿样
阳性
弱阳性
阴性
无效
返回
实验三
免疫标记技术
实验目的要求
• 1．掌握免疫标记技术的概念及常用 方法； • 2．熟、 放射性核素、胶体金等标记抗体或抗 原用以测定相应抗原或抗体的检测技 术。常用的方法有免疫酶技术、免疫 荧光技术、放射免疫测定技术、免疫 胶体金技术等。此类技术具有特异、 敏感、快速，能定性、定量和定位等 优点，故在临床检验中得到了广泛应 用。
免疫标记技术PPT参考幻灯片
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ELISA基本的实验过程
15
【实验器材】
1、AFP诊断试剂盒 2、AFP阳性对照品，阴性对照品，待检品 3、微量加样器、温箱
16
【操作步骤】
1. 将包被孔编号，分别加入阳性对照、待测样品及阴性对 照各50ul
2. 在各孔内加入酶结合物1滴，37℃温育30分钟 3. 甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液1滴，摇
hCG
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【实验原理】
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【操作步骤】
1.待测样品、检测试纸和其它检测材料等恢复到 室温后检测 2.将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中， 5秒钟后取出平放，5分钟内观察结果
注意：测试纸插入尿液深度不可超过MAX标志 线
26
【实验结果】
阳 阴 无性效：
27
思考题
1、免疫标记技术的特点是什么？ 2、在酶免疫标记技术中，最常用的酶是
医学免疫学实验四 免疫标记技术
Immunolabeling Technique
主讲：谢永生 病原生物学与免疫学教研室
1
简介
免疫标记技术(immunolabeling technique) 是指用荧光素、酶、放射性同位素等对抗 体或抗原进行标记，然后再通过检测标记 物来观察抗原抗体反应的实验技术。
优点：特异、敏度和快速； 可定性、定量和定位
4
放射免疫技术
◆ 放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、 精密度好的优点，常用于各种激素、微量 蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的 测定，但具有放射污染的缺点。
5
免疫酶技术
◆ 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高 效催化作用有机结合的一种方法。
◆ 常用的酶： – 辣根过氧化物酶(HRP) – 碱性磷酸酶(AP)
ELISA基本的实验过程
15
【实验器材】
1、AFP诊断试剂盒 2、AFP阳性对照品，阴性对照品，待检品 3、微量加样器、温箱
16
【操作步骤】
1. 将包被孔编号，分别加入阳性对照、待测样品及阴性对 照各50ul
2. 在各孔内加入酶结合物1滴，37℃温育30分钟 3. 甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液1滴，摇
hCG
24
【实验原理】
25
【操作步骤】
1.待测样品、检测试纸和其它检测材料等恢复到 室温后检测 2.将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中， 5秒钟后取出平放，5分钟内观察结果
注意：测试纸插入尿液深度不可超过MAX标志 线
26
【实验结果】
阳 阴 无性效：
27
思考题
1、免疫标记技术的特点是什么？ 2、在酶免疫标记技术中，最常用的酶是
医学免疫学实验四 免疫标记技术
Immunolabeling Technique
主讲：谢永生 病原生物学与免疫学教研室
1
简介
免疫标记技术(immunolabeling technique) 是指用荧光素、酶、放射性同位素等对抗 体或抗原进行标记，然后再通过检测标记 物来观察抗原抗体反应的实验技术。
优点：特异、敏度和快速； 可定性、定量和定位
4
放射免疫技术
◆ 放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、 精密度好的优点，常用于各种激素、微量 蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的 测定，但具有放射污染的缺点。
5
免疫酶技术
◆ 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高 效催化作用有机结合的一种方法。
◆ 常用的酶： – 辣根过氧化物酶(HRP) – 碱性磷酸酶(AP)
第九章 免疫标记技术
（3）固相法
将测定用的第一抗体（或第二抗体）牢固地结 合于固相载体表面，相应抗原（或第一抗体）经 温育被吸附，只要将固相表面洗涤即将B和F分离。 优点：操作简便、快速
新的固相分离方法：
纤维固相抗体竞争法 可磁化颗粒固相抗体竞争法 试管固相法
（4）吸附法
本法多用于小分子半抗原的放射克疫分析。 如：活性炭、硅镁吸附剂、滑石粉等 性质：对蛋白质、多肽、药物等具有非特异性 吸附的能力 应用：在其表面包被一层白蛋白或右旋糖苷等 物质时，将会限制大分子物质的吸附。 沉 淀 中：吸附有游离的抗原或半抗原 上清液中：抗原抗体复合物 优点：操作简便、分离迅速 缺点：与一性丌强
第一节
放射免疫技术
一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型
一、放射免疫技术的原理
RIA是以放射性同位素标记抗原的一种 竞争性克疫抑制试验
第一节
放射免疫技术
一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型
二、放射免疫技术的基本条件
本法操作简便、稳定 易叐克疫反应液中其他蛋白质或盐的干扰，使 非特异性吸附有较大发异，丏第二抗体消耗量大。
缺点：
（2）化学试剂分段沉淀分离法
利用盐类或有机化合物使反应液中的球蛋白在等电点沉淀，从而达到分离的目 的。如：聚乙二醇（PEG）、硫酸铵等
优点：
试剂来源广泛、 价格便宜
缺点：
影响因素多（温度、pH值、浓度等）
2. 间接荧光抗体染色法 3. 补体荧光染色法
4. 特殊染色法
三、免疫荧光技术的基本类型
1. 直接荧光抗体染色法
2. 间接荧光抗体染色法 3. 补体荧光染色法
免疫学课件——第九章 标记技术
显色反应及标本观察
免疫学原理与技术
酶联免疫吸附测定法ELISA(定性,定量) 将抗原或抗体吸附于固相载体上(聚苯乙 烯微量滴定板),在载体上进行免疫酶染色,底物 染色后用肉眼或分光光度计判定结果.
免疫学原理与技术
抗原或抗体的包被
将抗原或抗体吸附于故相载体表面的过程. 为了增强包被能力可采取以下方法:
酶分子
醛基
酶结合物的提纯 酶结合物的鉴定 酶和抗体活性的鉴定 结合物定量测定 酶结合物的保存 小量分装,-20℃保存,或在33％的甘油溶液 中4℃保存.
免疫学原理与技术
3.免疫酶技术操作 免疫酶组化染色法(定性,定位) 标本的处理和制备:切片,压片,涂片等. 消除内源酶,消除背景染色. 染色方法: *直接法:待检抗原,酶标抗体,底物和供氢体
Hale Waihona Puke 免疫学原理与技术一.荧光抗体技术
荧光素在10-8超低浓度时,仍然可被短波光 激发,发出明亮的,肉眼能够感知的荧光. 免疫试验用到的荧光素有异硫氰酸荧光素 (FITC),四乙基罗丹明(RB200),四甲基异硫氰 酸罗丹明(TMRITC).其中应用最广的是异硫 氰酸荧光素,为黄色结晶状粉末,分子量389,有 Ⅰ,Ⅱ两种异构体,易溶于水和酒精,性质稳定, 低温干燥可保存多年,能与蛋白质良好结合,异 构体Ⅰ效果更好,它的最大吸收光谱为490-495 纳米,最大发射光谱为520-530纳米,呈明亮的黄 绿色荧光.
底物显色
本法的供氢体的产物必须是水溶性的.
终止反应
每孔加浓硫酸50微升
结果观察
肉眼或分光光度计记录显色结果
免疫学原理与技术
三.放射免疫技术
将同位素测量的高灵敏性和抗原抗体反应 的高特异性结合起来,则为放射免疫技术. 常用的同位素有: 131I,125I,3H,14C,32P,35S. 1.同位素标记 外标记与那标记 2.标记抗原的鉴定 放射化学纯度 免疫化学活性 标记抗原用量 放射性强度
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光，这种光称为荧光，这种物质，称为荧光素。
常用的荧光素：
异硫氰酸荧光素（FITC）
异硫氰酸四甲基若丹明（TRITC）
四乙基若丹明（RB200） 镧系：Eu、Tb PE 其它
免疫荧光技术的基本类型
一、直接法
（一）抗原直接定位法
荧光标记的抗体
组织中的抗原
一、直接法（单标）
（二）抗体直接定位法
荧光标记的抗原
组织中的抗体
二、间接法（单标）
（一）抗原间接定位法
荧光标记的第二抗体 （二抗）
(最常用)
第一抗体（一抗）
组织中的抗原
二、免疫荧光双标记法
（一）直接法
甲抗原
乙抗原
甲荧光标记的 乙荧光标记的 抗甲抗原抗体 抗乙抗原抗体
（二）间接法
最常用
甲荧光标记的第 乙荧光标记的第 二抗体（二抗） 二抗体（二抗）
生物素－亲合素 （Biotin-Avidin） 是70年代末发展起 来的一种新型生物 反应放大系统。亲 合素有四个部位， 可同时结合多价性 的生物素化衍生物。
ABC
生物素化二抗
一抗
组织抗原
生物素与亲和素有很高的亲和力，1个亲和素分子上有 4个生物素结合 位点。在ABC法中，不对特异性第一抗体进行标记，而用生物素标记 第二抗体，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混 合，制成ABC混合物，并使亲和素分子上至少空出1个生物素结合位点。 染色时，标本中的抗原先与第一抗体结合，后者再与生物素标记的第 二抗体结合，然后加入 ABC复合物，结合到第二抗体的生物素上，最 终形成的复合物网络了大量的酶分子。
PNAS 2013,110 (9):3543-3548
免疫荧光技术
免疫荧光技术：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记， 试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧
光素，这种免疫技术称为免疫荧光技术。
三结合：
抗原抗体反应的高度特异性
优点：
特异性强、敏感性高、速度快， 结果直观，可以检疫和定位微量抗原。
免疫酶技术
用作标记物的酶有： 辣根过氧化物酶（HRP）
碱性磷酸酶 (AP)
葡萄糖氧化酶 半乳糖苷酶
酶
分 解
抗原抗体免疫结合反应 + 生色原
有色反应物沉淀
辣根过氧化物酶
H2O2
O- + DAB
棕黄色反应物沉淀
ABC法实验步骤
①TBS漂洗3次，每次5 min；用新鲜配制的3%H2O2溶液与切片在室温下孵育20 min，以消除组 织内源性的过氧化物酶的活性； ②0.05 M TBS漂洗3次，每次5 min；加入supermix（0.05 M TBS、0.9%NaCl、0.25%明胶和 0.5%Triton X-100， pH=7.6）稀释的一抗，室温下孵育2 h后于4℃孵育过夜（大于14 h）；
2
免疫学依据
＋
抗原
抗体
抗原–抗体复合物
抗原（antigen）:一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应 免疫应答产物(抗体)在体内外发生特异性结合的物质。通常是一种蛋白质，但多糖 和核酸等也可作为抗原。 抗体（ antibody）：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由 B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
⑥0.05 M TBS漂洗6次，每次5 min；
⑦显色系统：切片在新鲜配制加镍的二氨基联苯氨（DAB）显色液中反应5-10 min，其中显色 液含有0.2%硫酸镍铵、0.003%H2O2、0.05%DAB和0.05 M TBS（pH=7.6）； ⑧显色之后，0.05 M TBS漂洗6次，每次5 min； ⑨将切片贴于已涂明胶的载玻片上； ⑩晾干之后，采用酒精梯度脱水，二甲苯透明，后用中性树脂封片，镜下观察。
第九章 免疫标记技术 ——免疫酶标组织技术（ABC法） 免疫荧光技术
中南民族大学生命科学学院 2016年12月13日
基本概念
免疫标记技术：指用放射性同位素、荧光素、酶、生物素、
化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检
测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。由于采用的 方法不同，免疫标记技术主要分为：免疫放射免疫技术、 荧光免疫技术、免疫酶标技术、胶体金免疫技术、免疫电 镜技术等。
③TBS漂洗3次，每次5 min；加入supermix稀释的二抗，于37℃孵育2 h；
④用Supermix溶液稀释亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（1︰800），混匀后在室温下 让亲和素和生物素预先作用30 min； ⑤将已反应好的亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC）与脑切片在室温下孵育2 h；
免疫标记技术的基本原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合原理，通过 化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、 同位属 ）显色来确定组织（细胞）内抗原（多肽和蛋白 质），对其进行定位、定性及定量的研究。
组织抗原
标记物
被标记抗体
标记抗体与组织 抗原特异性结合
ABC法（ Biotin-Avidin Complex， 生物素-亲合素-过氧化物酶复合物法） 原理：酶标记生物素Biotin形成酶素化生物素Biotin
抗甲抗原抗体 抗乙抗原抗体
甲抗原
乙抗原
熟练掌握的软件
• • • • • • • • Word Excel Powerpoint Photoshop SPSS（或其他统计软件） Endnote（文献管理软件） Image-Pro Plus GraphPad Prism
讨论课：学会阅读免疫标记技术涉及到的抗体说明
书、文献资料免疫标记技术图片和熟悉免
疫荧光技术的使用。
文献
Targeting estrogen receptor β in microglia and T cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis
荧光的敏感可测性 显微技术的高度精确性
缺点：
荧光易发生淬灭，荧光染色标本 保存困难、易出现非特异性染色问题， 镜检结果判定客观性不足。
免疫荧光技术的基本条件
1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 3. 荧光检测仪—荧光显微镜
物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基
态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发
常用的荧光素：
异硫氰酸荧光素（FITC）
异硫氰酸四甲基若丹明（TRITC）
四乙基若丹明（RB200） 镧系：Eu、Tb PE 其它
免疫荧光技术的基本类型
一、直接法
（一）抗原直接定位法
荧光标记的抗体
组织中的抗原
一、直接法（单标）
（二）抗体直接定位法
荧光标记的抗原
组织中的抗体
二、间接法（单标）
（一）抗原间接定位法
荧光标记的第二抗体 （二抗）
(最常用)
第一抗体（一抗）
组织中的抗原
二、免疫荧光双标记法
（一）直接法
甲抗原
乙抗原
甲荧光标记的 乙荧光标记的 抗甲抗原抗体 抗乙抗原抗体
（二）间接法
最常用
甲荧光标记的第 乙荧光标记的第 二抗体（二抗） 二抗体（二抗）
生物素－亲合素 （Biotin-Avidin） 是70年代末发展起 来的一种新型生物 反应放大系统。亲 合素有四个部位， 可同时结合多价性 的生物素化衍生物。
ABC
生物素化二抗
一抗
组织抗原
生物素与亲和素有很高的亲和力，1个亲和素分子上有 4个生物素结合 位点。在ABC法中，不对特异性第一抗体进行标记，而用生物素标记 第二抗体，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混 合，制成ABC混合物，并使亲和素分子上至少空出1个生物素结合位点。 染色时，标本中的抗原先与第一抗体结合，后者再与生物素标记的第 二抗体结合，然后加入 ABC复合物，结合到第二抗体的生物素上，最 终形成的复合物网络了大量的酶分子。
PNAS 2013,110 (9):3543-3548
免疫荧光技术
免疫荧光技术：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记， 试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧
光素，这种免疫技术称为免疫荧光技术。
三结合：
抗原抗体反应的高度特异性
优点：
特异性强、敏感性高、速度快， 结果直观，可以检疫和定位微量抗原。
免疫酶技术
用作标记物的酶有： 辣根过氧化物酶（HRP）
碱性磷酸酶 (AP)
葡萄糖氧化酶 半乳糖苷酶
酶
分 解
抗原抗体免疫结合反应 + 生色原
有色反应物沉淀
辣根过氧化物酶
H2O2
O- + DAB
棕黄色反应物沉淀
ABC法实验步骤
①TBS漂洗3次，每次5 min；用新鲜配制的3%H2O2溶液与切片在室温下孵育20 min，以消除组 织内源性的过氧化物酶的活性； ②0.05 M TBS漂洗3次，每次5 min；加入supermix（0.05 M TBS、0.9%NaCl、0.25%明胶和 0.5%Triton X-100， pH=7.6）稀释的一抗，室温下孵育2 h后于4℃孵育过夜（大于14 h）；
2
免疫学依据
＋
抗原
抗体
抗原–抗体复合物
抗原（antigen）:一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应 免疫应答产物(抗体)在体内外发生特异性结合的物质。通常是一种蛋白质，但多糖 和核酸等也可作为抗原。 抗体（ antibody）：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由 B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
⑥0.05 M TBS漂洗6次，每次5 min；
⑦显色系统：切片在新鲜配制加镍的二氨基联苯氨（DAB）显色液中反应5-10 min，其中显色 液含有0.2%硫酸镍铵、0.003%H2O2、0.05%DAB和0.05 M TBS（pH=7.6）； ⑧显色之后，0.05 M TBS漂洗6次，每次5 min； ⑨将切片贴于已涂明胶的载玻片上； ⑩晾干之后，采用酒精梯度脱水，二甲苯透明，后用中性树脂封片，镜下观察。
第九章 免疫标记技术 ——免疫酶标组织技术（ABC法） 免疫荧光技术
中南民族大学生命科学学院 2016年12月13日
基本概念
免疫标记技术：指用放射性同位素、荧光素、酶、生物素、
化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检
测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。由于采用的 方法不同，免疫标记技术主要分为：免疫放射免疫技术、 荧光免疫技术、免疫酶标技术、胶体金免疫技术、免疫电 镜技术等。
③TBS漂洗3次，每次5 min；加入supermix稀释的二抗，于37℃孵育2 h；
④用Supermix溶液稀释亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（1︰800），混匀后在室温下 让亲和素和生物素预先作用30 min； ⑤将已反应好的亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC）与脑切片在室温下孵育2 h；
免疫标记技术的基本原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合原理，通过 化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、 同位属 ）显色来确定组织（细胞）内抗原（多肽和蛋白 质），对其进行定位、定性及定量的研究。
组织抗原
标记物
被标记抗体
标记抗体与组织 抗原特异性结合
ABC法（ Biotin-Avidin Complex， 生物素-亲合素-过氧化物酶复合物法） 原理：酶标记生物素Biotin形成酶素化生物素Biotin
抗甲抗原抗体 抗乙抗原抗体
甲抗原
乙抗原
熟练掌握的软件
• • • • • • • • Word Excel Powerpoint Photoshop SPSS（或其他统计软件） Endnote（文献管理软件） Image-Pro Plus GraphPad Prism
讨论课：学会阅读免疫标记技术涉及到的抗体说明
书、文献资料免疫标记技术图片和熟悉免
疫荧光技术的使用。
文献
Targeting estrogen receptor β in microglia and T cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis
荧光的敏感可测性 显微技术的高度精确性
缺点：
荧光易发生淬灭，荧光染色标本 保存困难、易出现非特异性染色问题， 镜检结果判定客观性不足。
免疫荧光技术的基本条件
1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 3. 荧光检测仪—荧光显微镜
物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基
态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发