第九章 免疫标记技术(2016)

荧光的敏感可测性 显微技术的高度精确性
Βιβλιοθήκη Baidu缺点：
荧光易发生淬灭，荧光染色标本 保存困难、易出现非特异性染色问题， 镜检结果判定客观性不足。
免疫荧光技术的基本条件
1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 3. 荧光检测仪—荧光显微镜
物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基
态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发
组织中的抗体
二、间接法（单标）
（一）抗原间接定位法
荧光标记的第二抗体 （二抗）
(最常用)
第一抗体（一抗）
组织中的抗原
二、免疫荧光双标记法
（一）直接法
甲抗原
乙抗原
甲荧光标记的 乙荧光标记的 抗甲抗原抗体 抗乙抗原抗体
（二）间接法
最常用
甲荧光标记的第 乙荧光标记的第 二抗体（二抗） 二抗体（二抗）
免疫标记技术的基本原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合原理，通过 化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、 同位属 ）显色来确定组织（细胞）内抗原（多肽和蛋白 质），对其进行定位、定性及定量的研究。
组织抗原
标记物
被标记抗体
标记抗体与组织 抗原特异性结合
ABC法（ Biotin-Avidin Complex， 生物素-亲合素-过氧化物酶复合物法） 原理：酶标记生物素Biotin形成酶素化生物素Biotin
③TBS漂洗3次，每次5 min；加入supermix稀释的二抗，于37℃孵育2 h；
④用Supermix溶液稀释亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（1︰800），混匀后在室温下 让亲和素和生物素预先作用30 min； ⑤将已反应好的亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC）与脑切片在室温下孵育2 h；
讨论课：学会阅读免疫标记技术涉及到的抗体说明
书、文献资料免疫标记技术图片和熟悉免
疫荧光技术的使用。
文献
Targeting estrogen receptor β in microglia and T cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis
生物素－亲合素 （Biotin-Avidin） 是70年代末发展起 来的一种新型生物 反应放大系统。亲 合素有四个部位， 可同时结合多价性 的生物素化衍生物。
ABC
生物素化二抗
一抗
组织抗原
生物素与亲和素有很高的亲和力，1个亲和素分子上有 4个生物素结合 位点。在ABC法中，不对特异性第一抗体进行标记，而用生物素标记 第二抗体，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混 合，制成ABC混合物，并使亲和素分子上至少空出1个生物素结合位点。 染色时，标本中的抗原先与第一抗体结合，后者再与生物素标记的第 二抗体结合，然后加入 ABC复合物，结合到第二抗体的生物素上，最 终形成的复合物网络了大量的酶分子。
⑥0.05 M TBS漂洗6次，每次5 min；
⑦显色系统：切片在新鲜配制加镍的二氨基联苯氨（DAB）显色液中反应5-10 min，其中显色 液含有0.2%硫酸镍铵、0.003%H2O2、0.05%DAB和0.05 M TBS（pH=7.6）； ⑧显色之后，0.05 M TBS漂洗6次，每次5 min； ⑨将切片贴于已涂明胶的载玻片上； ⑩晾干之后，采用酒精梯度脱水，二甲苯透明，后用中性树脂封片，镜下观察。
第九章 免疫标记技术 ——免疫酶标组织技术（ABC法） 免疫荧光技术
中南民族大学生命科学学院 2016年12月13日
基本概念
免疫标记技术：指用放射性同位素、荧光素、酶、生物素、
化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检
测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。由于采用的 方法不同，免疫标记技术主要分为：免疫放射免疫技术、 荧光免疫技术、免疫酶标技术、胶体金免疫技术、免疫电 镜技术等。
2
免疫学依据
＋
抗原
抗体
抗原–抗体复合物
抗原（antigen）:一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应 免疫应答产物(抗体)在体内外发生特异性结合的物质。通常是一种蛋白质，但多糖 和核酸等也可作为抗原。 抗体（ antibody）：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由 B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
光，这种光称为荧光，这种物质，称为荧光素。
常用的荧光素：
异硫氰酸荧光素（FITC）
异硫氰酸四甲基若丹明（TRITC）
四乙基若丹明（RB200） 镧系：Eu、Tb PE 其它
免疫荧光技术的基本类型
一、直接法
（一）抗原直接定位法
荧光标记的抗体
组织中的抗原
一、直接法（单标）
（二）抗体直接定位法
荧光标记的抗原
抗甲抗原抗体 抗乙抗原抗体
甲抗原
乙抗原
熟练掌握的软件
• • • • • • • • Word Excel Powerpoint Photoshop SPSS（或其他统计软件） Endnote（文献管理软件） Image-Pro Plus GraphPad Prism
免疫酶技术
用作标记物的酶有： 辣根过氧化物酶（HRP）
碱性磷酸酶 (AP)
葡萄糖氧化酶 半乳糖苷酶
酶
分 解
抗原抗体免疫结合反应 + 酶组织化学反应
底物
某种物质 + 生色原
有色反应物沉淀
辣根过氧化物酶
H2O2
O- + DAB
棕黄色反应物沉淀
ABC法实验步骤
①TBS漂洗3次，每次5 min；用新鲜配制的3%H2O2溶液与切片在室温下孵育20 min，以消除组 织内源性的过氧化物酶的活性； ②0.05 M TBS漂洗3次，每次5 min；加入supermix（0.05 M TBS、0.9%NaCl、0.25%明胶和 0.5%Triton X-100， pH=7.6）稀释的一抗，室温下孵育2 h后于4℃孵育过夜（大于14 h）；
PNAS 2013,110 (9):3543-3548
免疫荧光技术

免疫荧光技术：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记， 试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧
光素，这种免疫技术称为免疫荧光技术。
三结合：
抗原抗体反应的高度特异性
优点：
特异性强、敏感性高、速度快， 结果直观，可以检疫和定位微量抗原。