免疫学及免疫学检验标记技术(ppt 88页)
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医学免疫学免疫学检测技术ppt课件
14
双抗体夹心法、间接法ELISA
15
间接法ELISA
16
ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
12
免疫荧光法
13
2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
10
II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
21
3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
22
（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
双抗体夹心法、间接法ELISA
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间接法ELISA
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ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
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免疫荧光法
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2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
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II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
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3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
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（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
《免疫标记技术》PPT课件_OK
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48
• 如抗原纯度高，可直接包被固相。 • 如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用
捕获包被法。即先包被与固相抗原相应的抗体，再 加入抗原形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质， 然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
49
• 捕获包被法：临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获 包被法。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体， 因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将 竞争结合固相抗原而使部份IgM抗体不能结合到固相 上。因此用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体。 此时必须先将标本用抗IgG抗体处理，以除去IgG干 扰。
29
• 竞争法：是将特异性抗体吸附于固相载体表面，此 过程称为包被（coated），或叫致敏。经洗涤后分成 两组，一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；另 一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色， 这两组底物的降解量之差，即为所要测定的未知抗 原量。
30
竞争法
31
• 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。 因此，常用对小分子抗原如激素和药物类的测定。
– 应用酶标测定仪可作定量分析、敏感度可达ng水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。 这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长 时间。
22
23
– 目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。 前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原，后者主要测 定可溶性抗原与抗体。
– 本法既无放射性污染又不需昂贵的测试仪器，且试剂 稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可定 性也可定量分析等，已广泛用于免疫学、微生物学、 寄生虫学、肿瘤学和细胞因子检测等领域。
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• 如抗原纯度高，可直接包被固相。 • 如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用
捕获包被法。即先包被与固相抗原相应的抗体，再 加入抗原形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质， 然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
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• 捕获包被法：临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获 包被法。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体， 因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将 竞争结合固相抗原而使部份IgM抗体不能结合到固相 上。因此用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体。 此时必须先将标本用抗IgG抗体处理，以除去IgG干 扰。
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• 竞争法：是将特异性抗体吸附于固相载体表面，此 过程称为包被（coated），或叫致敏。经洗涤后分成 两组，一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；另 一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色， 这两组底物的降解量之差，即为所要测定的未知抗 原量。
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竞争法
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• 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。 因此，常用对小分子抗原如激素和药物类的测定。
– 应用酶标测定仪可作定量分析、敏感度可达ng水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。 这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长 时间。
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– 目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。 前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原，后者主要测 定可溶性抗原与抗体。
– 本法既无放射性污染又不需昂贵的测试仪器，且试剂 稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可定 性也可定量分析等，已广泛用于免疫学、微生物学、 寄生虫学、肿瘤学和细胞因子检测等领域。
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《免疫标记技术》课件
胶体金标记抗体和抗原的制备
胶体金颗粒的制备： 通过化学方法将金 离子还原为胶体金 颗粒
抗体或抗原的制备： 通过生物技术方法 制备特异性抗体或 抗原
标记反应：将胶体 金颗粒与抗体或抗 原进行标记反应， 形成胶体金标记抗 体或抗原
纯化：通过离心、 过滤等方法对胶体 金标记抗体或抗原 进行纯化，去除杂 质和未结合的胶体 金颗粒
确性
实验室安全与防护
实验室环境：保持清洁、通风 良好
实验操作：遵守操作规程，避 免交叉污染
防护设备：使用防护服、手套、 口罩等防护设备
废弃物处理：妥善处理废弃物， 避免环境污染
07
免疫标记技术的未来发 展
新技术的应用和展望
免疫标记技 术在疾病诊 断中的应用
免疫标记技 术在药物研 发中的应用
免疫标记技 术在食品安 全检测中的 应用
镜ห้องสมุดไป่ตู้察等。
04 免疫酶技术
酶标抗体和酶标抗原的制备
酶标抗体的制 备：通过免疫 反应，将酶与 抗体结合，形
成酶标抗体
酶标抗原的制 备：通过化学 方法，将酶与 抗原结合，形
成酶标抗原
酶标抗体和酶 标抗原的纯化： 通过色谱法、 电泳法等方法
进行纯化
酶标抗体和酶 标抗原的保存： 低温保存，避 免酶的活性降
交叉学科融合与创新
免疫标记技术与生物医学的融合：提高疾病诊断和治疗效果
免疫标记技术与纳米技术的融合：开发新型免疫标记材料和检测方法
免疫标记技术与人工智能的融合：实现自动化、智能化的免疫标记检测和 分析 免疫标记技术与大数据、云计算的融合：提高免疫标记数据的处理和分析 效率，为疾病预防和治疗提供更准确的信息支持。
荧光免疫标记应用： 细胞标记、蛋白质 标记、DNA标记 等
免疫标记技术PPT参考幻灯片
14
ELISA基本的实验过程
15
【实验器材】
1、AFP诊断试剂盒 2、AFP阳性对照品，阴性对照品，待检品 3、微量加样器、温箱
16
【操作步骤】
1. 将包被孔编号，分别加入阳性对照、待测样品及阴性对 照各50ul
2. 在各孔内加入酶结合物1滴，37℃温育30分钟 3. 甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液1滴，摇
hCG
24
【实验原理】
25
【操作步骤】
1.待测样品、检测试纸和其它检测材料等恢复到 室温后检测 2.将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中， 5秒钟后取出平放，5分钟内观察结果
注意：测试纸插入尿液深度不可超过MAX标志 线
26
【实验结果】
阳 阴 无性效：
27
思考题
1、免疫标记技术的特点是什么？ 2、在酶免疫标记技术中，最常用的酶是
医学免疫学实验四 免疫标记技术
Immunolabeling Technique
主讲：谢永生 病原生物学与免疫学教研室
1
简介
免疫标记技术(immunolabeling technique) 是指用荧光素、酶、放射性同位素等对抗 体或抗原进行标记，然后再通过检测标记 物来观察抗原抗体反应的实验技术。
优点：特异、敏度和快速； 可定性、定量和定位
4
放射免疫技术
◆ 放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、 精密度好的优点，常用于各种激素、微量 蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的 测定，但具有放射污染的缺点。
5
免疫酶技术
◆ 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高 效催化作用有机结合的一种方法。
◆ 常用的酶： – 辣根过氧化物酶(HRP) – 碱性磷酸酶(AP)
ELISA基本的实验过程
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【实验器材】
1、AFP诊断试剂盒 2、AFP阳性对照品，阴性对照品，待检品 3、微量加样器、温箱
16
【操作步骤】
1. 将包被孔编号，分别加入阳性对照、待测样品及阴性对 照各50ul
2. 在各孔内加入酶结合物1滴，37℃温育30分钟 3. 甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液1滴，摇
hCG
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【实验原理】
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【操作步骤】
1.待测样品、检测试纸和其它检测材料等恢复到 室温后检测 2.将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中， 5秒钟后取出平放，5分钟内观察结果
注意：测试纸插入尿液深度不可超过MAX标志 线
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【实验结果】
阳 阴 无性效：
27
思考题
1、免疫标记技术的特点是什么？ 2、在酶免疫标记技术中，最常用的酶是
医学免疫学实验四 免疫标记技术
Immunolabeling Technique
主讲：谢永生 病原生物学与免疫学教研室
1
简介
免疫标记技术(immunolabeling technique) 是指用荧光素、酶、放射性同位素等对抗 体或抗原进行标记，然后再通过检测标记 物来观察抗原抗体反应的实验技术。
优点：特异、敏度和快速； 可定性、定量和定位
4
放射免疫技术
◆ 放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、 精密度好的优点，常用于各种激素、微量 蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的 测定，但具有放射污染的缺点。
5
免疫酶技术
◆ 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高 效催化作用有机结合的一种方法。
◆ 常用的酶： – 辣根过氧化物酶(HRP) – 碱性磷酸酶(AP)
免疫学及免疫学检验标记技术
免疫学及免疫学检验标记技术引言免疫学是研究机体对抗外源性物质或自身异常细胞的防御机制的学科，它对于认识免疫系统的结构和功能，以及预防和治疗感染、免疫性疾病等方面具有重要意义。
而免疫学检验是一种通过检测人体内的免疫反应来确定是否存在某种疾病的方法。
为了更准确地进行免疫学检验，研究人员开发了一系列免疫学检验标记技术，用于标记和检测疾病相关抗原和抗体。
主体免疫学基础知识免疫学是一门研究机体对抗病原微生物、肿瘤细胞等外来物质及异常细胞的防御机制的学科。
人体免疫系统主要由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。
免疫细胞包括T细胞、B细胞、巨噬细胞等，而免疫分子则包括抗体、细胞因子等。
免疫反应可分为自然免疫和适应性免疫两种类型。
自然免疫是人体先天性的免疫防御机制，能快速对抗病原微生物的入侵。
适应性免疫是通过识别抗原并生成特异性抗体或细胞免疫反应来应对感染和疾病的。
免疫学检验标记技术概述免疫学检验标记技术是一种通过标记特定抗原或抗体用于检测的方法。
常用的标记技术包括酶联免疫吸附检测（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、荧光免疫分析（FIA）等。
这些技术能够高度特异性地检测抗原和抗体，广泛应用于临床诊断、药物开发等领域。
酶联免疫吸附检测（ELISA）酶联免疫吸附检测（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学检验标记技术。
它通过将抗原或抗体与酶标记物结合，在固相载体上形成免疫复合物，通过酶的测定手段来检测样品中的特定抗原或抗体。
ELISA技术具有高灵敏度、高特异性、高重复性和简单性等优点，广泛应用于临床检验和科研领域。
放射免疫分析（RIA）放射免疫分析（Radioimmunoassay）是一种利用放射性同位素标记特定抗原或抗体进行检测的技术。
它通过测定放射性同位素的放射性衰变来定量分析样品中的抗原或抗体。
RIA技术具有高灵敏度和高特异性的优点，但由于涉及放射性物质的使用，其操作相对复杂且具有一定的安全风险。
免疫检测技术ppt课件
各实验室操作不规范，质量难以保证。有学者认为ELISA 技术已逐步走向退化，可能会逐步退出临床实验室。
• 化学发光免疫测定法出现于20世纪90年代初，是一种新
型标记免疫测定技术
• 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其机
制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化
学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升
• 标记物及其类别 • 常见三大免疫标记检测原理
• 随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学
理论的建立，使大量免疫学检测技术被不 断地创新、发明；在临床疾病诊治的应用 中也不断地推陈出新。目前应用免疫学原 理检测的检验项目占到三级综合医院检验 科全部检验项目的1／4，医疗收入约占1／
• 三大常使用标记物质
土元素，需要外在的稳定光源照射，光的波长产生stoke位移，并
有一个时间滞后以化便学于发检光测波长改变后的光子时数间量分。辩荧光
标记物 酶-发光底物、发光剂
稀土离子，如铕
稳定性
稳定性非常好
影响被标记物的生物活性与免 疫活性
灵敏度
灵敏
稍高于化学发光
反应体系
接近中性
酸性，易引起蛋白质变性
包被技术
不透明微量孔壁吸附, 提高分析灵敏度,降低
大
• 标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费 • 操作步骤很难自动化 • 反应时间长，出报告时间长
• 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，加入酶
标抗原或抗体、酶反应的底物后，底物被酶催化 变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量 直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或 定量分析
1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法（ELISA），这种 非放射标记免疫测定在临床检验，特别是感染性疾病的诊断中取得了 广泛应用。 缺点 ➢试剂制备困难 ➢操作步骤复杂，耗时长 ➢影响因素多，质量控制难以保证 ➢最后测定的是颜色的光密度，其精密度、敏感性、可检测范围远不 如发光免疫技术
• 化学发光免疫测定法出现于20世纪90年代初，是一种新
型标记免疫测定技术
• 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其机
制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化
学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升
• 标记物及其类别 • 常见三大免疫标记检测原理
• 随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学
理论的建立，使大量免疫学检测技术被不 断地创新、发明；在临床疾病诊治的应用 中也不断地推陈出新。目前应用免疫学原 理检测的检验项目占到三级综合医院检验 科全部检验项目的1／4，医疗收入约占1／
• 三大常使用标记物质
土元素，需要外在的稳定光源照射，光的波长产生stoke位移，并
有一个时间滞后以化便学于发检光测波长改变后的光子时数间量分。辩荧光
标记物 酶-发光底物、发光剂
稀土离子，如铕
稳定性
稳定性非常好
影响被标记物的生物活性与免 疫活性
灵敏度
灵敏
稍高于化学发光
反应体系
接近中性
酸性，易引起蛋白质变性
包被技术
不透明微量孔壁吸附, 提高分析灵敏度,降低
大
• 标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费 • 操作步骤很难自动化 • 反应时间长，出报告时间长
• 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，加入酶
标抗原或抗体、酶反应的底物后，底物被酶催化 变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量 直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或 定量分析
1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法（ELISA），这种 非放射标记免疫测定在临床检验，特别是感染性疾病的诊断中取得了 广泛应用。 缺点 ➢试剂制备困难 ➢操作步骤复杂，耗时长 ➢影响因素多，质量控制难以保证 ➢最后测定的是颜色的光密度，其精密度、敏感性、可检测范围远不 如发光免疫技术
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B/F 60 (％)
50
40 30 20
10
0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 4.8 5.6 Ag(ng/ml)
免疫学及免疫学检验
测定方法与步骤
1.抗原抗体反应：平衡法或非平衡法 2.分离结合与游离标记物
沉淀剂沉淀复合物，离心分离。如第二抗体沉淀法、 聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分离彻 底，迅速；分离试剂和过程不影响反应平衡；操作 简便，重复性好且经济。
免疫学及免疫学检验
免疫学及免疫学检验
双位点IRMA 先用固相抗体与抗原 反应结合,然后再用过量的标记抗体 与已结合于固相抗原的另一抗原决 定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记 抗体复合物,洗弃反应液中剩余的标 记抗体,测定固相上的放射性。
免疫学及免疫学检验
免疫学及免疫学检验
IRMA与RIA的异同点
⋯⋯⋯
免疫学及免疫学检验
第八章 放射免疫技术
类型：
放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA） 免疫放射分析（immunoradiometric
assay,IRMA）
广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结 合分析（使用配体研究受体）。
特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、 重复性好等
免疫学及免疫学检验
反应原理 RIA为竞争抑制，测得放射性的量与受检
抗原呈反比。IRMA为非竞争结合，剂量反应曲线为正相关 的直线关系。
特异性 在双位点IRMA中，一般均应用针对不同位
点的单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的 RIA。
检测范围 通常RIA的工作范围为2-3个数量级，而
免疫学及免疫学检验
放射免疫技术的用
常用于各种激素、微量蛋白、肿瘤 标志物和药物等微量物质的测定。
及组胺残基上的氢原子 方法： 直接标记法
氯胺T法和乳过氧化物酶法
间接标记法 联接标记法
免疫学及免疫学检验
适用分子 原理
特点
缺点
直接标记 肽类、蛋 存在酪氨 操作简便、不适于活
白质、酶 酸、组胺 易标记、 性功能区
残基等基 比放射性 的残基标
团
高
记
间接标记 甾类化合 不存在酪 可避免氧 添加基团
物、核苷 氨酸、组 化／还原 可能影响
酸等小分 胺残基等 剂对被标 被标记物
子化合物 基团,需 记物活性 活性
添加
的损伤等
免疫学及免疫学检验
标记物纯化
对游离的125I等试剂与标记物 进行分离
方法：分子筛凝胶过滤；离子 交换层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）；高效液相色谱（HPLC）
免疫学及免疫学检验
3.放射性测定及数据处理 晶体闪烁计数仪(γ射线)或液体闪烁计数仪( β射线) 绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。
免疫学及免疫学检验
免疫放射分析（IRMA）
基本原理
单位点IRMA： 利用过量标记抗体与 待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合 物，反应平衡后，用固相抗原结合反应 液中剩余的未结合标记抗体并将其分离， 测定上清液的放射量。
抗血清的稀释度。
免疫学及免疫学检验
放射免疫分析（ RIA ）
基本原理
采用定量的标记抗原（Ag＋）和非 标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异 性抗体（Ab）的反应。
免疫学及免疫学检验
免疫学及免疫学检验
免疫学及免疫学检验
以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F 与Ag的量变存在着函数关系。
标记物 在RIA中 核素标记抗原，抗原有不同种类，根
据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。在 IRMA中 核素标记抗体。抗体为蛋白质，有利于碘化标记， 不同抗体标记方法基本相同。标记抗体的比活度高，提高了 分析的灵敏度。
反应速率 反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中
标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所 以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要 用高亲和力的多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低的单 克隆体也能得到满意的结果。
标记免疫技术
医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 二OO四年三月
免疫学及免疫学检验
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
灵敏性
免疫学及免疫学检验
标记免 疫技术
免疫组 化技术
免疫测 定技术
示踪物及 标记技术
放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光技术 金免疫技术
RIMA可达3个数量级以上。
免疫学及免疫学检验
分析误差 RIA中加入的抗体和标记抗原都是定量的，
加样误差可严重影响测定结果。IRMA中标记和固相抗体在 反应中都是过量的，只有受检标本的加样误差才会影响分 析结果。因此，IRMA的批内和批间变异均比较小。
其他
RIA可以测定大分子量与小分子量的物质，双位点 IRMA只能测定在分子上具有2个以上抗原表位的物质。在 RIA中应用的为多克隆抗体，亲和力和特异性要求较高， 但用量很少。IRMA中标记抗体和固相抗体用量较多，一般 均用来源丰富、特异性较高的单克隆抗体。
辐射自损伤大，对标记物
免疫学及免疫学检验
抗血清鉴定
多克隆抗体的抗血清是放射免疫分
析的主要试剂之一，其质量直接影响方 法的特异性和灵敏度。
亲合力
选用亲和常数K值大(109~1012 L//mol)抗血清
特异性
其程度可直接影响结果的准确性
滴度
最大稀释度。在本技术方法中是指结合50％标记抗原时的
免疫学及免疫学检验
标记物:
常用的核素有两大类 γ射线： 131I、125I、57Cr和60Co β射线：14C、3H和32P。 使用最广泛的是：125I
①性质活泼、易制备标记物 ②对被标记物的免疫活性影响小 ③测量方法简便、已推广 ④半衰期较长、核素丰度高
免疫学及免疫学检验
标记方法
125I的标记 原理：取代分子中酪氨酸或酪胺残基
标记物鉴定
放射化学纯度 单位标记物中结合在被标记物上的放射性
占总放射性的百分率。一般要求大于95％。
免疫活性
标记过程中，被标记物活性损伤程度。B/T％>80％，
B/T％ ↑ 抗原损伤↓。
比放射性
单位化学量标记物中所含的放射性强度. 常用Ci/g、
mCi/mg、Ci/mmol等单位表示。
比放射性↑ 方法更灵敏；过高 免疫活性影响大，储存稳定性差 。
50
40 30 20
10
0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 4.8 5.6 Ag(ng/ml)
免疫学及免疫学检验
测定方法与步骤
1.抗原抗体反应：平衡法或非平衡法 2.分离结合与游离标记物
沉淀剂沉淀复合物，离心分离。如第二抗体沉淀法、 聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分离彻 底，迅速；分离试剂和过程不影响反应平衡；操作 简便，重复性好且经济。
免疫学及免疫学检验
免疫学及免疫学检验
双位点IRMA 先用固相抗体与抗原 反应结合,然后再用过量的标记抗体 与已结合于固相抗原的另一抗原决 定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记 抗体复合物,洗弃反应液中剩余的标 记抗体,测定固相上的放射性。
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IRMA与RIA的异同点
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第八章 放射免疫技术
类型：
放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA） 免疫放射分析（immunoradiometric
assay,IRMA）
广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结 合分析（使用配体研究受体）。
特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、 重复性好等
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反应原理 RIA为竞争抑制，测得放射性的量与受检
抗原呈反比。IRMA为非竞争结合，剂量反应曲线为正相关 的直线关系。
特异性 在双位点IRMA中，一般均应用针对不同位
点的单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的 RIA。
检测范围 通常RIA的工作范围为2-3个数量级，而
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放射免疫技术的用
常用于各种激素、微量蛋白、肿瘤 标志物和药物等微量物质的测定。
及组胺残基上的氢原子 方法： 直接标记法
氯胺T法和乳过氧化物酶法
间接标记法 联接标记法
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适用分子 原理
特点
缺点
直接标记 肽类、蛋 存在酪氨 操作简便、不适于活
白质、酶 酸、组胺 易标记、 性功能区
残基等基 比放射性 的残基标
团
高
记
间接标记 甾类化合 不存在酪 可避免氧 添加基团
物、核苷 氨酸、组 化／还原 可能影响
酸等小分 胺残基等 剂对被标 被标记物
子化合物 基团,需 记物活性 活性
添加
的损伤等
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标记物纯化
对游离的125I等试剂与标记物 进行分离
方法：分子筛凝胶过滤；离子 交换层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）；高效液相色谱（HPLC）
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3.放射性测定及数据处理 晶体闪烁计数仪(γ射线)或液体闪烁计数仪( β射线) 绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。
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免疫放射分析（IRMA）
基本原理
单位点IRMA： 利用过量标记抗体与 待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合 物，反应平衡后，用固相抗原结合反应 液中剩余的未结合标记抗体并将其分离， 测定上清液的放射量。
抗血清的稀释度。
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放射免疫分析（ RIA ）
基本原理
采用定量的标记抗原（Ag＋）和非 标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异 性抗体（Ab）的反应。
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以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F 与Ag的量变存在着函数关系。
标记物 在RIA中 核素标记抗原，抗原有不同种类，根
据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。在 IRMA中 核素标记抗体。抗体为蛋白质，有利于碘化标记， 不同抗体标记方法基本相同。标记抗体的比活度高，提高了 分析的灵敏度。
反应速率 反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中
标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所 以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要 用高亲和力的多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低的单 克隆体也能得到满意的结果。
标记免疫技术
医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 二OO四年三月
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标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
灵敏性
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标记免 疫技术
免疫组 化技术
免疫测 定技术
示踪物及 标记技术
放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光技术 金免疫技术
RIMA可达3个数量级以上。
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分析误差 RIA中加入的抗体和标记抗原都是定量的，
加样误差可严重影响测定结果。IRMA中标记和固相抗体在 反应中都是过量的，只有受检标本的加样误差才会影响分 析结果。因此，IRMA的批内和批间变异均比较小。
其他
RIA可以测定大分子量与小分子量的物质，双位点 IRMA只能测定在分子上具有2个以上抗原表位的物质。在 RIA中应用的为多克隆抗体，亲和力和特异性要求较高， 但用量很少。IRMA中标记抗体和固相抗体用量较多，一般 均用来源丰富、特异性较高的单克隆抗体。
辐射自损伤大，对标记物
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抗血清鉴定
多克隆抗体的抗血清是放射免疫分
析的主要试剂之一，其质量直接影响方 法的特异性和灵敏度。
亲合力
选用亲和常数K值大(109~1012 L//mol)抗血清
特异性
其程度可直接影响结果的准确性
滴度
最大稀释度。在本技术方法中是指结合50％标记抗原时的
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标记物:
常用的核素有两大类 γ射线： 131I、125I、57Cr和60Co β射线：14C、3H和32P。 使用最广泛的是：125I
①性质活泼、易制备标记物 ②对被标记物的免疫活性影响小 ③测量方法简便、已推广 ④半衰期较长、核素丰度高
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标记方法
125I的标记 原理：取代分子中酪氨酸或酪胺残基
标记物鉴定
放射化学纯度 单位标记物中结合在被标记物上的放射性
占总放射性的百分率。一般要求大于95％。
免疫活性
标记过程中，被标记物活性损伤程度。B/T％>80％，
B/T％ ↑ 抗原损伤↓。
比放射性
单位化学量标记物中所含的放射性强度. 常用Ci/g、
mCi/mg、Ci/mmol等单位表示。
比放射性↑ 方法更灵敏；过高 免疫活性影响大，储存稳定性差 。