胶体金金标检验法

胶体金（金标）检验法

胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。免疫胶体金技术的基本原理是：氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见紫色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。

为什么霍乱可以用胶体金（金标）检验法进行快速筛查？

霍乱弧菌快速检测卡是利用单克隆抗体胶体金标记技术和膜层析技术研制而成，用于定性检测样本中可能存在的霍乱弧菌的特异性抗原A及O139血清型。首先按常规方法制备并筛选出效价高的抗O1群A 抗原和抗O139抗原的单抗细胞株。然后采用枸缘酸钠还原法制备胶体金颗粒，选择玻璃纤维吸附最适浓度的金标抗体。按常规方法免疫家兔，制备霍乱弧菌的多克隆抗体。根据检测对象（疑似病人粪便）的特殊性，研制了特异的稀释液。一方面可裂解细菌，释放抗原，提高检测敏感性，另一方面可起到防止污染的作用。经二年多的反复试制，我公司完成的霍乱弧菌O1群（O139）快速检测试纸，其对霍乱弧菌最低敏感性10分钟内106菌/ml阳性，达到临床最低检出量的要求，符合卫生部《霍乱防治手册》要求，且对高浓度的菌液109 菌/ml无前置反应；用萃取液、正常人粪便标本及其它大肠中寄生菌进行的特异性鉴定表明，该试纸条特异性为100%

金特敏? 霍乱快速检测卡的特点是什么？

最低检出量：不低于105cfu/ml适合临床需要。快速出结果：稀释直接裂解细菌，10分钟观察结果满足疾病控制要求。便利使用：独立包装，“插”式设计，操作简捷，避免二次污染。稳定性好：无须冷藏，常温保存18个月。

质控线C线的意义是什么？

将羊抗鼠抗体包被于NC膜，形成对照线C，同时在NC膜的一端固定胶体金标记的霍乱弧菌A抗原单隆抗体。检测时，样品依靠层析作用，沿着NC膜向前爬行。不论样品中是否含霍乱弧菌，也就是说无论金标抗体是否结合霍乱弧菌抗原，都有一部分能与羊抗鼠抗体结合，形成紫色线的对照线C，即出现质控线C线，说明实验是有效的。

为什么T线可作为检测线？

采用双抗体夹心法，在NC膜包被羊抗鼠抗体同时，在另一侧包被霍乱弧菌O1（O139）多抗，形成T 检测线。疑似霍乱病人的粪便样品中若含有一定数量的霍乱弧菌，则与检测端的金标抗体结合，向前爬行

经过检测线时，金标抗体－抗原复合物再与多抗结合，在局部沉积，出现紫色线，形成T检测线，反之则不出现紫色T检测线。

为什么C、T两条线都显色才可判为阳性？

因为采用双抗体夹心法，同时在NC膜上包被了羊抗鼠抗体和霍乱弧菌O1多抗，被检样品中若含霍乱弧菌，在与标记在检测卡检测端的胶体金霍乱抗原结合后，沿NC膜爬行，与在T线形成胶体金—霍乱弧菌单克隆抗体—霍乱弧菌A（O139）抗原—霍乱弧菌O1多抗混合物，与C线形成胶体金—霍乱弧菌单克隆抗体—羊抗鼠抗体混合物，即出现两条线才为阳性。

只有C线，无T线说明了什么？

此结果判定为阴性，在检测线T线处，无胶体金免疫复合物形成，故不显色；在质控C线处形成胶体金—霍乱弧菌单克隆抗体—羊抗鼠抗体混合物，说明胶体金标记正常，实验结果有效。

C、T两线都不显色怎么办？

若经重复检验后，C、T两线仍不显色，说明胶体金标记失败，检测卡因受潮等原因失效。

为什么会出现假阳性？

目前按卫生部《霍乱防治手册》要求，霍乱弧菌培养阳性才可认定为确诊病例，假阳性是针对霍乱弧菌培养阳性结果（金标准）而言，根据临床验证应用以来的结果显示，我们认为可能与以下三种情况有关：* 根据本检测卡的检测原理，是检测疑似病人粪便中的霍乱弧菌O1 A抗原或O139抗原，与是否含有活菌无关，只要感染过霍乱弧菌，且达到一定的抗原量即可显示检测阳性，病人即使服药后亦可检出阳性。* 在某省的临床验证中，曾出现104/ml即可检出的情况，高于卫生部《霍乱防治手册》中106 -108/ml的检出线。曾有一检测卡阳性标本，经4次碱胨水增菌后，才培养出活菌。

* 在经中国药品生物制品检定所的企业标准中，本检测卡与副溶血弧菌、溶藻弧菌、麦氏弧菌、河弧菌、创伤弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、气单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等14种常见肠道细菌无交叉反应，除此外是否还有其他的交叉反应阳性细菌，我们正在探讨。

假阴性会出现吗？

任何诊断试剂都有一定的漏诊率和误诊率，由于霍乱的特殊性，我们尽量提高检出率，提高灵敏度、特异度，减少漏诊（假阴性）。三个省级疾控中心1680例临床检测的灵敏度是98.61%，特异度是100%。出现假阴性可能与样品中的细菌含量低、或检测卡失效等因素（受潮、胶体金标记失败等）有关。

为什么一定要用稀释液？

为使检测端的金标单抗与霍乱弧菌O1菌体抗原A（O139）更充分地结合，要使霍乱弧菌抗原充分暴露，有必要使用稀释液裂解细菌，这一方面可提高检测敏感性，另一方面可起到防止污染的作用。我们查阅了有关文献，并多次实验验证，选择了特异性的稀释液裂解细菌，所以在检测时，一定要将标本与稀释液充分混合，裂解细菌，只有这样才能提高检出率，达到尽早筛查疑似病人，控制疫情的目的。