免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫组化原理步骤及要注意的事项
免疫组化原理步骤及要注意的事项免疫组化是一种常用的细胞和组织学检测方法，通过利用免疫学原理，使用特异性抗体对目标分子进行检测，主要应用于分析蛋白质分子的表达，可以帮助研究者了解不同细胞和组织中蛋白质的分布和功能，对于疾病的诊断和治疗也具有重要意义。
下面将介绍免疫组化的原理、步骤及要注意的事项。
原理：免疫组化是利用特异性抗体与抗原发生特异性反应的原理来进行的。
主要包括两种反应：免疫定位反应和信号测定反应。
-免疫定位反应：通过组织抗原表面与抗体的结合，将目标分子定位于细胞或组织的特定位置。
-信号测定反应：将已定位的抗原-抗体复合物进行颜色或荧光标记，发出可见信号，用于检测和记录。
步骤：免疫组化的主要步骤包括标本制备、抗原修复、非特异性反应阻断、一抗染色、二抗染色和显微镜观察。
1.标本制备：选择合适的组织样本，常用的样本有组织切片、细胞涂片和细胞悬液。
样本制备主要包括取材、固定、包埋等步骤，其中固定是关键步骤，常用的固定剂有福尔马林、乙酸乙酯和交联剂等。
2.抗原修复：组织样本在固定过程中往往会导致抗原的空间结构改变和蛋白质交联，使其成为免疫组化的目标结构。
为了恢复抗原的免疫反应性，常常需要进行抗原修复，包括酶解法、消化法、热解法等。
3.非特异性反应阻断：为了减少非特异性结合，需要采取一些措施来阻断非特异性背景信号。
常用的方法包括用蛋白质阻断剂进行封闭、用牛血清白蛋白或BSA预处理等。
4.一抗染色：在经过上述步骤之后，用特异性抗体与目标抗原结合，构成抗原-抗体复合物。
为了增强抗原-抗体的结合力，常采用多种放大手段，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或二级抗体等。
5.二抗染色：一抗与抗原结合后，用特异性二级抗体进行检测，二级抗体上带有标记物（如荧光素、酶等），对抗原-抗体复合物进行定位。
6.显微镜观察：通过显微镜观察，检测特定信号的强度和位置，同时进行结果的记录和分析。
注意事项：-选择合适的抗体：免疫组化的关键在于合适的抗体选择，需要选择高度特异性和高亲和力的抗体。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
Envision系统的优点
敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单
免疫组化技术常见问题及处理方法
石蜡切片标本的固定
1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗
免疫组化技术常见问题及处理方法
SP法
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
免疫组化技术常见问题及处理方法
Western blotting、ELISA 与免疫组化的异同
• Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织 或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化 技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位， 但敏感性远远低于免疫组化技术
• ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定 量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一
化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 • 4）滴加一抗，室温或 37℃孵育30-60分钟，或 4℃过夜，PBS或
免疫组化经验总结第一部分步骤及常见问题
免疫组化经验总结第⼀部分步骤及常见问题免疫组化技术流程及常见问题解析（修改版）说明：加粗的字体部分是我认为要注意的地⽅和提出的问题，⽽红⾊字体部分表⽰还不太确定的第⼀部分载玻⽚与盖玻⽚的处理：载玻⽚与盖玻⽚重铬酸钾浸泡1-2天，⽔清洗直到没有颜⾊为⽌，放⼊⽆⽔⼄醇中，⽤纱布擦⼲（如需开展原位杂交，还需将玻⽚240℃烤2h），载玻⽚涂上多聚赖氨酸，37度烘⼲，备⽤第⼆部分冰冻切⽚前期处理1冰冻切⽚组织处理。
肿瘤组织从体内取出后，迅速放于液氮中冰冻，然后放于－８０度保存，切⽚时先⽤OCT 固定（尽量减少⽓泡⽣成），-20度20-30分钟固定好后即可切⽚（最好时间长⼀点，时间太短容易使切⽚卷起，也使切⽚不均匀）。
2切⽚，切⽚时要慢，稳⼀点，切好后⽤涂有多聚赖氨酸的载玻⽚粘取切下的组织⽚，粘的时候有⼀个向内拉伸的动作，这样可以使组织⽚充分展开。
⽚⼦的厚度⼀般为10um,也有的要切30um（根据需求调整）。
切好的⽚⼦⽴即放⼊4﹪的新配的多聚甲醛中处理8-10分钟(或在丙酮中固定10S，具体⽤什么固定要看⼀抗的要求)3 PBS中洗⼀下（约2分钟）去掉残留的多聚甲醛。
（丙酮切⽚的话省去本步骤）（从冰箱中取出的⽚⼦最好在PBS中浸泡2分钟，再往下做。
如果打孔不充分，可以在PBS 中加⼊triton x-100洗三次。
再⽤PBS洗⼏次，除去triton x-100）4 ⽚⼦切好后可放于37度烘⼲，但是时间不要太长，2-3⼩时即可，或者室温风⼲，然后放于-20度或-80度冰箱可长期储存。
但是⽤丙酮或有机溶剂固定的⽚⼦上如果还有其他有机溶性的染料的话建议尽快做掉，因为有机溶剂在长期储存中（⼀个⽉）缓慢作⽤的话，也会使染料变得模糊。
第三部分加抗体5 10％正常⼭⽺⾎清（PBS稀释，可加少量的triton x-100打孔），封闭（依⼆抗的来源⽽定），室温孵育30分钟。
6倾去⾎清，擦⼲各组织之间的⽔滴，防⽌有⽔滴粘连。
滴加适当⽐例稀释的⼀抗1：100左右或⼀抗⼯作液，37℃孵育1~2⼩时或4℃过夜，4℃过夜后需在37℃或室温复温30分钟。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理1. 引言免疫组化，听起来就像科学家们的秘密武器，其实它在病理学和生物医学中扮演着不可或缺的角色。
简单来说，这个方法能帮助我们在组织切片中找出特定的蛋白质，就像在侦探故事中找线索一样。
你可能会想：“这玩意儿到底是怎么回事？”别急，今天就带你深入了解免疫组化的每一步，绝对让你大开眼界。
2. 准备工作2.1 组织样本的获取首先，我们得有个“样本”。
这就像做菜，得有食材。
我们通常会从病人那儿获取组织切片，可能是肿瘤、炎症等地方。
切片越薄，越能让我们看的清楚，像是把面包切得薄薄的，涂上黄油才好吃。
2.2 切片处理接下来，把这些切片用固定剂处理，最常用的是福尔马林。
这个步骤就像给切片穿上“保护衣”，确保里面的蛋白质不会在过程中跑掉。
然后，我们还得用乙醇脱水，把水分抽走，这样才不会稀释我们要找的“宝贝”。
最后，用二甲苯清洗，让切片变得干净透亮，准备好迎接接下来的挑战。
3. 免疫反应3.1 抗体的选择免疫组化的核心就是抗体。
选择抗体就像选队友，得找对的！我们得确保这个抗体是专门针对我们想要检测的那个蛋白质的。
想象一下，你在寻找某个特定的明星，当然得找那个最熟悉的粉丝来帮忙。
3.2 抗体结合一旦选择好抗体，就把它涂在切片上，等待它和目标蛋白质结合。
这个过程就像约会，抗体和蛋白质在切片上“相遇”，彼此结合。
结合得越紧密，后面的结果就越清晰！4. 显色反应4.1 连接二级抗体接下来，我们要用二级抗体来“加油”。
这一步是让我们能看到“结合”的效果。
二级抗体会识别一级抗体，并且带上标记，像给你的队伍加上标志，显得更亮眼。
4.2 显色剂的使用然后，加入显色剂，这一步就像给你的作品上色，瞬间让切片变得活灵活现。
显色剂和标记结合后，就会产生颜色反应，形成我们最终需要的信号。
这时候，你能看到那些特定蛋白质的位置，就像在黑暗中点亮了灯塔。
5. 观察与分析5.1 显微镜观察当颜色形成后，我们就可以用显微镜观察结果了。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大得难处就是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理,每一步知道为什么这样做,这样您才敢大胆地改革先前得不对得方法步骤。
如抗体孵育条件主要就是抗体浓度、温度、时间,这三者一般就是相互成反比得（相对)，其中浓度就是最重要得先决条件,温度决定反应得速度、时间决定反应得量。
就拿温度来说,可以有4度、室温、37度,我推荐4度最佳,反应最温与,背景较浅；而3７度反应速度较快，时间较短;室温我不太提倡,除非您每次都把环境温度控制在一定得范围,否则,尽量选择前两者。
２、免疫组化最大得优势就是定位与定性。
相比于其她蛋白检测方法,免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，就是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子得转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析得前提就是高质量得染色切片.免疫组化结果也能定量分析,但必须就是背景染色浅而特异性染色较深得情况下，分析最为准确,这种原则可能也就是我们日常审稿时判定研究结果得必备条件。
４、免疫组化实验一定要设置阳性对照与阴性对照。
阳性对照一般就是用肯定表达这种抗原得切片来做；阴性对照一般就是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者就是排除方法与实验系统有无问题;后者就是排除有无一抗外得非特异性染色。
５、免疫组化得应用广泛,就是当前实验研究得最重要方法之一。
如今发ＳCI论文时,明显感觉仅靠量化得数据来发文章很难,加一些形态学数据或图片,老外十分欢迎，可能就是怕您学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否得鉴定标准就是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良得染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟得反应条件、浓度、方法步骤,重复运用于同一性质得切片与同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法,更换一种抗体后,居然连二抗得种属来源都拿错了。
免疫组化鉴定菌种的方法
免疫组化鉴定菌种的方法免疫组化是一种常用的实验技术，用于鉴定菌种和研究细胞和组织之间的相互作用。
该技术基于免疫学原理，通过特异性抗体与靶分子结合来检测菌种的存在和特有的生物学功能。
本文将介绍免疫组化鉴定菌种的原理和常见的实验方法。
一、免疫组化原理免疫组化利用抗体与其特异性蛋白质抗原结合的特性，通过荧光染料或酶标记来检测目标分子的存在。
该技术主要包括以下几个步骤：1.样品处理：菌株或细胞培养液通常需要经过固定、包埋或脱水等处理，以保持其形态和结构的完整性。
2.抗体孵育：将标记有特异性抗体的荧光染料或酶标记与待检测的样品接触，使其与目标抗原结合。
3.清洗：将未结合的抗体去除，以减少非特异性背景信号。
4.信号检测：通过荧光显微镜或酶标测定，观察目标分子的位置和表达水平。
二、免疫组化实验方法1.免疫组化染色法免疫组化染色法是一种常用的实验方法，用于在细胞和组织中检测特定抗原的分布和表达。
该方法可分为直接法和间接法：直接法：将已标记的抗原直接与待检测的组织或细胞接触，然后观察染色结果。
这种方法操作简单、快速，但特异性较差，主要适用于已知抗原的情况。
间接法：通过与辅助抗体结合来增强染色信号的强度和特异性。
首先将待检测样品孵育于特异性抗原的抗体中，然后孵育与特异性抗体结合的辅助抗体，最后使用荧光染料或酶标记的二抗进行检测。
该方法灵敏度高，适用于未知抗原的情况。
2.免疫组化电镜法免疫组化电镜法结合了免疫组化和电子显微镜技术，可用于检测细胞和组织中微小结构的特异性抗原。
该方法主要分为直接法和间接法：直接法：直接将标记有特异性抗体的金或其他金属胶体颗粒与待检测的组织或细胞接触，观察金颗粒在电镜下的位置。
间接法：与免疫组化染色法类似，通过辅助抗体结合来增强信号强度和特异性。
在免疫反应后，使用标记有金或其他金属胶体颗粒的二抗进行检测。
3.免疫组化流式细胞术免疫组化流式细胞术常用于检测细胞表面或细胞内特异的蛋白质抗原。
该方法主要分为两种：直接流式细胞术：将标记有荧光染料的特异性抗体与待检测细胞接触，然后通过流式细胞仪测定细胞的荧光强度和受体数目。
免疫组化实验流程及常见问题
免疫组化实验流程及常见问题1 免疫组化概念原理2 免疫组化染色步骤目录3 结果分析4 常见问题分析※免疫组化原理PART 1免疫组化概念原理※免疫组化样本种类免疫组化概念原理免疫组化学（immunohistochemistry，IHC）应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究样本种类：组织标本和细胞标本两大类，包括石蜡切片（IHC-P）和冰冻切片(IHC-P)，细胞片(ICC)。
※实验步骤流程图※样本取材固定PART 2免疫组化染色步骤※实验步骤讲解实验流程图种器官，优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官(脑，脊髓等)，皮肤、肌肉等可放到最后取。
3.组织块大小：未经灌注的标本组织厚度不要超过1cm 。
5.固定液量：固定液体积为组织的10倍，且组织能在容器内自由移动，不贴壁不沉底，并做好清晰标记。
4.固定液：针对不同的标本特点及实验目的一定要选用正确的固定液，4%多聚甲醛，有致密外膜Carnoy 液，活检用Bouin 。
7.固定温度：常温即可，无需冷藏，切勿冷冻结冰，否则固定液结冰形成冰晶严重破坏组织形态结构6.固定时间：6-24h最佳，固定越久所需修复强度越大，容易出现非特异性。
取材及固定切片选择要保存简单--- 选石蜡片!要速度快---选冰冻片!要结构漂亮---选石蜡片!抗原不稳定---选冰冻片!抗原稳定---石蜡片冰冻片皆可!组织形态结构保存完好顺序：新鲜组织立即投入固定液内固定石蜡切片>组织-80°冷冻后投入固定液内固定石蜡切片>新鲜组织立即投入固定液内固定冰冻切片>组织-80°冷冻后直接冰冻切片。
切多厚?脱蜡步骤石蜡片3-8um ， 一般4-5um;冰冻片5- 15pm,一般8μm水温40-45 ℃, 组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起怎么捞片?烤多久?37 ℃ 过夜或 60 ℃ 1-2h 注意:使用防脱处理的玻片实验步骤切片烤片实验步骤：灭活1内源性过氧化物酶在血管瘤、肝、胎盘、阑尾炎,坏死区域和急性炎症组织含量较高 2显色系统为过氧化物酶 (HRP )系统，该步骤建议一定要做3碱性磷酸酶 (AP )系统以及免疫荧光，该步骤可以不做4在灭活时,如组织片中出现细小且密集的气泡，表示过氧化物酶含量过高，这时用 3%H2O2溶液难以完全阻断，可以用0.5%高碘酸溶液室温条件孵育10min实验步骤柠檬酸盐缓冲液( PH6.0 )和EDTA( PH8.0或9.0)修复液经验证，对于大多数的抗体来说后者使用效果更优固定时间越久，修复强度越强旧标本修复强度强于新鲜标本3修复液的选择1 抗原修复方式4消化酶的选择需格外注意的各种消化酶的最佳工作PH值2消化酶的选择抗体选择1单抗和多抗各有优势，按需选用2 一抗4°C孵育效果最佳，备选37 ℃ 1-2h 3二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配，推荐驴，山羊,绵羊等种属4二抗/SABC -般37 ℃孵育30 min 封闭1 5%BSA是最常用2血清，效果最全面3封闭血清与抗同源，与一抗不能同源封片1 DAB显色用中性树胶封片2免疫荧光建议用抗荧光衰减封片剂3 AEC显色用水溶性封片剂显色1 DAB显色液现用现配2建议镜下控制反应时间3根据显色时间反向优化实验条件※抗原定位※结果分析方法PART 3结果分析抗原定位胞膜型表达胞核型表达胞质型表达胞膜-质型表达胞核-质型表达抗原定位查数据推荐：01 Option here02Option here 评分法:通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度( 0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1-4分为0-25%、26 -50%、51-75%、76-100%) ，最终可以分数想加，再进行比较阳性着色细胞计数法:在40X光镜下,随机选择不重叠的3-5个视野，人工或机器计数阳性着色细胞和总细胞数，比较阳性细胞比率图片软件分析:通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用图片分析软件进行分析，然后进行统计分析即可H-SCORE分析:设置组织切片上所有的深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。
免疫组化技术常见问题及处理方法
染色弱或无信号问题可能是由于抗体浓度过低、孵育时间不 足、组织抗原量少等原因所致。为解决这一问题，可以增加 抗体浓度、延长孵育时间、增强组织抗原的暴露等措施，以 提高染色强度。
染色背景问题
总结词
染色背景是指染色结果中除了目标蛋白外的其他染色，通常表现为整个视野的弥漫性着 色。
详细描述
染色背景问题可能是由于抗体与组织中其他蛋白的交叉反应、组织内源性酶活性、组织 处理过程中产生的物质等所致。为解决这一问题，可以采取使用阻断剂、降低抗体浓度、
定期对仪器设备进行校准，确保 其性能稳定、准确可靠。同时， 对设备进行日常维护，及时排除 故障，保证实验的正常进行。
试剂储存和有效期问题
总结词
试剂的储存和有效期直接关系到实验 结果的可靠性。
详细描述
严格按照试剂说明书进行储存，避免 试剂受潮、光照、高温等不利因素的 影响。关注试剂的有效期，避免使用 过期试剂。
详细描述
固定和保存组织的目的是为了保持组织结构 和抗原性。不同的组织需要不同的固定液和 固定时间，以确保抗原的完整性和稳定性。 同时，组织的保存条件也需严格控制，以防
抗原丢失或降解。
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仪器设备和试剂问题
仪器设备校准和维护问题
总结词
仪器设备校准和维护是确保免疫 组化实验准确性的关键环节。
详细描述
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为了促进免疫组化技术的数据共享和交流，需要建立 统一的数据库和平台，以便研究人员能够共享数据、 交流经验和技巧。此外，应鼓励研究人员在学术会议 和期刊上发表研究成果，促进技术的传播和应用。通 过加强数据共享和交流，可以推动免疫组化技术的进 步和创新，提高其在医学研究中的应用价值。
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免疫组化实验步骤及常见问题分析
免疫组化实验步骤及常见问题分析免疫组化实验步骤及常见问题分析免疫组化实验流程1.样品制备2.组织固定：根据要求收集人或动物的组织用于IHC分析，冲洗并用固定剂（一般用甲醛）进行固定3.组织包埋：将经甲醛固定的组织嵌入石蜡，以长期保持其天然形状和组织结构4.切片安装：将组织样品在切片机上切片，并转移至载玻片上干燥保持其形态5.脱蜡水化：因切片上的石蜡会妨碍染色，所以需将切片上的石蜡溶出，并水化。
脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色（一般的脱蜡水化步骤是：将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3，进行脱蜡水化）。
6.抗原修复：由于组织在甲醛固定过程中，蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。
可以通过高压加热修复抗原，使细胞内抗原决定族暴露，从而提高抗原检测率。
7.非特定位点封闭：为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性，可以选用BSA、羊血清等封闭非特异性结合位点。
封闭血清来源一般与二抗保持一致，室温封闭10-30min。
8.样品染色一抗、二抗孵育：抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。
在4℃下反应缓慢，背景较浅；37℃反应较快时间较短；而室温介于两者之间，选择室温有利于实验的进行。
二抗一般室温孵育30min。
底物显色：基于与酶缀合的二抗，抗原通过生色或荧光方式直接检测。
复染封片：组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构，常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、DAPI和Hoechst荧光染色。
观察结束后使用中性树胶进行封片，可以长久保存。
免疫组化实验常见问题分析1. IHC实验结果显色过深一抗浓度过高或孵育时间过长——降低一抗浓度或减少孵育时间孵育温度过高——选择4℃或室温孵育2. 实验结果存在非特异性显色石蜡切片脱蜡不够——延长脱蜡时间蛋白封闭不充分——增加蛋白封闭时间组织富含内源性生物素与过氧化物酶——使用相关试剂进行封闭3. 实验结果显色弱或无染色一抗浓度过低或孵育时间过短——增加一抗浓度或延长孵育时间组织中无目的抗原的表达：一抗种属来源与二抗不匹配免疫组化实验注意事项切片脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，同时防止干片。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结１、方法操作不难,最大得难处就是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理,每一步知道为什么这样做,这样您才敢大胆地改革先前得不对得方法步骤。
如抗体孵育条件主要就是抗体浓度、温度、时间,这三者一般就是相互成反比得(相对),其中浓度就是最重要得先决条件,温度决定反应得速度、时间决定反应得量。
就拿温度来说,可以有4度、室温、37度,我推荐4度最佳,反应最温与,背景较浅;而３７度反应速度较快,时间较短;室温我不太提倡,除非您每次都把环境温度控制在一定得范围,否则,尽量选择前两者。
２、免疫组化最大得优势就是定位与定性。
相比于其她蛋白检测方法,免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确,就是定位检测分析首选方法、尤其对于有些因子得转位研究十分有用。
３、免疫组化结果定量分析得前提就是高质量得染色切片。
免疫组化结果也能定量分析,但必须就是背景染色浅而特异性染色较深得情况下,分析最为准确,这种原则可能也4、免疫组化实验一定要设置阳就是我们日常审稿时判定研究结果得必备条件。
ﻫ性对照与阴性对照。
阳性对照一般就是用肯定表达这种抗原得切片来做;阴性对照一般就是用ＰＢS或非一抗替代一抗来进行反应,其余步骤均一致。
前者就是排除方法与实验系统有无问题;后者就是排除有无一抗外得非特异性染色、5、免疫组化得应用广泛,就是当前实验研究得最重要方法之一、如今发SCI论文时,明显感觉仅靠量化得数据来发文章很难,加一些形态学数据或图片,老外十分欢迎,可能就是怕您学术造假吧、当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否得鉴定标准就是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良得染色切片、我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟得反应条件、浓度、方法步骤,重复运用于同一性质得切片与同一种抗体,做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法,更换一种抗体后,居然连二抗得种属来源都拿错了。
免疫组化步骤和注意事项
免疫组化步骤和注意事项免疫组化是一种重要的实验技术，用于鉴定细胞、组织或生物样本中特定抗原的分布和表达情况。
它可以通过对特定抗原与抗体的特异性结合来检测目标分子的存在和定位。
下面将介绍免疫组化的步骤和注意事项。
免疫组化的主要步骤包括抗原脱蜡、抗体反应、显色和染色。
1. 抗原脱蜡：免疫组化的第一步是将组织样本或细胞脱脂、脱蜡和重水化，以去除蜡质，并使抗体更容易与目标抗原反应。
2. 抗体反应：将脱蜡的组织样本或细胞块通过抗原修复处理，以恢复抗原的免疫反应性。
然后，将免疫抗体与待检测的抗原反应，形成免疫复合物。
免疫抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以与组织或细胞中的特定抗原高度特异性地结合。
3. 显色：免疫复合物形成后，可以使用标记有酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记的二抗来检测免疫复合物。
在酶法中，可添加草酰胺基苯酸（DAB）或硫代硝基羟基苯并啶（NBT/BCIP）等底物以产生可见的色素沉积。
在荧光法中，免疫复合物被激光器或荧光灯激发后，会发出特定颜色的荧光信号。
4. 染色：完成显色后，可以通过核染色（如用伊红、伊红和伊蓝）来观察细胞核的形态特征，以配合免疫标记物的定位。
虽然免疫组化是一种有价值的技术，但在实施过程中也需要注意一些问题：1. 选择合适的抗体：在进行免疫组化实验时，选择特异性高、效价好的一抗抗体非常重要。
一抗抗体的选择应基于抗原的特异性和病变的病理生理特性。
2. 优化抗体浓度：免疫组化实验中，抗体浓度的选择是关键因素。
过高的抗体浓度会导致非特异性的染色，而过低的浓度则无法检测到目标抗原。
3. 优化抗原修复处理：抗原修复处理对于免疫组化的成功非常重要。
选择合适的抗原修复方法可以增强组织或细胞中的抗原的免疫反应性。
4. 阴性对照和阳性对照：为了验证实验的可靠性，每次免疫组化实验都应包括阴性对照和阳性对照。
阴性对照不包含待检测的抗原，而阳性对照则确保抗体和显色试剂的正常工作。
5. 切片质量：免疫组化实验的结果直接受到切片质量的影响。
免疫组化操作流程及注意事项
免疫组化操作流程及注意事项免疫组化是一种常用的生物技术方法，在医学、药物研发、疾病诊断等领域有着广泛的应用。
在进行免疫组化实验时，需要遵循一定的操作流程和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
一、实验前准备1.检查仪器和试剂：在进行实验前，需要检查使用的仪器和试剂是否正常工作，以避免实验出现错误。
2.样本处理：选择合适的样本来源，并根据实验要求进行样本处理和处理，如组织切片、蛋白抽提等操作。
3.实验区域准备：为了避免实验中的交叉污染，需要保持实验区域的清洁和干净，避免灰尘、细菌等干扰实验结果。
二、抗体处理1.抗体选择：根据实验需要选择合适的抗体，包括一抗和二抗，并进行正确的防止步骤。
2.抗体稀释：需要根据实验所需稀释抗体浓度，以确保实验中的可靠性和准确性。
3.透析：透析是为了去除抗体中的杂质和保持抗体的活性，可以使用多种透析方法，如葡萄糖、盐溶液透析等。
三、标记和显色1.标记：将选择好的一抗和二抗进行标记，例如利用荧光标记、酵素标记等。
2.显色：根据实验需要，将标记好的抗体显色，可以使用多种方法，如荧光染色、染色素染色、酶标记染色等。
四、防止步骤1.防止非特异性结合：在实验过程中需要使用防止多余的非特异性结合，如使用BSA、牛奶等进行防止。
2.防止地基自身活性：在实验中需要使用防止地基自身活性的方法，如将地基胶体蛋白进行处理。
3.防止非特异性染色：在实验中需要使用防止非特异性染色的方法，如对实验组和对照组进行多次染色。
五、实验数据分析1.图像采集：采用高清数码系统进行图像采集。
2.数据分析：使用统计软件进行实验数据的处理，进行可靠性检测、误差范围的确定、结果的图表化呈现等等。
以上就是免疫组化操作流程及注意事项的一些基本介绍，虽然操作流程较为复杂，但是只有遵循操作流程和注意事项，才能够稳定的获得实验结果并进行进一步的研究分析。
免疫组化操作及问题分析
免疫组化操作及问题分析一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫系统酶组化技术就是通过共价键将酶相连接在抗体上，做成酶标抗体，再借酶对底物的如上所述催化作用，分解成有色的不溶性产物或具备一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下展开细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可以将其分成轻易法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用作标记的抗体可以就是用免疫系统动物制取的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最出色就是特异性弱的高效率价的单克隆抗体。
轻易法就是将酶轻易标记在第一抗体上，间接法就是将酶标记在第二抗体上，检测非政府细胞内的特定抗原物质。
目前通常采用免疫系统酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％h2o2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；将切片灌入0.01m枸橼酸缓冲液，微波中最小火力（98℃-100℃）冷却至融化，加热（约5-10min），反反复复两次；5，将切片自然冷却至室温，pbs洗涤3次，每次5min；6，半封闭，5％bsa，室温20min，限制住多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，pbs冲洗3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，pbs冲洗3次，每次3min；11，滴加sabc，37℃，30min；12，pbs冲洗3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，dab显色剂布局不好后，几滴埃基奇切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组化原理和步骤(精)
免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O+58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。
2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 :10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠檬酸钠:29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。
3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS, 再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2 。
免疫组化实验步骤、常见问题及解决方案
免疫组化实验步骤、常见问题及解决方案免疫组化实验虽然看上去非常简单，然而做起来却容易“花样百出”，让实验人员的精神备受摧残。
因此，今天小编在这里跟大家详细介绍一下免疫组化实验的步骤以及常见问题和解决方案，让大家的免疫组化实验更加顺畅。
免疫组化实验主要包括石蜡切片的免疫组化技术(IHC-P)和冰冻切片的免疫组化技术(IHC-F)，今天主要讲的是IHC-P。
实验步骤详解：1，取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取所需的组织，切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透。
注意取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化，切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2，切片制备(1)固定将切好的组织(<5mm3)用生理盐水组织洗一下，立即投入4%多聚甲醛(PFA)或10%中性福尔马林(NBF)中固定，根据组织大小和松密程度室温4-48h。
若取材是小鼠大脑或神经组织，可以采用灌流的方式进行固定。
(2)洗涤材料经固定后,水或酒精(若采用含有苦味酸的固定剂bouin，就用酒精洗涤)冲洗，数小时或过夜，目的是去除组织内固定液及结晶沉淀。
(3)脱水目的是因为透明剂多是苯类，苯和水不互溶，用到的材料是酒精，将组织依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。
(4)透明由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。
当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
一般是用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂(二甲苯、苯、氯仿、正丁醇)。
(5)浸蜡和包埋透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等)，使石蜡渗浸到组织内部达到饱和程度以便包埋。
先放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润，透蜡时间根据组织大小而定。
浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。
免疫组化技术常见问题及处理方法
contents
目录
• 实验操作问题 • 染色问题 • 仪器设备问题 • 图像分析问题 • 质量控制与标准化问题
01 实验操作问题
抗原修复问题
总结词
抗原修复是免疫组化实验中的关键步骤，处理不当可能导致抗原失活，影响染色结果。
详细描述
抗原修复过程中需注意使用适当的修复液和修复条件，如pH值、温度和时间，以保持 抗原的完整性和活性。修复液的选择和使用方法需根据抗原类型和抗体特异性进行选择
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背景染色过高
可能是由于抗体非特异性结合或 清洗不彻底造成，可通过增加清 洗次数或使用低浓度的抗体解决。
组织切片染色不均
可能是由于切片厚度、组织处理 不当或抗体分布不均导致，需确 保切片质量并优化组织处理流程。
室间质评问题
不同实验室间染色结果差异大
可能是由于抗体来源、实验操作、仪器设备等不同造成，需建立统一的操作规程和质控标准。
04 图像分析问题
图像分析软件选择问题
总结词
选择合适的图像分析软件是进行免疫组化图像分析的 关键，不同的软件具有不同的特点和适用范围。
详细描述
在选择软件时，需要考虑软件的算法、功能、操作简 便性、准确性以及是否符合实验室需求等因素。常用 的免疫组化图像分析软件包括Image Pro Plus、 ImageJ、CellProfiler等。
总结词
背景染色问题通常是由于非特异性结合或内源性酶的干扰导致的。
详细描述
为减少背景染色，可以尝试增加洗涤次数，以减少非特异性结合；同时，使用内源性酶抑制剂可以有效抑制内源 性酶的干扰。此外，优化抗体稀释比例和使用低速离心技术也可以帮助减少背景染色问题。
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免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。
7、实验方法需要动手+动脑。
如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。
我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。
一、概念和常用方法介绍1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。
2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。
与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。
4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。
2）免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。
目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。
3）免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。
胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。
因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。
由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。
由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。
如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
5、被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
6、特点 1）特异性强。
免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。
2）敏感性高。
在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
3）定位准确、形态与功能相结合。
该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。
7、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA的异同1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。
与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然Western blotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。
2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。
与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。
二、实验流程简介1、SP三步法1）石蜡切片，常规脱蜡至水。
2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。
3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。
自然冷却，再用3分钟×3次. 5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。
倾去，勿洗。
6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（最好复温）。
PBS冲洗，3分钟×5次。
7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。
8）PBS冲洗，3分钟×5次。
9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟-1h。
10）PBS冲洗，3分钟×5次。
11）显色剂显色（DAB等）。
12）自来水充分冲洗。
13）可进行复染，脱水，透明。
14）选择适当的封片剂封片。
2、即用型二步法 1）脱蜡、水化组织切片。
2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。
3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。
4）滴加一抗，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜，PBS 或TBS浸洗3分钟×5次。
5）滴加enhangcer增强剂，37度30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS 冲洗，3分钟×5次。
7）应用DAB溶液显色。
8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
三、免疫荧光技术1、免疫荧光方法中的重要环节 1）冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。
选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
2）组织切片固定：切好片风干后立即用冰西奈山环保组织固定液固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。
3）血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。
血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。
4）一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。
一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。
具体条件还要摸索。
5）二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。
但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。
6）复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。
一般常用DAPI复染。
7）封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。
避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。