免疫组化

免疫组织化学

第一节概述

1、概念：免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，是应用免疫学及组织化学的原理，对组织切片中的某些化学成分进行原位显示的技术。

采用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测，检测相应的目的抗原（或抗体）,并进行定位、定性和定量分析。

实际上该法是以免疫学方法取代化学方法的一种特殊的组织化学染色技术。

免疫组织化学技术的出现和发展给传统病理学带来了一场革命，使纯形态的病理学发展成为了形态与免疫信号相结合的现代病理学。其技术应用20多年来对临床病理诊断产生了深刻的影响，目前已成为了病理诊断中不可缺少的、最重要的辅助手段。

2、发展史

3、免疫组织化学的临床应用

适用于蛋白水平上组织的抗原或抗体检测。凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。

主要用于常规石蜡切片难以完成的疑难肿瘤的诊断

（1）对肿瘤的组织起源进行鉴别诊断，确定转移性恶性肿瘤的原发部位（2）对肿瘤的良恶性进行综合判断

（3）对肿瘤进行进一步的病理分型和分期

（4）发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定（5）为临床提供治疗方案的选择

（6）癌基因蛋白、肿瘤激素受体及生长因子的检测对肿瘤预后的判断

（7）癌基因蛋白检测可用于肿瘤病因及发病机理的研究

4、免疫组化实验所采用的组织和细胞标本

组织标本：包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片

细胞标本：包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片

5、免疫组化实验所用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。

6、免疫组织化学的全过程包括：

（1）抗原的提取与纯化；

（2）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；

（3）将显色剂与抗体结合形成标记抗体；

（4）标本的制备；

（5）免疫细胞化学反应以及呈色反应；

（6）观察结果。

7、免疫组织化学的技术分类

（1）根据染色方式：① 贴片染色② 漂浮染色

（2）根据Ag-Ab结合方式分为：① 直接法② 间接法③ 多层法

（3）按标记物的性质分为：① 免疫荧光技术（免疫荧光法）② 免疫酶

技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、 ABC法）③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）④放射免疫自影法

8、标记物

（1）必要性

（2）常用标记物：① 荧光素② 酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）③ 生物素（Biotin）④ 铁蛋白金（主要应用于免疫电镜）⑤其他：如同位素

第二节免疫组化技术

一、免疫组化所需仪器设备

二、免疫组化所需试剂

PBS（磷酸盐）缓冲液

L柠檬酸盐缓冲液

3%过氧化氢溶液

DAB显色系统

L EDTA缓冲液（）

1mol/L的TBS缓冲液

酶消化液

3%甲醇-H2O2溶液

封裱剂

TBS/PBS

三、组织的前期处理

（一）固定

取材后组织（××）推荐固定时间4～18小时。

组织固定不够的原因：固定时间不够；固定液浓度不够；固定液用量不够；大标本或有包膜的组织不切开固定

固定时间较长的标本，可通过加强修复增强染色效果。

（二）烤片

烤片的温度不宜过高：烤片的时间不宜过长。烤片温度过高不仅会引起切片细胞收缩，而且对组织内抗原的保存有一定的影响，尤其是细胞核阳性的抗原；但时间太短(少于20分钟)，容易造成脱片。推荐烤片温度及时间：50℃～60 ℃ ，烤2～4小时。

四、免疫组化操作流程

（一）脱蜡和水化

凡是石蜡切片必须经过二甲苯脱蜡，各级乙醇至水洗的过程。二甲苯和各级乙醇必须保持一定纯度，不能混入其他杂质成分，而使染色受到影响。

组织切片的脱蜡步骤应彻底，否则无论进行哪种染色都会发生困难。脱蜡时间要充分，若溶蜡剂使用过久应及时更换以免效率降低，若室温过低，可将溶蜡剂置于温箱中进行脱蜡。

（二）抗原修复

组织固定、脱水、透明、浸蜡、烤片，阻断剂、甲醇、抗原暴露及修复过程

中用的蛋白酶、酸、缓冲液等各种理化因素，都会使抗原受到影响，导致抗原决定簇不同程度的破坏甚至完全破坏，丧失原有的抗原性。

抗原修复(Antigen retrieval ，AR)是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂或微波、金属盐等对被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原进行暴露和修复，使抗原性得到一定程度恢复的过程。抗原修复有利于抗原抗体结合，提高阳性检测率。

不同的抗原可选择最佳修复方式：不修复：可直接加一抗；热修复：水浴、微波、高压；酶消化：胃酶、胰酶、蛋白酶K、XXV酶；双暴露：先热处理后酶消化或先酶消化后热处理。

（三）免疫组织化学染色

1、染色方法有：

（1）直接法：荧光素直接标记在特异性的抗体（一抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上），荧光显微镜下观察→检测抗原。

（2）间接法：荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体），显色后镜检。

（3）非标记Ab桥法：“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。分单桥法和双桥法。

（4）PAP法（ Peroxidase anti—peroxidase method，过氧化物酶—抗过氧化物酶法）：是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。

（5）ABC法（ Avidin—biotin—peroxidase Complex method，亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法）

（6）SP或SAP法（ Streptavidin/peroxidase or strepta-vidin/alkaline phosphatase，过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）：是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO 。

（7）蛋白A-金法（Protein-A gold method）：多用于电镜。