免疫标记技术及分析应用课件
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450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、 405nm
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免疫标记技术
放射物标记技术
酶标技术
免疫荧光技术
ELISA 酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
双位一点法
其他标记技术
优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于 普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素 污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且 仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。
三、酶标记物的纯化及鉴定 1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色
葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法
2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法
四、酶标仪（酶联免疫检测仪）
比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测
第二节
将抗体或抗原标记以荧光素，然 后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复 合物在一定波长光的激发下可产生荧光， 借助荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗 体。
当出现荧光时，表明标记抗体 存在，相应的抗原也存在。
抗体的荧光素标
FITC 异硫氰酸荧光素
记
标记原理：利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫
优点：可检测所有的抗原抗体系统， 具通用性；敏感性高。
缺点：操作流程长、干扰因素多、 非特异性荧光多，补体易失活、需 新鲜制备不方便。
第三节
Enzyme Immunoassay（EIA）
就是将抗原和抗体的特异性免 疫反应与酶的催化反应相结合 而建立的一种免疫检测技术。
抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光
缺点：
标记反应较难掌握，在操作 过程中容易引起酶、抗原或抗体 的失活。
一、常用的酶及其底物
酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标
记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物
易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的 常影用响酶（用于均相测定的酶标底抗物原与抗体结合后
显色
辣酶根活过性氧出化现物抑酶 制或激邻苯活二）胺；、无H2害O2 ；稳定，价橙廉、 黄易色得。
第七章 免疫标记技术及分析应用
第一节 免疫标记技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 免疫酶技术 第四节 放射免疫技术 第五节 免疫胶体金标记技术
第一节 免疫标记技术
用荧光素、放射性同位素、酶、发 光剂、胶体金或电子致密物质等作为示踪剂， 标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。
荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电 子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对 实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。
光度计
特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或
抗体的所在部位，或在µg、甚至ng水平 上对其进行定量。
将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结 合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于 固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下 催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜 色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正 比。
荧光检测仪
（1）荧光显微镜 （2）荧光分光光度计 （3）流式细胞仪 （4）荧光偏振光分析仪
荧光显微镜
利用一定波长的激 发光对样品进行激发， 产生一定波长的荧光， 对样品结构或其组分进 行定性、定位、定量观 察检测。
落射式
荧光显微镜的种类
透射式
荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
分色镜
汞灯
流式细胞仪
荧光酶标仪
（1）直接荧光染色法
将荧光素标记在特异性抗体上，直接检 测抗原。 优点：简单、快速、特异性高。 缺点：敏感性差。
直接法
间接法
（2）间接荧光染色法
将荧光素标记在第二抗体（抗抗体） 上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特 异性抗体。
直接法
间接法
（3）补体荧光染色法
将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3 抗体），检测抗原抗体复合物。
氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结
合成荧光抗体。
标记方法:
搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗
体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。
透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。
标记比较匀， 非特异染色较低。
常 用 的 荧 光 素
返 回
荧光抗体的纯化
去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过 滤 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子 交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或 固相抗原吸收
免疫标记技术
分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫
荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光 免疫测定。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位
免疫标记技术
反应类型
实验技术
结果判断
标记免疫反应 荧光免疫技术 检测荧光现象
放射免疫技术 检测放射性强度
酶免疫技术 检测酶底物显色 发光免疫技术 检测发光强度
四甲基联苯胺、
H2O2
蓝色
碱性磷酸酶
对硝基苯磷酸酯
黄色
二、 标记方法 酶结合物
技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗 原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较 少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原 的聚合物。
戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶
改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟
基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2NH-IgG
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA
ELISA基本实验过程
包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到 固相载体表面，使抗原或抗体固相化
金免疫技术 检测金颗粒沉淀
免疫标记技术
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提
高免疫学诊断的敏感性
放 125射I、性13同1I位素：酶：碱辣性根磷过酸氧酶化物酶、
荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄 绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹 明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA） 液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）
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免疫标记技术
放射物标记技术
酶标技术
免疫荧光技术
ELISA 酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
双位一点法
其他标记技术
优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于 普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素 污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且 仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。
三、酶标记物的纯化及鉴定 1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色
葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法
2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法
四、酶标仪（酶联免疫检测仪）
比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测
第二节
将抗体或抗原标记以荧光素，然 后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复 合物在一定波长光的激发下可产生荧光， 借助荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗 体。
当出现荧光时，表明标记抗体 存在，相应的抗原也存在。
抗体的荧光素标
FITC 异硫氰酸荧光素
记
标记原理：利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫
优点：可检测所有的抗原抗体系统， 具通用性；敏感性高。
缺点：操作流程长、干扰因素多、 非特异性荧光多，补体易失活、需 新鲜制备不方便。
第三节
Enzyme Immunoassay（EIA）
就是将抗原和抗体的特异性免 疫反应与酶的催化反应相结合 而建立的一种免疫检测技术。
抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光
缺点：
标记反应较难掌握，在操作 过程中容易引起酶、抗原或抗体 的失活。
一、常用的酶及其底物
酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标
记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物
易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的 常影用响酶（用于均相测定的酶标底抗物原与抗体结合后
显色
辣酶根活过性氧出化现物抑酶 制或激邻苯活二）胺；、无H2害O2 ；稳定，价橙廉、 黄易色得。
第七章 免疫标记技术及分析应用
第一节 免疫标记技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 免疫酶技术 第四节 放射免疫技术 第五节 免疫胶体金标记技术
第一节 免疫标记技术
用荧光素、放射性同位素、酶、发 光剂、胶体金或电子致密物质等作为示踪剂， 标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。
荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电 子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对 实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。
光度计
特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或
抗体的所在部位，或在µg、甚至ng水平 上对其进行定量。
将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结 合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于 固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下 催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜 色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正 比。
荧光检测仪
（1）荧光显微镜 （2）荧光分光光度计 （3）流式细胞仪 （4）荧光偏振光分析仪
荧光显微镜
利用一定波长的激 发光对样品进行激发， 产生一定波长的荧光， 对样品结构或其组分进 行定性、定位、定量观 察检测。
落射式
荧光显微镜的种类
透射式
荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
分色镜
汞灯
流式细胞仪
荧光酶标仪
（1）直接荧光染色法
将荧光素标记在特异性抗体上，直接检 测抗原。 优点：简单、快速、特异性高。 缺点：敏感性差。
直接法
间接法
（2）间接荧光染色法
将荧光素标记在第二抗体（抗抗体） 上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特 异性抗体。
直接法
间接法
（3）补体荧光染色法
将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3 抗体），检测抗原抗体复合物。
氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结
合成荧光抗体。
标记方法:
搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗
体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。
透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。
标记比较匀， 非特异染色较低。
常 用 的 荧 光 素
返 回
荧光抗体的纯化
去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过 滤 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子 交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或 固相抗原吸收
免疫标记技术
分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫
荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光 免疫测定。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位
免疫标记技术
反应类型
实验技术
结果判断
标记免疫反应 荧光免疫技术 检测荧光现象
放射免疫技术 检测放射性强度
酶免疫技术 检测酶底物显色 发光免疫技术 检测发光强度
四甲基联苯胺、
H2O2
蓝色
碱性磷酸酶
对硝基苯磷酸酯
黄色
二、 标记方法 酶结合物
技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗 原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较 少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原 的聚合物。
戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶
改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟
基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2NH-IgG
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA
ELISA基本实验过程
包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到 固相载体表面，使抗原或抗体固相化
金免疫技术 检测金颗粒沉淀
免疫标记技术
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提
高免疫学诊断的敏感性
放 125射I、性13同1I位素：酶：碱辣性根磷过酸氧酶化物酶、
荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄 绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹 明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA） 液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）