转录组实战讲解第四讲之转录本构建和长非编码RNA鉴定
转录组测序ppt课件
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2019/5/5
环境转录组也可以这样做
• 使用RNA-seq手段对实验样本进行转录组分析，关注个体或者组织器 官在不同环境条件下基因表达的动态变化，挖掘生物对逆境适应的分 子机制。
转录组？
• 转录组是特定组织或细胞在某一功能状态下所能 转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码 RNA。
• 转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件 下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、 核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有 mRNA的集合。蛋白质是行使细胞功能的主要承担 者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述， 转录组成为研究基因表达的主要手段，转录组是 连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必 然纽带，转录水平的调控是目前研究最多的，也 是生物体最重要的调控方式。
3. DNA成簇（Cluster）扩增
4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）信息分析流程
生物信息分析
基本信息分析
• 数据量产出：>2Gb per sample • 测序策略：HiSeq2000, PE91 or 101 • 插入片段大小：200 bps • 测序质量控制：Q20% >80
相关概念
• 高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值， 这个质量值是衡量测序准确度的。Q20与Q30则表示质量值 大于等于20或30的碱基所占百分比。
• Q20值是指的测序过程碱基识别过程中，对所识别的碱基 给出的错误概率。
• 质量值Q20，错误识别概率是1%，即正确率是99%； 质量值Q30，错误识别概率是0.1%，即正确率是99.9%； 质量值Q40，错误识别概率是0.01%，即正确率99.99%； Q“N”0的质量值，就是正确率有N个9的百分比。
转录和转录组学transcriptome PPT课件
1.2.1.组成
• 全酶： 2´ （核心酶 + ） • 核心酶 ： 2´
1.2.2.作用
• α亚基： 决定那些基因被转录。 • β亚基： 催化与模板配对的相邻NTP
以3´, 5´-磷酸二酯键相连。
• β´亚基：促进酶与模板链结合，并使
DNA双链打开。 ( 核心酶： 催化RNA链的延长，参与整个 过程。)
• 1.单链小分子； • 2.含有稀有碱基或修饰碱基； • 3. 5′端总是磷酸化， 5′末端往往是pG； • 4. 3′端是CpCpAoH序列； • 5.三叶草结构； • 6.三级结构是倒L型。
三级结构呈倒L形
2.3 rRNA：
• 原核生物：70S--由50S和30S 组成 • 真核生物：80S--由60S和40S 组成
个茎。1～3个环，含13b保守序 列CAAA，AC，AGUC，GUG
核苷酸链断裂点
槌头状结构，最简单的核酶
核酶的意义
• 动摇了酶是蛋白质的传统概念。 • 为地球上生命起源早期可能是先出
现RNA提供证据。
• 为人工合成核酶以破坏某些病原微
生物，消除体内有害基因提供理论 基础。
2.5 核内不均一RNA（hnRNA）
2.7 反义RNA：
• 可与mRNA形成双链，抑制翻译。
2.8 microRNA 调节mRNA的水平
二、RNA的合成----转录(transcription）
指在RNA聚合酶催化下，以DNA为模板， NTP为原料，合成RNA的过程。
转录概述
• DNA为模板合成RNA的过程 • RNA聚合酶 • 原料：ATP，UTP，CTP，GTP (NTP) • Mg2+，Mn2+ • 合成方向：5´→3´ • 连接方式：3´,5´-磷酸二酯键
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。
2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。
深度为10-30 Million reads。
）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。
大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。
我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。
这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。
首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。
接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。
然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。
再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。
对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。
这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。
也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。
因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。
转录组测序 转录组转录组及转录组测序
转录组测序转录组转录组及转录组测序导读:就爱阅读网友为您分享以下“转录组转录组及转录组测序”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!第一章转录组及转录组测序第一节前言1953年，沃森与克里克对DNA双螺旋结构的精确描绘开创了生命科学的黄金时代，随后如火如荼的开展起来的人类基因组计划建立起庞大复杂的基因组数据库使人类对了解生命本源和控制生命进程燃起无限憧憬。
随着越来越多的基因测序工作渐渐完成，一本“写满生命密码的天书” 呈现在我们面前, 然而，接下来的问题更纷扰而至:1) 这些基因有什么功能,12) 不同的基因参与了哪些细胞内不同的生命过程,3) 基因的表达是如何调控的呢,4) 基因与基因产物之间是如何相互作用的呢,5) 相同的基因在不同的细胞内的表达水平有差异吗,6) 相同的基因处于疾病和治疗状态下的表达水平会有哪些改变,如何读懂这本“天书”是目前横亘在科学家们面前严峻的挑战。
因此，在人类基因组项目后，转录组学，蛋白组学，代谢组学等组学不断涌现，生命科学研究已经跨入后基因组时代。
其中，转录组学作为一个率先发展起来的学科是研究细胞表型和功能的一个重要手段，转录组高通量测序技术开始在生物学前沿研究中得到了广泛的应用。
第二节转录组(transcriptome)与转录组学2(transcriptomics)读懂基因组这本“天书”，最先要研究清楚基因是怎么表达的。
所谓基因表达，是指将基因携带的遗传信息转变为可辨别的表型的整个过程。
基因表达的第一步, 也即基因表达调控的关键环节，是以DNA为模板合成RNA的转录过程。
转录后的所有mRNA的总称即转录组。
由转录组延伸出来一门学科即转录组学，它是分子生物学的分支，负责研究在单个细胞或一个细胞群的特定细胞类型内所产生的mRNA分子，是从RNA层次研究基因表达的情况。
第三节转录组研究的重要性转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的纽带，转录水平的调控是最重要也是目前研究最广泛的生物体调控方式。
转录组分析(RNA-Seq)-PPT文档资料
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景
rna建库的方法
rna建库的方法RNA建库的方法引言RNA建库是指将RNA样品转化为可以进行高通量测序的文库的过程。
随着RNA测序技术的不断发展，RNA建库方法也日益丰富和多样化。
本文将介绍几种常见的RNA建库方法，包括mRNA建库、全长转录本建库和全长非编码RNA建库。
一、mRNA建库方法mRNA建库是一种常用的RNA建库方法，用于研究基因表达水平和转录组结构。
mRNA建库的关键步骤包括RNA提取、rRNA去除、RNA反转录、二次合成、文库构建和测序。
RNA提取是从细胞或组织中提取总RNA的过程，常用的方法有酚酸法和柱子法。
rRNA去除是为了去除总RNA中的rRNA，以便于后续的mRNA测序。
常用的rRNA去除方法包括磁珠富集法和纯化法。
RNA反转录是将mRNA反转录为cDNA 的过程，常用的反转录酶有逆转录酶和MMLV逆转录酶。
二次合成是在RNA反转录后进行的第二次合成反应，用于增加文库的DNA数量。
文库构建是将二次合成产物连接到测序适配体上的过程，常用的连接方法有末端连接和接口连接。
最后，构建好的文库可以进行高通量测序。
二、全长转录本建库方法全长转录本建库是一种用于研究基因组中全长转录本的建库方法。
全长转录本建库的关键步骤包括RNA提取、RNA反转录、二次合成、文库构建和测序。
RNA提取的方法与mRNA建库相同。
RNA反转录是将RNA反转录为全长cDNA的过程，常用的反转录酶有SMART逆转录酶和Superscript III逆转录酶。
二次合成是在RNA反转录后进行的第二次合成反应，用于增加文库的DNA数量。
文库构建是将二次合成产物连接到测序适配体上的过程，常用的连接方法有末端连接和接口连接。
最后，构建好的文库可以进行高通量测序。
三、全长非编码RNA建库方法全长非编码RNA建库是一种用于研究非编码RNA的建库方法。
全长非编码RNA建库的关键步骤与全长转录本建库相似，包括RNA提取、RNA反转录、二次合成、文库构建和测序。
转录组测序技术原理及应用演示文稿
exon1
junction reads
exon3
exon1
exon2
exon3
第三十三页，共52页。
鉴定基因融合
Paired Reads
Single Reads
第三十四页，共52页。
Gene A
Gene B
分析RNA水平SNP
转录组重测序比对软件： SOAP De novo 转录组测序: 组装软件：SoapDenovo 比对软件： SoapSNP
Reads cluster
Paired-End (PE) Reads
Genomic intergenic region
Reads 比对到参考序列基因间区域
第三十二页，共52页。
鉴定可变剪接（ Alternative Splicing ）
common reads
exon1
exon2
exon3
mRNA
20
第二十页，共52页。
RNA-Seq
(De novo transcr十一页，共52页。
De novo assemble a transcriptome组装流程
第二十二页，共52页。
De novo assembly transcriptome 信息分析主要内容：样品检测 制备 Cluster Station
Illumina Sequencing
生物信息分析
第六页，共52页。
Total RNA样品检测
Agilent 2200 检测
OD260/280:1.8~2.2
RNA 28S:18S ≥ 1.0; RIN≥7
新型安捷伦2200 TapeStation 系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR工作流程以 及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解决方案。 ● 可扩展的通量—16联或96孔微量滴定板 ● 快速得到结果—平均每个样品只需一分钟便可获得结果 ● 使用简单—可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程 ● 样品用量少—每次运行仅需要不到2ul样品
转录组RNAseq术语解释
RNA-Seq名词解释1.index测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。
2.碱基质量值（Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。
碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。
3.Q30碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。
4.FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。
计算公式为公式中，cDNA Fragments 表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Reads(Millions)表示Mapped Reads总数，以10为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。
5.FC（Fold Change）即差异表达倍数。
6.FDR（False Discovery Rate）即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假设)的个数占所有被拒绝的原假设个数的比例的期望值。
通过控制FDR来决定P值的阈值。
7.P值（P-value）即概率，反映某一事件发生的可能性大小。
统计学根据显著性检验方法所得到的P 值，一般以P<0.05为显著，P<0.01为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05或0.01。
8.可变剪接（Alternative splicing）有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点）产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接(或选择性剪接，alternative splicing)。
可变剪接是调节基因表达与产生蛋白质组多样性的重要机制，是导致真核生物基因与蛋白质数量较大差异的重要原因。
转录组测序(RNA-seq)技术
转录组测序（RNA-seq）技术转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。
转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。
基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。
相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。
技术优势：¾数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。
¾高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。
¾任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。
同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。
¾更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。
应用领域：转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。
图1 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异康成生物提供的RNA-seq技术服务实验流程：1. 样品RNA准备2. 测序文库构建¾使用oligo dT微珠纯化mRNA¾ mRNA片段化处理¾反转录反应合成合成双链cDNA¾双链DNA末端修复及3’末端加‘A’¾使用特定的测序接头连接DNA片段两端¾高保真聚合酶扩增构建成功的测序文库3. DNA成簇（Cluster）扩增4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）5. 数据分析¾原始数据读取¾与数据库比对并进行注释¾深层次数据分析6. 提供实验报告¾原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有测序序列信息，碱基读取质量评估¾基本数据分析报告（Excel表格），包含有效序列的序列信息、与参考基因组比对后的注释信息等。
rna-seq转录组的测序技术
RNA-seq转录组的测序技术一、概述1. RNA-seq技术简介在过去的几十年中，研究人员利用转录组学技术对生物体中的RNA 进行研究，以揭示基因表达调控和基因功能等方面的信息。
而RNA-seq技术则是近年来兴起的一种高通量测序技术，逐渐替代了传统的microarray技术，成为了研究转录组学的主流方法之一。
二、RNA-seq的原理1. 测序库构建在进行RNA-seq实验之前，首先需要构建测序库。
通常采用聚合酶链式反应(PCR)或者DNA和RNA的逆转录(Reverse Transcription)来将RNA转录成双链DNA，并添加barcode标签，最后形成文库。
2. 高通量测序完成测序库的构建后，需要使用高通量测序技术对文库中的DNA 进行测序。
目前常用的测序评台包括Illumina、Ion Torrent、PacBio 等公司的测序仪器。
高通量测序技术能够快速、高效地获取大量的基因序列信息。
三、RNA-seq的优势1. 高灵敏度与传统的microarray技术相比，RNA-seq能够提供更高的灵敏度和动态范围，能够检测到低表达水平的基因，同时也能够覆盖更广泛的基因组区域。
2. 高分辨率RNA-seq能够提供单个碱基的分辨率，帮助研究人员更准确地识别基因的外显子、内含子和剪切异构体。
3. 无需先验信息相比于microarray技术需要先知道待检测基因的序列信息，RNA-seq技术能够在不依赖已知基因组信息的情况下进行测序。
四、RNA-seq的应用1. 基因表达水平分析RNA-seq能够帮助科研人员进行基因表达水平的定量和定性分析，揭示基因在不同组织、不同环境条件下的表达规律。
2. 剪切异构体分析通过RNA-seq技术可以发现和识别基因的各种剪切异构体，帮助了解基因的调控机制。
3. RNA编辑和融合蛋白质的细致分析RNA-seq技术也被广泛应用于RNA编辑和融合蛋白质的研究，为研究人员提供了一种便捷的方法。
转录组实战讲解第四讲之转录本构建和长非编码RNA鉴定
• 附录：运行命令
区分编码非编码的工具
• 已有的区分编码RNA和非编码RNA的工具
• CPC
• 算法基于预测基因的开放阅读框 • 特点：模型不能跨物种，不适用高通量测序得到的RNA
• PhyloCSF
• 算法基于物种间的保守性 • 特点：依赖于基因组，计算耗时
结构、表达量、 比例的变化
功能注释
3
Fusions Junctions
测序数据
测序评估及 低质量过滤
和参考基因 组比对
转录本重构
编码基因表 达注释
编码基因差 异(特异)表达
GO功能显著 Pathway显著
性富集
性富集
功能富集网 络图
Genome Browser 可视化
长非编码鉴 定
这一堂课 关注内容
• 评价指标
• 多外显子比率 • 转录本长度 • 转录本的可变剪接数目 • 对已知基因的覆盖程度
转录本构建评估
基因数目 5-8万
转录本数 目
>10万
多外显子比 多外显子转
率
录本数目
30~50%
5万
对已知编码基因的覆盖程度: >60%
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估
长非编码RNA测序分析实战讲解之 转录本构建和长非编码RNA鉴定
概要
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估
• 步骤四：长非编码RNA的鉴定
• 鉴定流程详解 • 关键:如何判断编码或是非编码基因
• 附录：运行命令
转录组分析的通用套路
鉴定
有多少RNA
基因经典转录本-概述说明以及解释
基因经典转录本-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述基因是生物体内的一个重要组成部分，它承载着生物体遗传信息的载体。
而基因的转录是遗传信息的重要过程之一，它指的是从DNA分子中合成RNA分子的过程。
在基因转录的过程中，经典转录本起着关键的作用。
经典转录本是指在转录过程中合成的具有功能性的RNA分子。
它们是在基因转录过程中产生的RNA分子的一种类型。
经典转录本具有独特的序列和结构特点，能够在细胞中发挥重要的生物学功能。
经典转录本不仅可以编码蛋白质，还可以在转录后形成非编码RNA，如mRNA、tRNA和rRNA等。
这些RNA分子在细胞中起着调控基因表达、传递遗传信息和参与蛋白质合成等重要功能。
因此，对经典转录本的研究具有重要的意义。
本文将对经典转录本的概念和特点进行详细讨论。
首先，将介绍基因的定义和作用，为后续的内容提供必要的背景知识。
然后，将深入探讨经典转录本的概念和特点，包括其结构、功能以及与其他类型的RNA分子的区别。
最后，将对经典转录本的重要性进行分析，并展望未来对其进一步研究的发展方向。
通过对经典转录本的深入研究，我们可以更好地理解基因转录的过程及其在生物体中的重要功能，为进一步揭示生命的奥秘提供重要的科学依据。
同时，对经典转录本的研究也具有潜在的应用价值，可为生物技术和医学领域的研究提供新的思路和方法。
希望本文能够为读者提供有益的信息，激发更多人对经典转录本的兴趣和研究热情。
1.2 文章结构文章结构是写作过程中非常重要的一部分，它可以帮助读者更好地理解文章的内容和逻辑关系。
本文将按照以下结构展开讨论：首先，在引言部分，我们将对整篇文章进行概述，介绍基因经典转录本的概念和研究背景。
同时，我们会阐明文章的结构和目的，帮助读者了解我们的写作意图。
接下来，在正文部分，我们将分为两个小节进行讨论。
首先，我们会对基因的定义和作用进行详细介绍，解释基因在生物体内的重要性和功能。
其次，我们会深入探讨经典转录本的概念和特点，解释转录本在基因表达中的作用和意义。
转录组学 ppt课件
Experil population A
Cell population B
AA B B
RNA extraction
Quantify pixel intensities.
AA BB
Reverse transcription
Sample A labelled with cy5 dye
组 （四）大规模平行信号测序系统
MPSS(massively parallel signature sequencing,MPSS)。
五、特点
• 转录组的特点：受到内外多种因素的 调节，因而是动态可变的。能够揭示 不同物种、不同个体、不同细胞、不 同发育阶段及不同生理病理状态下的 基因差异表达信息。
二、生产背景
• 首先提出转录组是指特定细胞在某一功能 状态下全部表达的基因总和，代表了 每一 个基因的身份和表达水平同一细胞在不同 的生长时期及生长环境下，基因表达情况 是不完全相同的，具有特定的空间。能够 提供全部 基因的表达调节系统和蛋白质的 功能相互作用的信息转录组学研究作为一 种整体的方法，改变了单个基因的研究模 式，将基因组学研究带入了高速发展的时 代
• 4、在土壤、海洋生态环境中的应 用目前宏转录组学研究大部分仍集 中在对海洋与土壤生态环境群落微 生物宏转录组的研究中，表1归纳 了部分海洋与土壤微生物宏转录组 的研究概况。
七、展望
• 转录组学可以直接反应实时环境表达 信息，这种研究不仅为微生物资源的 开发和利用提供宝贵的信息，而且也 为未培养微生物的研究提供了新的思 路，具有巨大的生物学意义。随着科 学技术的不断发展，转录组学将在微 生物群落中发挥越来越重要的作用。
Klenow label incorporation
转录ppt(共66张PPT)
RNA 聚合酶
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
转录
产物
加工
45SrRNA
18SrRNA 28SrRNA
hnRNA tRNA 5SRNA
snRNA
mRNA
利福平
抑制原核生物的RNA聚合酶
鹅膏蕈碱
抑制真核生物的RNA聚合酶
利福平 主要用于治疗结核病、麻风病等
鹅膏蕈碱 鬼笔鹅膏
三、真核生物的转录产物为单顺
反子
与原核生物不同，真核生物一个转 录单位仅生成一个mRNA分子，经翻 译生成一条多肽链
（三）都形成3’, 5’-磷酸二酯键
二、复制与转录的不同点
模板
原料
酶
校读
复制 两条链 dNTP DNA聚合酶
有
转录 一条链
NTP RNA聚合酶
无
配对
产物
引物
复制
A=T GC
子代双
链DNA
需要
转录
A=U T=A
GC
mRNA tRNA rRNA
不需要
第一节 原核生物的转录
一、转录模板 二、RNA聚合酶 三、模板和酶的辨认结合
第 11 章
RNA的生物合成（转录）
DNA DNA DNA
RNA
蛋白质
中心法则
目录
前 言 复制与转录的异同 第1节 原核生物的转录
第2节 真核生物的转录特点
第3节 真核生物转录后加工
前言 复制与转录的异同
一、相同点 二、不同点
一、复制与转录的相同点
（一）服从碱基配对规则
（二）合成方向都是5’-3’
DNA-dependent RNA polymerase （二）合成方向都是5’-3’ （四）腺嘌呤脱氨成为次黄嘌呤 σ亚基从三元起始复合物上脱落后，核心酶的构象随之发生改变，并沿着模板链的3’→5’方向滑行，进入延长阶段 第1节 原核生物的转录 原核生物的RNA聚合酶仅1种，合成全部RNA 主要用于治疗结核病、麻风病等 真核生物rRNA转录后加工 α2 β β’ ω σ称为全酶
转录组测序技术.精选PPT
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RNA-Seq 技术背景
有关于ncRNA的一些知识
非编码RNA（ncRNA）主要包括：转运 RNA（tRNA），核糖体RNA(rRNA)，小核 RNA（snRNA），核仁小分子RNA（ snoRNA），细胞质小分子RNA（scRNA）， 不均一核RNA（hnRNA）及小RNA（ microRNA,miRNA）等。
转录组测序技术：是指利用第二代 高 通 量 测 序 技 术 进 行 cDNA 测 序 ， 全面快速地获取某一物种特定器 官或组织在某一状态下的几乎所 有转录本。
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RNA-Seq 技术背景
高通量测序技术（High-throughput sequencing ）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测序，每一次序列测定的读长一 般较短的测序技术。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改 变，一次对几十万几百万条DNA分子进行序列 测序，因此在有些文献中称其为下一代测序技 术（next generation sequencing）组件其划时代 的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转 录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能， 所以又被称为深度测序（deep sequencing）
台测序原理及序列长度的差异决定了各种高通
量测序仪具有不同的应用侧重。
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RNA-Seq 技术背景
转录组（transcriptome）
广义：指某一生理条件下，细胞内所 有转录产物的集合，包括信使RNA、 核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA。
狭义：指所有mRNA的集合。
5技术
转录组测序技术
RNA-Seq第一技讲术背景 RNA-Seq第二技讲术原理 RNA-Seq第三技讲术应用领域 RNA-Seq 技术优势 RNA-Seq 技术...面..... 临的挑战及发展
转录组的研究技术方法及当前
转录组的研究技术方法及当前转录组研究是通过分析细胞或组织中所有转录的RNA分子的整体来了解基因表达的方法。
它可以揭示细胞或组织在不同生理状态下的基因表达水平和调控机制。
随着高通量测序技术的发展，转录组研究已经成为生物医学研究中的重要手段。
以下是几种常用的转录组研究技术方法及其当前的应用情况。
1. RNA测序（RNA-Seq）技术：RNA-Seq是通过对RNA样本进行DNA 测序来定量和鉴定样本中转录的RNA分子。
它可以全面地检测基因表达水平，并鉴定新的转录本和外显子外剪接。
当前，RNA-Seq已经广泛应用于生物医学研究中，如研究疾病的发生机制、筛选潜在的治疗靶点、评估药物的治疗效果等。
2. microRNA测序（miRNA-Seq）技术：miRNA-Seq是通过对miRNA进行高通量测序来了解miRNA的表达情况。
miRNA是一类短小的非编码RNA 分子，可以调控基因表达。
目前，miRNA-Seq广泛应用于研究miRNA的功能及其在细胞和组织发育、疾病进程中的作用机制。
3.差异表达基因分析：通过比较不同样本间基因的表达量，识别差异表达基因，并进一步分析这些基因的功能和调控网络。
当前，差异表达基因分析已经广泛应用于疾病研究中，如癌症、心脑血管疾病、免疫系统疾病等。
它可以帮助发现新的疾病标志物，并为疾病的诊断和治疗提供新的线索。
4.RNA亚细胞定位分析：通过分离和测序亚细胞成分中的RNA，了解不同RNA分子在细胞中的位置和功能。
这项技术可以帮助揭示RNA分子在细胞和组织发育、疾病发生中的作用机制。
当前，RNA亚细胞定位分析已经广泛应用于神经科学领域，用于研究神经系统的发育、功能和疾病。
除了以上技术方法，当前还有一些新兴的转录组研究技术值得关注，如单细胞转录组测序技术、亚转录组测序技术、全基因组DNA甲基化测序技术等。
这些新技术的出现为转录组研究提供了更全面、更深入的视角，进一步推动了转录组研究的发展。
真核转录组讲解及数据解读PPT
转录组结果解读转录调控研究部北京诺禾致源科技股份有限公司OUTLINE简介实验部分生物信息分析概述1转录组是指特定组织或细胞在某个时间或某个状态下转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA。
转录组研究是研究基因功能和结构的基础，对生物体的发育和疾病的发生具有重要作用。
RNA-seq技术流程主要包含两个部分，建库测序和数据分析。
2实验部分（RNA检测、建库、测序)）•琼脂糖凝胶电泳：分析样品RNA完整性及是否存在杂质污染。
•NanoPhotometerspectrophotometer：检测RNA纯度（OD260/280及OD260/230比值）。
•Agilent 2100 bioanalyzer：精确检测RNA完整性。
链特异性文库优势：相同数据量下可获取更多有效信息；能获得更精准的基因定量、定位与注释信息5➢1、一般动物样品会有三条带：28S 、18S 、5S ，如果提取过程经过过柱处理或者利用CTAB+LiCl 方法提取，5S 可能较暗或者没有。
➢昆虫或者软体动物等样品只有1条比较明显的带，例如：牡蛎、果蝇、螨虫、蝗虫、蚊、蚕等➢2、植物样品有三条带：25S 、18S 、5S ，有些特殊物种或部位可能本身含条带比较多，如果条带清晰，也可初步判定合格➢3.原核生物中主要有5S 、16S 、23S rRNA叶片小鼠蚊动物植物原核RIN 5RIN 7RIN 8RIN 9RIN 4RIN 6RIN 10RIN 2RIN 1RIN 值范围示意图问与答文献要求OD260/OD230≥1.8，OD260/OD230如果小于2.0，则表明样品中被碳水化合物、盐类或有机溶剂污染；OD260/OD230合格的标准是多少呢？答：OD260/OD230≥2.0，且OD260/OD280≥2.0这说明RNA提取结果是相当好的，一般在1.8-2.1之间就说明RNA结果十分好，但是nanodrop的灵敏度没有2100好，因此我们主要根据2100检测结果来判定RNA是否合格，一般只要RIN值和RNA总量达到我们的判定标准的话，我们就会判为合格。
一种转录本注释方法以及筛选长非编码RNA和内源逆转录病毒来源长非编码RNA的方法[发明专利]
![一种转录本注释方法以及筛选长非编码RNA和内源逆转录病毒来源长非编码RNA的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a432c77d6bec0975f565e25c.png)
专利名称：一种转录本注释方法以及筛选长非编码RNA和内源逆转录病毒来源长非编码RNA的方法
专利类型：发明专利
发明人：孔庆然,杜佳伟,侯卫博,丁春明
申请号：CN202011007988.6
申请日：20200923
公开号：CN112201307A
公开日：
20210108
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种转录本注释方法以及筛选长非编码RNA和内源逆转录病毒来源长非编码RNA的方法，属于生物信息学领域，为了提供精准和完整的转录本，得到表达量较低、重复序列来源的长非编码RNA，本发明提供了一种转录本的注释方法，RNA测序和小RNA测序数据结合注释转录本，得到完整精准的转录本信息，提供更精准的长链非编码RNA注释，准确获取长链非编码RNA的表达信息，本发明应用在筛选长非编码RNA和内源逆转录病毒来源长非编码RNA，筛选得到新预测长非编码RNA 2,711条，其中内源逆转录病毒来源长非编码RNA占59.3％。
申请人：温州医科大学
地址：325027 浙江省温州市学院西路82号
国籍：CN
代理机构：哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
代理人：邓宇
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去除已知基因 Cuffcompare: I、U、X
基因间区域 novel.gtf
编码能力评估 CNCI < 0
非编码候选集 noncoding.gtf
非编码基因 lincRNA.gtf
长度 >200 外显子数 >1
22
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估
• 步骤四：长非编码RNA的鉴定
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估
• 步骤四：长非编码RNA的鉴定
• 鉴定流程详解 • 关键:如何判断编码或是非编码基因
• 附录：运行命令
转录本构建效果评估
• 评价指标
• 多外显子比率 • 转录本长度 • 转录本的可变剪接数目 • 对已知基因的覆盖程度
转录本构建效果评估
• 鉴定流程详解 • 关键:如何判断编码或是非编码基因
• 附录：运行命令
转录组构建的通用套路
单样本 构建
合并转 录本
构建质 量评估
一套实验的测序得 到的整个转录组
8
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估
• 步骤四：长非编码RNA的鉴定
• 鉴定流程详解 • 关键:如何判断编码或是非编码基因
• 鉴定流程详解 • 关键:如何判断编码或是非编码基因
• 附录：运行命令
区分编码非编码的工具
• 已有的区分编码RNA和非编码RNA的工具
• CPC
• 算法基于预测基因的开放阅读框 • 特点：模型不能跨物种，不适用高通量测序得到的RNA
• PhyloCSF
• 算法基于物种间的保守性 • 特点：依赖于基因组，计算耗时
• 附录：运行命令
转录本构建
• 转录本构建工具
• Cufflinks（推荐） • Scripture
Cufflinks:报出最少的可变剪切组合，力求转录本更长
Scripture:报出最全的可变剪切组合，力求转录本更全
基因注释文件：BED格式文件
• BED格式12列：
• Chrom, Start, End, Name, Score, Strand, CDSS, CDSE, itemRgb, blockCount, blockSizes, blockStarts
• 鉴定流程详解 • 关键:如何判断编码或是非编码基因
• 附录：运行命令
构建：cufflinks –o outdir tophat_outdir_N /accepted_hits.bam
定量：cufflinks -G ref.gtf –o outdir tophat_outdir_N /accept_hits.bam
转录本合并
N.bam P.bam
cufflinks
M.bam
• 步骤四：长非编码RNA的鉴定
• 鉴定流程详解 • 关键:如何判断编码或是非编码基因
• 附录：运行命令
长非编码RNA
• 长非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度大 于200 nt且不编码蛋白质的RNAs
长非编码鉴定流程
Merge.gtf
已知编码基因
N.gtf P.gtf M.gtf
cuffmerge
Merge.gtf
V.bam
V.gtf
cuffcompare VS cuffmerge
• 共同点：都是合并转录本的工具
• 输入：若干个gtf文件 • 输出：合并合的gtf
• Cuffcompare: 得到一个转录本的并集，不丢转录本 • Cuffmerge: 按基因位置重新构建转录本，深度优化转录本结构
结构、表达量、 比例的变化
功能注释
3
Fusions Junctions
测序数据
测序评估及 低质量过滤
和参考基因 组比对
转录本重构
编码基因表 达注释
编码基因差 异(特异)表达
GO功能显著 Pathway显著
性富集
性富集
功能富集网 络图
Genome Browser 可视化
长非编码鉴 定
这一堂课 关注内容
• CNCI
• 算法基于二联密码子频率 • 特点：可以扩物种预测，人的模型能用其它各种动物上
24
CNCI:基于二联密码子对编码出RNA现频率
RNA 非编码RNA
密码子 4*4*4 = 64 种 二联密码子对 64*64
25
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估
• 步骤四：长非编码RNA的鉴定
长非编码表 达注释
长非编码差 异表达
GO功能显著 性富集
功能富集网 络图
Pathway显著 性富集
上期回顾
• 长非编码RNA测序
• mRNA测序(带polyA RNA) • 不带PolyA的RNA测序 • 去除rRNA的RNA测序
• 步骤一：测序数据评估
• fastqc: reads质量，碱基分布
长非编码RNA测序分析实战讲解之 转录本构建和长非编码RNA鉴定
概要
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估
• 步骤四：长非编码RNA的鉴定
• 鉴定流程详解 • 关键:如何判断编码或是非编码基因
• 附录：运行命令
转录组分析的通用套路
鉴定
有多少RNA
定量
RNA的表达量
差异
功能
• 步骤二: 回贴基因组
• Tophat • 双比对策略
一个测序实例
• 取样：晚期肝癌病人的肝组织(共4个)
• 癌旁组织(N) • 原发灶(P) • 转移灶(M) • 门脉血栓转移灶(V)
一组时间序列上的4个点的取样
6
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估
• 步骤四：长非 Gtf格式9列：
• Chrom, Source, Featrue, Start, End, Score, Strand, frame, group
Cufflinks系列
• Cufflinks软件套装
• Cufflinks(转录本构建、FPKM表达定量) • Cuffcompare(转录本比较、合并转录本) • Cuffmerge(转录本合并) • Cuffdiff(差异分析）
• 评价指标
• 多外显子比率 • 转录本长度 • 转录本的可变剪接数目 • 对已知基因的覆盖程度
转录本构建评估
基因数目 5-8万
转录本数 目
>10万
多外显子比 多外显子转
率
录本数目
30~50%
5万
对已知编码基因的覆盖程度: >60%
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估