填料的选择

精细纯化:反相层析填料
Sephasil™ µRPC SOURCE™ RPC
硅胶 C4, C8, C18
硅胶 C2/C18
聚苯乙烯/二乙烯基苯
pH 1 - 12 (14)
5 and 12 µm
3 µm
5, 15 and 30 µm
100 Å: 肽类 300 Å : 蛋白质
120 Å: 肽类
肽类
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High selectivity Lower selectivity
Selectivity:
评估峰的分开程度的 高选择性意味着两个峰从基线分开 假如选择性较高，低有效性可以接受 (前 提是峰体积增大能接受).
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如何选择凝胶？
• 五大类层析方法 -
1. 凝胶过滤 ( GC) 2. 离子交换 ( IEX) 3. 亲和层析 ( AC) 4. 疏水层析 ( HIC) 5. 反相层析 ( RPC)
GE Healthcare凝胶基础 知识培训
Resolution: depends on efficiency and selectivity
High efficiency Low efficiency
Efficiency:
评估峰的宽窄 高效意味着峰窄 高效意味着柱子装的好 高效可以弥补低选择性带来的不利
颗粒大小 90 µm 90 µm
流速 10 ml/min 10 ml/min
Sepharose™ Fast Flow
Sepharose™ Big Beads
Sepharose™ XL
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粗提: 疏水层析填料
Sepharose FF
Phenyl (苯基) Butyl（丁基） Octyl(辛基）
4/ GE /
BioProcess 凝胶
特别适合生产应用, 特点包括： • 高重复性：适用于任何规模的工艺放大 • 高物理、化学稳定性：易于清洗、消毒及再生、介
质 寿命特长 • 高动力载量、流速快：缩短生产周期和次数，节省
凝胶用量(尤其XL介质，载量可比普通介质高达10 倍！) • 每种凝胶均有完整的文献、档案和Regulatory Support File
Mini Q PE 4.6/50 用少於 15 min 分离 12-30 碱基的 dA 寡核酸
17 / GE /
精细纯化:疏水层析填料
RESOURCE™
Phenyl苯基 Isopropyl异丙基
Ether乙醚
RESOURCE HIC Test Kit
1 ml 预装柱流速高达10 ml/min
18 / GE /
3/ GE /
介质的普遍性质
介质 - 颗粒越细、大小越均匀，分辨率越高， 但反压亦较 高 (SOURCE介质例外)，HP代表细 颗粒，FF代表高流速，XL代表高载量。 Big Beads 物理稳定性 - 新一代介质较坚固，能承受高流 速，同时保 持柱床体积和结构稳定，省却每次 重新装柱，提高重复性 化学稳定性 - 新一代介质能承受极端pH，高盐 度，促溶剂 和有机溶剂，利于开发分离条件和 在位清洗(CIP)，大大延 长介质寿命和提高重复 性
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蛋白质纯化策略
融合蛋白质
表达
非融合蛋白质
Hale Waihona Puke Baidu
简单纯化
一步 亲和层析 90 - 97 % 纯度
多步纯化
粗提 中度纯化 精细纯化
三步纯化策略
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适用於三步纯化策略的层析技术
层析技术
IEX HIC AC GF
主要特色 高分辨率 高载量 快速 分辨率好 载量一般 快速 高分辨率 高载量 快速 高分辨率
10 µm: Mono Q & S
3 µm: Mini Q & S
> 25 mg 上样载量
< 2 mg上样载量
16 / GE /
高
分 Mini Q 和 Mini S 离子交换柱 (3mm)
辨
Sample: Buffer A: Buffer B: Flow rate:
dA12-dA30 mixture 10 mM NaOH 10 mM NaOH, 2M NaCl 1.0 ml/min
HiPrep™ 16/10
HiTrap™ HIC 选择试剂盒
10 / GE /
中度纯化
目的 去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析
分辩率
快速
回收率
载量
11 / GE /
中度纯化: 离子交换填料
Sepharose™ HP 34 µm
交联琼脂醣 Q & SP <150 cm/hr
小包装和预装柱
RPC
高分辨率
粗提
中度纯化 精细纯化
7/ GE /
粗提
目的 纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白
酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析
分辩率
快速
载量
回收率
8/ GE /
粗提: 离子交换填料
预装柱 20ml HiPrep™ 16/10 Q XL & SP XL HiPrep 16/10 DEAE & CM
精细纯化
目的 达到最终纯度 (去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术: 凝胶过滤/离子交换 / 疏水层
析/反相层析
分辩率
速度
回收率
载量
14 / GE /
精细纯化: 凝胶过滤填料
Superdex™ Peptide
Mr 100 - 7 000
Superdex 75
Mr 3 000 - 70 000
Superdex 200
Mr 10 000 - 600 000
102
103
Prep Grade (34 µm）
GL(13µm)
104
105
10
分离分子量大小 (球状蛋白质)
有HiLoad™ 预装柱和小包装填料
15 / GE /
精细纯化:离子交换填料
Mono™ Beads Q & S
Mini™ Beads Q & S
SOURCE™ 30 µm
聚苯乙烯/二乙烯基苯 Q&S <1 800 cm/hr 小包装
Sepharose High Performance
SOURCE 30
12 / GE /
中度纯化:疏水层析填料
Sepharose™ HP 34 µm
苯基，丁基，异丙基
小包装和预装柱
300 cm/hr
13 / GE /
凝胶过滤介质
•以分子量大小作分离，大分子先走完柱子，小分子后出； 不同介质有不同分离范围，须根据目标物的大小而作选择
Gel structure
A good gel for gel filtration contains about
95% water
AGAROSE
JB GF 1998-06-04