第二章 薄层色谱分离技术

0.5％CMC-Na配制： 取适量CMC-Na + 蒸馏水加热煮沸，完全 融解，放冷静置。铺板时取其上清液使用。

铺板时为了防止由于搅拌而带入气泡，常 常加入少量乙醇或丙酮或将吸附剂糊首先置 于真空干燥器中减压脱气，以免薄层表面出 现气泡，影响分离效果。

1，煅石膏 将石膏（ CaSO4.2H2O） 在 120 －140 ℃ 烤2－4小时，过200目筛，备用。用煅石 膏作粘合剂的优点是能使用腐蚀性的显 色剂；但其缺点为薄层的硬度不够，且 不利于无机物的分离。

2，羧甲基纤维素钠 CMC-Na 先将羧甲基纤维素钠调成糊状，再加 足量水搅拌均匀，并加热煮沸使尽可能 溶解，放置澄清后，取上清液代替水与 吸附剂搅匀涂布薄层。 常用的浓度为0.2％--1．0％，浓度越 高, 薄层硬度越大，是常用的粘合剂， 但其缺点为不能耐受有腐蚀性的显色剂。

经典的制备型薄层色谱，设备简单， 操作方便。薄层色谱与常压柱分离配 合使用，仍然在实验室中有较多的应 用。尤其是在一些没有现代分离手段 的实验室中广为使用。
一、固定相及载体 1 ．固定相：薄层色谱必须将被分离物质点于固 定相上进行分离，固定相要根据被分离化合物的 性质来选择。 分离亲脂性化合物常常选用硅胶，氧化铝，乙酰 纤维素及聚酰胺。 分离亲水性化合物常常选用纤维素，硅藻土及聚 酰胺。 但也有例外，脂溶性叶绿素在氧化铝及 纤维素上均能得到较好的分离。 2 ．载体：玻璃板，铝箔，塑料片等（吸附薄 层）； 纤维素，硅藻土（分配薄层）
1，载板的制备： 常用载板主要为玻璃板，塑料板，金属铝箔等 较少应用 载板必须是表面光滑，平整清洁 玻板大小视实验所需而定。 一般分析用： 3×5cm； 4×20cm； 10×10cm, 制备用 ：20×20cm， 20×40cm




2，薄板涂铺方法 （1）干法铺板 将吸附剂直接倒在板上一端，取一适当玻棒 两端包裹上适当厚度的橡皮膏或塑料管，视薄 层厚度要求而定。 用力移动玻璃管，（用力不可过猛或太快，也 不能中途停止，以免薄层厚薄不均）如此制成 的薄板称为软板。 由于该板易吹散，现已比较少用，多用硬板。

第二节 制备薄层色谱
(Preparative Thin Layer Chromatography PTLC)



一、固定相及载体 二，粘合剂与添加剂 三、薄层板的制备 四，上样 五、展开剂选择 六、薄层展开 七、检测方法 八、被分离物质的收集 九、PTLC分离化合物的纯化
与纸层析相似，按分配的原理 。纤维素分子是

层析用纤维素分： 普通纤维素 乙酰化纤维素 离子交换纤维素

Hale Waihona Puke Baidu



4．聚酰胺：
聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合物， 薄层色谱中常用的是聚己内酰胺。聚酰胺分 子内有许多酰胺基，酰胺基中的碳基与酚类、 黄酮类、酸类中的羟基或羧基形成氢键；酰 胺基中的氨基与酮类或硝基化合物形成氢键， 同时由于所分离混合物结构不同，含羟基等 活性基团的数目和位置不同，因而形成氢键 的能力不同，所以对这些化合物的吸附能力 不同而得到分离。
市售氧化铝：
Ａ．含10％G ，PH 7.5－8； Ｂ．不带粘合剂的氧化铝 PH=9,也可加入波长 254nm的荧光指示剂。

3．纤维素
由大量纤维二糖通过糖苷键连接的，由于有许 多的OH基，所以具有亲水性。一分子水与与纤 维素的两个羟基结合，形成“纤维素－H2O”络 合物。这种固定相可以视为一种多糖浓溶液， 即使使用与水相混溶的溶剂时，仍然形成类似 不相混溶的两相。




（1）．硅胶：是最常用的薄层固定相，90％以上分离 工作都应用之。 １） 普通型硅胶：无定型多孔粉末，表面带有硅醇基， 呈弱酸性。因为有一羟基(silanol Si-OH)，呈弱酸性 （PH = 4.5）, 通过硅原子上的羟基与极性化合物或不 饱和化合物形成氢键， 所以表现为吸附性能。硅胶吸 附水分形成水合硅醇基，降低吸附能力。通常在150℃ 活化后失水提高活度，此时约有4－6个硅醇基/nm2,。 （温度大于500℃，硅胶脱水形成硅醚（Si－O-Si）,而 失去吸附能力）。 — 活性硅胶适合分离酸性或中性化合物，如酚类，醛 类，生物碱类，甾体及氨基酸类，是基于吸附作用； — 非活性硅胶含有一定量的水分，在分离色素等时， 是基于分配作用。

7．硅藻土 硅藻土商品名 celite，是高度多孔的， 比表面积大的固体，本身具极弱的吸附 力，常作为分配色谱用的载体；或以一 定比例加入硅胶等吸附剂中可以降低硅 胶的吸附力，而有利于某些化合物的分 离。

二，粘合剂与添加剂
为使薄层牢固地附着于支持体上 需加合适的粘合剂; 为特殊的分离检出有时要在固定 相中加入某些添加剂. 理想的粘合剂要求亲水性好、粘 结力强，且具有化学惰性

(2)亲酯性萄聚糖凝胶
但在葡聚糖分子上引入有机基团，则可使之 成为亲脂性葡聚糖凝胶，如在G—25凝胶上引 入羟丙基基团，与糖分子以醚键相连，使之 成为既有亲水性又有亲脂性的LH—20葡聚糖 凝胶，适用于有机物如黄酮、蒽醌、色素等 成分的分离。
萄聚糖凝胶只能用于水溶性物质的分离鉴定。
6. 离子交换剂 葡聚糖凝胶离子交换剂 在 G—25 或 G—50 葡聚糖凝胶上引入 羧甲基、磺乙基、磺丙基、二乙基氨 乙基及季铵乙基等而制成的既具凝胶 的优点又具离子交换性质的载体，在 生化及天然化合物方面得到广泛应用。
三、TLC的应用特点：
TLC不仅适合于小量样品的制备，也可用于较 大量样品的纯化。如果将薄层加宽加厚，把 样品点成一条线，能分离几百毫克样品。尤 其是对于Rf值相近的物质的分离。 TLC除了用于分离外，更主要的是通过与已知 结构化合物相比较，来鉴定少量有机混合物 的组成。此外, 经常利用 TLC寻找柱色谱的最 佳分离条件。 常用的两种制备型薄层色谱包括： 传统的制备薄层法（PTLC），即流动相借毛 细作用流经固定相。 借外力强制性的使流动相流经固定相，如离 心薄层和加压薄层。




三、薄层板的制备 当前国外商品化的各种预制板均有市售，可满足 各种需要。（除个别特殊需要人工制板外） 预制板使用方便 , 涂布均匀 , 薄层光滑及有很好的 牢度 . 预制板有玻璃板、塑料板或铝箔板，后两种 还有剪裁方便之优点。 国外市售预制板较多，包括普通薄层预制板（硅 胶、氧化铝、纤维素、硅藻土、聚酰胺、离子交换 纤维素、键合硅胶反相板）；高效薄层预制板（、 键合硅胶预制板、手性预制板）等，规格众多，尺 寸不同，分离效果及重现性均较手工制板好。 国内预制板规格类型较少，进口又贵，所以主要 靠自己手工制作。


2．氧化铝：在薄层中其应用仅次于硅胶。 由氢氧化铝400－500℃煅烧而成。广泛的 用于萜类，生物碱，脂肪类，芳香类化合 物的分离。因制法和处理方法不同可分为 碱性，酸性，中性三类 ⑴ 碱性氧化铝：PH 9－10适于中性、碱性 化合物的分离 ⑵ 酸性氧化铝：PH 4－5适于酸性化合物的 分离 ⑶ 中性氧化铝：PH 7－7.5适于酸性或对碱 不稳定的化合物的分离 氧化铝因其含水量活性可分为五级。制 备型薄层用氧化铝选用2－3级
２） 改性硅胶：借化学反应，将有机分子键 合在硅羟基上，故称化学键合固定相。可分为 极性键合相和非极性键合相。 ① 极性键合硅胶：含极性基团（如氰基，氨 基，二醇基），与普通硅胶相比活性低。一般 作正相色谱，用非极性或极性溶剂为展开剂 ② 非极性键合硅胶：键合相表面为极性极小 的烃基如18烷基，乙基，辛基等。最常用的是 18烷基键合硅胶。用极性较大溶剂为展开剂或 无机溶剂为展开剂。因为Rf与正相色谱相反， 故称反相薄层色谱法。


3)
硅胶的粒度与孔径：

硅胶的分离效率与其粒度、孔径及表面积等
几何结构有关。

原则上，粒度越小，分离效果越好。
孔径（Å）或孔体积表示硅胶粒子孔的大小 的尺度，与传递阻滞有关； 表面积越大，表明其吸附力越大，有较强的 保留。


4）硅胶薄层板的厚度

普通薄层厚度为250μm,


高效薄层板为200μm， 制备薄层板厚度 0.5-2 mm
（2）湿法铺板： 一般都要加黏合剂，故称粘合薄层板（硬板）。 常用两种硬板为：硅胶+G、硅胶+ CMC-Na 硅胶 G 板铺制。 G 的含量为 10 － 13 ％，制板时 每份硅胶G + 水2－3份，研成糊状，倒在板 上铺布。 硅胶CMC-Na板铺制: 硅胶H或硅胶G + CMCNa 水溶液（ 0.5 ％）（ 1 ： 3 ），研成糊状，倒 入板上铺布。

一、TLC的分离原理
分离原理随所用固定相不同而不同，可分为: (l) 吸附薄层色谱 采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层， 利用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差别达到分离的 目的。 (2) 分配薄层色谱 由硅胶、聚酰胺和纤维素铺成薄层， 不同组分在指定的两相中有不同的分配系数。 (3) 离子交换薄层色谱 由含有交换活性基团的纤维素铺 成薄层。 (4) 分子排阻薄层色谱 也称凝胶薄层。利用样品中分子 大小不同、受阻情况不同加以分离。 (5) 亲和薄层色谱 利用酶、受体、抗原抗体特异性识别 作用。
第二章 薄层色谱分离技术
第一节 第二节 第三节 第四节 薄层色谱概论 制备薄层色谱 离心薄层色谱 制备型加压薄层色谱
第一节 薄层色谱概论
薄层色谱 (Thin-Layer Chromatography TLC) 是快速分离、定性和定量分析的一种非常重要 的色谱技术。 它是将固定相涂布于玻璃，铝铂，塑料片等载 板上形成一均一薄层。将被分离的物质点加在 薄层的一端，置展开室中，选用适当的展开剂， 借毛细作用从薄层点样的一端展开到另一端， 使性质不同的物质得以分离。

3，淀粉 将淀粉配成5%的溶液,在85℃加热至有粘 性,加入适量吸附剂制成薄层. 缺点为不能 耐受有腐蚀性的显色剂。 4，预制板粘合剂 上述三种粘合剂均于实验室自制 TLC 时使用． 商品市售预制板粘合剂有：聚乙烯醇， 聚丙烯醇，聚丙烯酰胺。 5. 添加剂 荧光剂; 酸、碱或PH缓冲液等。



5．葡聚糖凝胶 分子筛的原理 (1) 亲水性葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖苷， dextran)悬浮于有机相中，加入交联剂使葡聚糖 交联聚合而成．其商品名为Sephadex，加入交 联剂量不同可制成不同交联度的凝胶． 交联度越大，网状结构越紧密，吸水时膨胀体 积越小 ． 用于薄层色谱的凝胶粒度要细，小于40um,交 联度要低，G－50以下．

二、TLC 的技术参数

1. 比移值: 一个化合物在薄层板上上 升的高度与展开剂上升的高度的比值 称为该化合物的比移值（Rf 值）。 是薄层色谱的基本定性参数。



2．相对比移值 (R
i，s)
由于影响被分离物质在薄层上移动距离的因 素较多，因此 R f 值的重现性较差，如果将被 分离物质与一参比物点在 同一块薄层上，用 相同的色谱条件进行分离。相对比移值就是 被分离物质(s)和参比物(i)的Rf值之比，或是 被分离物质 (s) 和参比物（ i) 在薄层上移动 距离之比. 由于参比物的Rf值或移动距离可大于或小于被 分离物质的Rf值或移动距离，因此相对比移值 可大于或小于 l，但其重复性及可比性均优 于R f值。 R i,s = R f(i) / R f(s)







5）市售硅胶及预制板规格（符号及含义） 硅胶G: 是含有13％煅石膏（gypsum）黏合 剂的硅胶 硅胶H：不含黏合剂的硅胶 硅胶 HF254：不含黏合剂，含有一种无机荧 光剂（如锰激活的硅酸锌），在 254nm波长紫 外光下呈强烈黄绿色荧光 硅胶 GF254：含有煅石膏黏合剂，含荧光剂， 在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光 硅胶HF254+366：不含粘合剂，在254与366nm 波长有荧光 硅胶 PF254：制备型的，在 254nm 有荧光（有 荧光剂，适用于不发光不易显色物质的制备与 分离）