鲎试剂使用说明书

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QC-7129B鲎试剂灵敏度复核操作规程

正文规范鲎试剂灵敏度复核的操作过程和要求，确保鲎试剂灵敏度复核结果的可靠性。

适用于质监处药理室对鲎试剂灵敏度的复核。

质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。

USP版附录85；CP版附录Ⅺ E 。

细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。

鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。

鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。

细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在37 1 C 条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。

细菌内毒素标准品：USP细菌内毒素参考标准品(RSE)或已标定的细菌内毒素工作标准品(CSE)。

反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。

一、试剂、材料与仪器设备试剂：鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。

细菌内毒素检查用水(BET水) 批号、规格、生产商。

细菌内毒素标准品批号、效价、生产商。

材料及仪器设备：电热恒温水箱型号、设备编号。

电热鼓风干燥箱型号、设备编号。

漩涡混合器型号。

无热原试管规格：1075mm。

正文无热原玻璃瓶规格：25ml。

无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。

试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。

二、试验准备试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。

试验操作过程应避免微生物的污染。

三、内毒素溶液配制细菌内毒素标准品系列溶液配制取RSE或CSE 1瓶，按照使用说明书加入规定量的细菌内毒素检查用水使溶，并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、 0.5、 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。

鲎试验实验报告

一、实验目的1. 了解鲎试验的原理和方法。

2. 掌握鲎试验在微生物检测中的应用。

3. 提高微生物学实验技能。

二、实验原理鲎试验是一种检测微生物内毒素的试验方法。

鲎血中含有一种特殊的凝固蛋白，当鲎血接触到细菌内毒素时，凝固蛋白会立即凝固，从而产生凝胶。

根据凝胶形成的时间，可以判断样品中内毒素的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鲎试剂- 标准菌液- 待测样品- 生理盐水- 移液器- 培养皿- 灭菌棉签- 酒精灯- 镊子2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 移液管- 培养皿- 镊子四、实验步骤1. 准备工作：- 将鲎试剂置于37℃恒温水浴箱中预热。

- 将待测样品和标准菌液分别用生理盐水进行稀释。

2. 制备样品：- 取适量鲎试剂加入培养皿中，加入适量的生理盐水，混匀。

- 分别加入标准菌液和待测样品，混匀。

3. 观察结果：- 将培养皿置于37℃恒温水浴箱中，观察凝胶形成的时间。

- 记录标准菌液和待测样品的凝胶形成时间。

4. 结果分析：- 根据凝胶形成的时间，判断样品中内毒素的含量。

五、实验结果与分析1. 标准菌液凝胶形成时间为5分钟，说明标准菌液内毒素含量较高。

2. 待测样品凝胶形成时间为8分钟，说明待测样品内毒素含量较高。

3. 根据凝胶形成的时间，判断待测样品内毒素含量为中等。

六、实验讨论1. 鲎试验是一种简单、快速、灵敏的检测微生物内毒素的方法。

2. 在实验过程中，应注意操作规范，避免污染。

3. 实验结果与实际情况可能存在一定的误差，需结合其他实验方法进行综合判断。

七、实验总结通过本次实验，我们了解了鲎试验的原理和方法，掌握了鲎试验在微生物检测中的应用，提高了微生物学实验技能。

在实验过程中，我们应注意操作规范，保证实验结果的准确性。

同时，我们应不断总结经验，提高实验技能，为微生物学领域的研究贡献力量。

鲎试剂凝胶法

(1)0.03 Eu/ml； (2)0.06 Eu/ml (3)0.125 Eu/ml； (4)0.25 Eu/ml； (5)0.5 Eu/ml； (6)1.0 Eu/ml。以细菌内毒素国家标准品或工作标准品复核本品的灵敏度值，应为标示值的 50～200% 。【贮藏】
遮光，在冷处保存。
【包装】
(1)1ml 安瓿；(2)2ml 安瓿；(3)5ml 安瓿；(4)7ml 抗生素瓶；(5)10ml 抗生素瓶【有效期】
稀释内毒素标准品时应按其使用说明用漩涡混合器混合适当的时间。 2.2 检品稀释当检品需要控制的内毒素限值大于鲎试剂的灵敏度值时，需要用检查用水对检品进行稀释，计算公式如下：
MVD：检品的最大有效稀释倍数 L：检品需控制的内毒素限值（Eu/ml） λ：鲎试剂灵敏度值（Eu/ml） [举例]：某检品需要控制的内毒素限值为 5Eu/ml，使用灵敏度 λ=0.25Eu/ml 的鲎试剂作细菌内毒素检查。
二年
【批准文号】
(94)卫药准字 SJ-01 【生产企业】
企业名称：湛江安度斯生物有限公司
地址：广东省湛江市人民大道中 38 号邮政编码：524022 电话：（0759）3380672 传真：（0759）3391072
E-mail:zacb@ 网址：
若阳性对照管为阴性表明鲎试剂或标准内毒素已失效或鲎试剂的灵敏度及标准内毒素的效价标示不准确或标准内毒素的稀释有误
鲎试剂说明书
【名称】通用名：鲎试剂英文名：Tachypleus Amebocyte Lysate (TAL) 汉语拼音：Hou Shi Ji 【性状】本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水中易溶。【原理】本品为鲎科动物东方鲎（Tachypleus Tridentatus, Leach）的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品，内含能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原（Proclotting enzyme）和凝固蛋白原（Coagulogen）。在适宜的条件下（温度，pH 值及无干扰物质），细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。凝胶法鲎试剂是根据反应所形成凝胶的程度来限量检测细菌内毒素。【用途】用于细菌内毒素检查。【使用方法】 1. 实验准备 1.1 选择所需规格及灵敏度的鲎试剂，细菌内毒素标准品以及细菌内毒素检查用水。 1.2 10×75mm 反应试管（若使用 0.1ml 规格的鲎试剂无需准备此试管）和大口径稀释试管若干支，以及移液器具。实验所用器皿须经 250℃干烤至少 1 小时或其它适宜的方法除去可能存在的外源性热原。 1.3 水浴恒温器或干热恒温器，漩涡混合器，试管架，计时器。实验开始前应把恒温器温度调到 37±1℃。 2. 实验操作 2.1 内毒素标准品稀释取内毒素标准品（冻干品）1 支，开启，按使用说明加入检查用水溶解后分步稀释至所需浓度备用。如下稀释方法供参考：

2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》

2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》凝胶法鲎试剂使用说明书【名称】通用名：鲎试剂英文名：Tachypleus Amebocyte Lysate （简称TAL）汉语拼音：hou shi ji本品主要成份为B因子、C因子、凝固酶原、凝固蛋白原。

【用途】专用于细菌内毒素检查。

【性状】本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水和生理盐水中易溶。

【原理】本品为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品，在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。

【用法】1．材料和设备1.1选择所需的规格及灵敏度的鲎试剂、细菌内毒素工作品及细菌内毒素检查用水。

1.2准备若干支10ⅹ75mm玻璃反应试管（若使用0.1ml规格的鲎试剂无需准备此试管）、各种规格吸管或移液器或注射器、稀释内毒素用玻璃管、反应试管架、计时器、旋涡混合仪、恒温水浴箱（37±1℃）。

2．实验操作2.1 稀释细菌内毒素工作品：取内毒素工作品（冻干品）1支，按细菌内毒素工作品使用说明书进行操作。

2.2 TAL试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于TAL试剂中，轻轻振摇至少30S至试剂完全溶解。

注意不要引起气泡，溶解后的试剂应在短时间内使用（即配即用）。

2.3 检查操作2.3.1 取分装有0.1ml 鲎试剂溶液的10×75mm试管或复溶后的0.1ml /支规格的鲎试剂原安瓿8支，其中2支作供试品管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。

2.3.2 每支供试品管加入0.1ml供试品；阴性对照管加入0.1ml检查用水；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ内毒素的供试品。

2.3.3 封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟，然后取出观察结果。

试管在孵育期间应避免任何的振动。

[精华]鲎试剂试验方法

[精华]鲎试剂试验方法鲎试剂实验方法鲎试剂按实验方法可分为:凝胶法、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂。

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。

凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。

此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。

凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试或0.5ml/支至5.2ml/瓶的真空封口西林瓶装的多个测试。

使用时一般应加细菌内毒素检查用水复溶后使用。

厦门市鲎试剂实验厂有限公司的真空封口试管凝胶法鲎试剂是把鲎试剂直接灌装在试管中，在真空中压盖封口的新产品。

使用时直接用样品溶解鲎试剂，不会割伤手，更加简单方便安全。

特异性鲎试剂，即弃G因子鲎试剂，是厦门市鲎试剂实验厂有限公司国内首创的产品，它专一对内毒素起反应，避免了G因子旁路的干扰，使检测结果更加可靠，在药检和临床检验方面是不可或缺的理想检测试剂。

目前厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的各种内毒素检测鲎试剂均为特异性鲎试剂，都能对抗葡聚糖的干扰，只对内毒素起反应。

因此不列为独立品种。

动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂，这四种方法都是定量检测内毒素的。

这几种定量法鲎试剂统称光度法鲎试剂。

根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。

终点浊度法未见商品化产品。

动态浊度法(又称动态比浊法)是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

动态浊度法的特点为:1. 能准确定量。

2.检测范围宽，可达4个数量级。

3.灵敏度高达0.005EU/ml。

4. 操作简便，系统自动检测分析，一步即成。

5. 经济实用，试剂样品需要量少，可降至50μL。

6. 和微生物检测系统Elx808(配套IU)及专用软件TALgent使用，一次可同时检测多达96个样品。

鲎试剂_精品文档

鲎试剂摘要：本文档介绍了鲎试剂的基本概念、用途、制备方法、相关研究进展及其在生物医学领域的应用。

鲎试剂是一种重要的化学试剂，因其在生物医学研究中的广泛应用而备受关注。

在本文中，我们将详细探讨鲎试剂的制备方法和相关合成技术，并介绍其在生物医学研究中的应用前景。

1. 引言鲎试剂是一类重要的化学试剂，广泛应用于生物医学研究领域。

鲎是一种海洋生物，其体内含有丰富的活性物质，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种生物活性，因此被广泛应用于药物研发和生物医学研究中。

2. 鲎试剂的制备方法2.1. 鲎采集与提取鲎是一种海洋底栖无脊椎动物，生长在海洋深处，常见于大洋的中、深层海域。

采集鲎主要有两种方法，一种是利用潜水艇、潜水器等工具直接采集；另一种是利用钓网、拖网等渔具进行捕捞。

采集到的鲎需要迅速进行冷冻保存，以保持其生物活性。

提取鲎试剂主要有两种方法，一种是通过高温高压提取，将鲎样品加入适量的溶剂中，在高温高压的条件下进行提取。

另一种是通过酸碱提取，将鲎样品进行酸碱处理，使其中的目标物质转化为带电离子，再通过溶剂分离。

2.2. 鲎试剂的纯化与分离提取得到的鲎试剂需要进行纯化和分离，以获得纯度较高的鲎试剂。

常用的纯化和分离方法包括反渗透、离心分离、柱层析等。

这些方法可以有效地去除杂质，提高鲎试剂的纯度。

2.3. 鲎试剂的结构鉴定经过纯化和分离后的鲎试剂需要进行结构鉴定，以确定其化学成分和结构。

常用的结构鉴定方法包括质谱分析、核磁共振等。

这些方法可以帮助研究者了解鲎试剂的化学性质，并为进一步研究和应用提供依据。

3. 鲎试剂的应用前景3.1. 鲎试剂在药物研发中的应用由于鲎试剂具有多种生物活性，因此被广泛用于药物研发领域。

鲎试剂可以作为药物候选物，通过对其进行结构优化和改造，开发出具有较高药效的新药。

同时，鲎试剂也可以作为药物控释系统的载体，实现药物的控制释放。

3.2. 鲎试剂在生物医学研究中的应用鲎试剂在生物医学研究中有着广泛的应用。

标准品、鲎试剂操作规程

标准品、鲎试剂操作规程目的：建立标准品、鲎试剂操作规程，指导检验员正确执行标准品、鲎试剂操作。

1.适用范围：适用于标准品、鲎试剂操作。

2.定义2.1标准品系以细菌内毒素国家标准品为基础标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

3.责任：QC人员。

4.规程4.1申购4.1.1标准品采购：按《对照品操作规程》中对照品申购程序，进行采购。

到药品检验所或中国生物制品检定所统一订购。

4.1.2鲎试剂采购：由管理员根据检验需要，填写申购单，注明：品名、规格、灵敏度、数量、购回日期。

交化验室主任核准后，交物料部采购。

4.2接收4.2.1物料部将鲎试剂与标准品购回后，管理员接通知，开具领料单。

4.2.2经化验室主任签字后，凭领料单到仓库领用。

4.2.3接收前，管理员仔细核对所领细菌内毒素工作标准品或鲎试剂的规格、数量、有效期和灵敏度，检查外包装、标签有无损坏或泄漏。

无误后，方可接收。

4.3贮存4.3.1接收的标准品与鲎试剂根据其特性存放在适宜的条件下，且根据批号、灵敏度分类摆放。

4.3.2管理员及时登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》。

4.4发放、使用4.4.1检验员根据检品需要，向管理员申请试验用量的标准品、鲎试剂。

4.4.2管理员在核实申请情况后，方可发放。

4.4.3领用后，检验员登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》，管理员签名确认。

4.4.4每批入库的鲎试剂必须按药典规定，进行灵敏度复核试验，符合规定后方可发放、使用。

4.4.5鲎试剂灵敏度复核4.4.5.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每步混匀30秒。

4.4.5.2取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个浓度平行做4管；另两管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。

鲎试剂灵敏度复核SOP

鲎试剂灵敏度复核SOP1.目的为规范鲎试剂标示灵敏度复核的操作，确保鲎试剂试验的准确性，特制定此操作规程。

2.范围本标准操作规程适用于新批号鲎试剂使用前对标示灵敏度的复核以及试验条件发生任何可能影响检验结果的改变时，对鲎试剂标示灵敏度的复核。

3.定义无4.职责4.1QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。

4.2QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。

4.3质量总监负责批准本规程。

4.4QA负责本规程执行的监督。

5.引用标准《中华人民共和国药典》2020年版二部6.材料见8.程序。

7.流程图无8.程序8.1试剂：细菌内毒素工作标准品、鲎试剂溶解水、待复核灵敏度的鲎试剂。

8.2仪器与设备：恒温水浴箱、烤箱、小试管、中管、半中管。

8.3操作步骤8.3.1试验前准备试验用吸管、小管等玻璃器皿应在试验前1～2天内包好，经200℃干烤2小时除内毒素备用。

8.3.2鲎试剂灵敏度复核根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30秒钟；取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×100mm试管18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照；将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。

8.4结果判定8.4.1将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。

保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

8.4.2当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。

鲎试剂

动态浊度法: 检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
光度测定法：显色基质法
• 利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。终点显色法：依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法：是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测色度增长速度的方法。
光度测定法：检査法
• 按“光度测定法的干扰试验” 中的操作步骤进行检测。 • 使用系列溶液C 生成的标准曲线来计算溶液A 的每一个平行管的内毒素浓度。 • 试验必须符合以下三个条件方为有效： (1 )系列溶液C 的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求； (2 )用溶液B 中的内毒素浓度减去溶液A 中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%〜200%的范围内； (3) 阴性对照的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间。
凝胶法:凝胶半定量试验
• 本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3 制备溶液A 、B、C 和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。结果判断：若阴性对照溶液D 的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0 .5〜2ƛ，试验有效。系列溶液A 中每一系列的终点稀释倍数乘以ƛ，为每个系列的反应终点浓度。如果检验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数，即得到每一系列内毒素浓度c。
鲎试剂
• 鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和(1,3)-β-葡聚糖. • 普通鲎试剂灵敏度0.5～0.125EU/ml，适用于仅需要检测内毒素限量的样品。高灵敏度鲎试剂灵敏度0.06～0.015 EU/ml，适用于内毒素限量较低的样品细菌内毒素检查。特异性鲎试剂灵敏度0.5～0.015EU/ml，适用于成分较为复杂，会对鲎试剂产生干扰的样品。定量法鲎试剂最低检测限0.03～0.005 EU/ml，适用于需要对内毒素进行定量测定的样品。

显色基质鲎试剂盒使用说明书 (终点显色法,含偶氮化试剂)

显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂)【用途】显色基质鲎试剂( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate , CE TAL )用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。

【原理】鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。

在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。

同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。

【检测限】按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1 EU/ml和0.01EU/ml -0.1EU/ml两个区间( 反应时间T 1 和T 2 见出厂检验报告) 。

【试剂盒组成】细菌内毒素工作品，2支鲎试剂， 1.7ml/支，2支显色基质，1.7ml/支，2支偶氮化试剂1，10ml/支，2支偶氮化试剂2，10ml/支，2支偶氮化试剂3，10ml/支，2支HCl (反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，2瓶【贮存】阴凉处, 最佳2-8℃,避光贮存。

【用法】1 .材料和设备1.1 试剂鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1 、偶氮化试剂2 、偶氮化试剂3、HC l ( 反应终止剂) 、细菌内毒素检查用水。

1.2器材旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。

恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。

注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。

中国药典2020版鲎试剂细菌内毒素检查预试验SOP

1目的建立细菌内毒素预试验操作规程，以指导检验人员的正确规范操作，为保证细菌内毒素检查凝胶法的准确性提供依据。

2适用范围适用于细菌内毒素检查法的“鲎试剂灵敏度复核试验”和“干扰试验”。

本规程参照《中国药典》2020年版四部-1143细菌内毒素检查法制定。

3职责进行细菌内毒素检查的操作人员严格按本规程进行操作。

4内容4.1基本原理4.1.1本法采用凝胶法，系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。

4.1.2鲎试剂灵敏度复核试验：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

4.1.3干扰试验：当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项目的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

4.1.4本试验操作过程应防止内毒素的污染。

4.1.5EU：内毒素单位，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。

4.1.6λ：鲎试剂的标示灵敏度，单位：EU/ml。

4.1.7MVD：最大有效稀释倍数，指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数。

4.2材料准备4.2.1细菌内毒素工作标准品：应经细菌内毒素国家标准品为基准标定效价；4.2.2鲎试剂：当使用新批号前，按《细菌内毒素预试验SOP》进行灵敏度检查；4.2.3细菌内毒素检查用水（BET水）：内毒素含量应＜0.015EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用；4.2.4供试品溶液：pH宜在6.0~8.0范围内，否则用已去除内毒素和干扰因子的酸、碱溶液或缓冲液调节。

4.3器具准备4.3.1移液枪、一次性除热源枪头（1000μL、200μL）；4.3.2剪刀、砂轮片、试管架、除热源试管、医用胶布；4.3.3恒温培养箱（37℃±1℃）、旋涡混合器、洁净工作台。

4.4鲎试剂灵敏度复核试验4.4.1试验过程：4.4.1.1根据当批鲎试剂的标示灵敏度（λ），把细菌内毒素工作标准品用适量BET水充分溶解，避免产生气泡，在旋涡混合器上混匀15分钟。

光度法鲎试剂

光度法鲎试剂
光度法鲎试剂是一种用于测定蛋白质浓度的试剂，其原理是利用鲎蛋白与试剂中的染料结合产生吸收峰的变化来测定蛋白质的浓度。

该试剂具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。

光度法鲎试剂的原理是基于鲎蛋白与试剂中的染料结合产生吸收峰的变化来测定蛋白质的浓度。

鲎蛋白是一种具有高度稳定性和可重复性的蛋白质，其与试剂中的染料结合后会产生吸收峰的变化，这种变化与蛋白质的浓度成正比。

因此，通过测定吸收峰的变化，可以计算出样品中蛋白质的浓度。

光度法鲎试剂的操作非常简单，只需要将试剂与待测样品混合后，通过分光光度计测定吸收峰的变化即可。

该试剂具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。

在实际应用中，光度法鲎试剂可以用于测定多种类型的蛋白质，包括纯化的蛋白质、细胞裂解液中的蛋白质、血清中的蛋白质等。

同时，该试剂还可以用于测定蛋白质的相对分子质量、酶的活性等指标。

总之，光度法鲎试剂是一种非常实用的蛋白质浓度测定试剂，具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，在生物化学、分子生物学等领域得到了广泛应用。

鲎试剂灵敏度复核标准操作规程

范围：鲎试剂职责：检验室对本规程的实施负责正文：1.内毒素标准溶液的制备1.1取细菌内毒素国家标准品（NSE）或内毒素工作标准品（WSE）一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。

1.2按标准品使用说明书用移液管加入规定量的细菌内毒素检查用水（BET）溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。

置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。

若为NSE，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存。

2.待复核鲎试剂的准备2.1在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1mlBET水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

2.2若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后每0.1ml分配到10×75mm凝聚管中，要求至少分配18支管备用。

3.加样3.1将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4支（管）4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；2支（管）1列分别加入BET水。

内毒素标准溶液和BET水的加样量均为0.1ml/支。

4.加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟，观察结果。

5.鲎试剂灵敏度复核如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。

λc＝lg- 1 （∑X/4）式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。

鲎试剂标准

鲎试剂标准本品为鲎科动物东方鲎（Tachyplecus tridentatus）的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品。

本品含能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原（Proclotting enzyme），凝固蛋白原（Coagulagen）其灵敏度以细菌内毒标准品或工作标准品测定，应为标示量的50％－200％。

（一）性状本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水生生理盐水中易溶。

（二）鉴别1．取本品按装量加水溶解后，加茚三酮试液《中国药典1990年版》（二部附录162页）0.25ml，加热煮沸1－2分钟，显蓝色紫色。

2．取本品按装量加水溶解后，再加水适当稀释，照分光光度法《中国药典1990年版》（二部附录24页）测定，在270±1nm的波长处有单一吸收峰。

3．取本品按装量加入内毒检查用水溶解后，吸取0.1ml加入0.1ml细菌内毒素工作标准品或标准品50EU，混匀后，于37℃水浴中放置1小时，有凝胶形成。

（三）检查干燥失重：取本品约0.1在g ，在66℃减压干燥至恒得，减失重量不得过5％（中国药典1990年版二部附录55页）。

自身凝集：取本品4支，按装量加入配带的鲎试剂溶剂，溶解后，分别从每支取0.1ml，再分别加入配带的鲎试剂溶剂0.1ml，混匀后，于37±1℃水浴中放置4小时，不得形成凝胶，若有2管以上形成凝胶，判为不合格；若仅有1管形成凝胶，照同样方法，另取8支重复检查，8支均不得形成凝胶。

缓冲能力：任意取5％、10％葡萄糖注射液，氯化钠注射液无菌注射用水或注射用水适量，加稀盐酸调节pH使供试品溶液pH值为2.90-3.00，取此溶液适量与等量鲎试剂溶解液混匀，重复测定，pH值应为6.00-8.00。

（四）灵敏度测定预测：1．取细菌内毒素工作标准品1支，按说明溶解燕稀稀释成1→8等比系列稀释液。

2．取同一批鲎试剂若干支，分别按标示量加入配带的试剂溶剂制成鲎试剂溶液。

取10×75mm试管若干支，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，加入内毒素稀释液0.1 ml ，每一稀释液最少作2管，同时作2管阴性对照。

显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法,含偶氮化试剂)

显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂)货号：T7571保存：阴凉处，最佳2-8℃，避光贮存。

产品内容：细菌内毒素工作品，5支鲎试剂， 1.7ml/支，5支显色基质，1.7ml/支，5支偶氮化试剂1，10ml/支，5支偶氮化试剂2，10ml/支，5支偶氮化试剂3，10ml/支，5支HCl(反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，3瓶用途：显色基质鲎试剂(Chromogenic End-point TachypleusAmebocyte Lysate，CE TAL)用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。

原理：鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品，鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405nm）。

在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。

同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax=545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。

检测限：按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1EU/ml和0.01EU/ml-0.1EU/ml两个区间(反应时间T1和T2见出厂检验报告)。

用法：1.材料和设备1.1试剂鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1、偶氮化试剂2、偶氮化试剂3、HC l(反应终止剂)、细菌内毒素检查用水。

1.2器材无热原试管、无热原吸头、旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架、恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。

注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。

玻璃器皿可经250℃干烤至少60分钟去除热原。

热原用鲎试剂

热原用鲎试剂热原（thermogravimetric analysis，简称TGA）是一种常用的热分析技术，用于研究材料的热稳定性、热分解动力学以及吸附和脱附等热性质。

而鲎试剂（Argon gas）则是一种常用的保护气氛，用于在高温下防止材料与空气中的氧气发生反应。

热原用鲎试剂的应用：热原实验通常是在高温下进行的，而高温条件下，很多材料都会与空气中的氧气发生反应，导致样品的质量变化。

为了避免这种干扰，常常需要使用一种惰性气氛来代替空气，保护样品免受氧气的影响。

鲎试剂（Argon gas）是一种常用的惰性气体，其主要成分为氩气，具有稳定性好、不易与其他元素发生反应的特点，因此被广泛应用于热原试验中。

热原用鲎试剂的作用机制：热原实验中使用鲎试剂的主要作用是形成一个惰性气氛，以防止样品与氧气发生反应。

具体来说，鲎试剂的作用机制有以下几个方面：1. 防止氧化反应：在高温下，许多材料易于与氧气发生氧化反应，导致质量损失或样品结构的改变。

鲎试剂中的氩气能够与氧气竞争反应，将氧气排除在样品周围，从而有效地防止了氧化反应的发生。

2. 保护样品的热稳定性：有些材料在高温下会发生分解或挥发，而这些反应会导致样品质量的变化。

鲎试剂的惰性气氛可以提供一个稳定的环境，减少与材料之间的相互作用，从而保护样品的热稳定性。

3. 促进热解反应：在一些热原实验中，需要研究材料的热解反应过程。

鲎试剂的作用可以将气氛中的氧气排除，从而使样品在高温下更容易发生热解反应，提高热解反应的速率和效率。

总结：热原是一种常用的热分析技术，研究材料的热性质和热分解动力学。

为了在高温下保护样品免受氧气的影响，常常使用鲎试剂作为惰性气氛。

鲎试剂的主要作用是防止氧化反应、保护样品的热稳定性以及促进热解反应。

通过使用鲎试剂，可以提高热原实验的准确性和可靠性，进一步深入了解材料的热性质。

厦门市鲎试剂实验厂内毒素去除试剂盒说明书

For Re. 内毒素浓度对内毒素去除效率的影响
厦门市鲎试剂实验厂有限公司
样品内毒素的浓度直接影响内毒素的去除效率。
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内毒素去除试剂盒说明书
4. 再次使用. 如果流出样品内毒素水平未能达到预期值，需要将预装柱重新再生，按照步骤 1 重新再生，然后上样纯化。 5. 保存条件. 如果预装柱用完后需要保存，先用 10ml 平衡缓冲液平衡柱子，待平衡液流干，加入 1.5ml 的再生缓冲液（含 0.02%的叠氮化钠）。样品和亲和树脂的接触时间太短育来解决 VI. FACTORS AFFECTING ENDOTOXIN REMOVAL EFFICIENCY 虽然多粘菌素 B（PMB）和内毒素特异性结合的机理还存在很多争议，但是它们之间是通过静电作用，离子作用，亲水作用和分子之间的相互作用等多种因素共同作用的结果是大家普遍接受的事实。因此，在实验中存在若干因素可能会影响内毒素的内毒素与目的蛋白结合太牢固去除效率，如：缓冲液的 pH 值，内毒素的浓度，内毒素与亲和树脂的接触时间，离子强度，温度以及样品的特性等等。下面是我们关于 pH 值和内毒素浓度对内毒素去除效率影响的研究：和树脂上样品损失高目的蛋白与内毒素结合牢固，一起 2. 增加样品与亲和树脂的接触时结合在树脂上间
图 1. pH 值对内毒素去除效率的影响当 pH 值为 5-10 时，亲和介质对内毒素的去除率均在 92%以上，而当 pH 值超过此范围时，内毒素去除效果明显降低。 pH 值在 7-8 的范围内效当率最高。
VII. TROUBLESHOOTING 问题可能原因样品的 pH 值没有在 7-8 之间解决方法调节 pH 值至 7-8 降低样品的流速，或者通过低温孵

如何正确使用鲎试剂

如何正确使用鲎试剂内毒素检查法结果准确与否与所用鲎试剂的灵敏度相关性很大，而鲎试剂的灵敏度与它的正确使用又密切相关。

所以，一定要严格执行鲎试剂的质量标准，规范使用鲎试剂。

保证所使用鲎试剂的质量鲎试剂的质量主要表现在其灵敏度、自凝时间与成胶状态三个方面：灵敏度稳定;自凝时间不低于24h;具有一定的缓冲能力与合适的pH;反应后即形成坚实凝胶，将成胶安瓿翻转180°而不会被破坏。

而质量稍差的鲎试剂存放一定时间后(如半年)其灵敏度可能发生变化，而灵敏度的改变会使测定结果所反映的供试品中内毒素的允许限值发生变化。

因此，需选择具有国家颁发的批准文号,质量稳定的鲎试剂。

对鲎试剂灵敏度进行监测性复核由于不同厂家鲎试剂质量不尽相同，即便是相同厂家不同批号的鲎试剂也有差异,这便导致鲎试剂灵敏度复核值与标示值不尽一致，因此鲎试剂的复核值对检测结果有显著影响。

每使用新批号鲎试剂时应复核其灵敏度;对留样鲎试剂自生产之日起，每6个月进行一次灵敏度检测，其灵敏度在有效期内应符合规定。

有研究表明，鲎试剂的灵敏度在符合标准规定及适当的贮存条件下,3年内其灵敏度变化不大，是稳定的。

建议可适当延长其有效期。

因此，对鲎试剂灵敏度进行监测性复核有利于确保实验的准确性，同时可以最大程度地使用鲎试剂。

使用过程正确操作选择合适的操作方法与顺序，在鲎试剂的使用过程中尤为重要。

在操作过程中要注意以下几点：(1)实验室要求洁净、无尘埃流通;检验人员同时注意卫生的保持。

在整个使用操作过程中应防止微生物的污染，例如空气的流动，人员的口沫、汗液污染等。

(2)鲎试剂开启、溶解和配制时应尽量避免将安瓿外瓶壁脏物、瓶壁碎片、砂轮锯屑等异物混入鲎试剂中，避免鲎试剂外损。

(3)鲎试剂中含有多种蛋白质，用力振摇会产生气泡，一旦起泡难以消除，而影响检测的准确性，所以在整个操作过程中都要轻力以避免因过分震动而引起的误差。

(4)量取和加样反应物时，一定要加到试管底部接近鲎试液而不接触鲎试液的管壁处。