第三章第一节酶生物合成的调节
酶工程 第三章酶的发酵生产 第一节酶生物合成的基本理论
第一节 酶生物合成的基本理论
转录时，RNA聚合酶首先结合到DNA的特定位点（启动基因）上，DNA的 双螺旋链部分解开，以其中一条链为模板，通过碱基互补方式结合进第一个 核苷三磷酸，然后随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋逐渐解开，按照模板上 的碱基顺序逐个加入与其互补的核苷三磷酸并聚合而生成多聚核苷酸链。在 RNA聚合酶后面生成的多聚核苷酸链立即与模板分开，DNA分子的两条链又重 新缠绕形成双螺旋。（图3-1）
第一节 酶生物合成的基本理论
三、酶生物合成的调节
如上所述，酶的生物合成要经过一系列的步骤，需要 诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因素 都会影响酶的生物合成。那么，究竟哪些因素对酶的生物 合成起主要的调节控制作用呢？研究结果表明，至少在原 核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是至为重要的。
的过程,称为酶生物合成的诱导作用。简称为诱导作用。 起诱导作用的物质，称为诱导剂。例如，乳糖诱导β—半 乳糖苷酶的合成等。
酶生物合成的诱导作用过程如图3-4所示。
第一节 酶生物合成的基本理论
第一节 酶生物合成的基本理论
(B)
图3-4酶生物合成的诱导作用 （A）-----无诱导物时 （B）----添加诱导物时
转录水平调节控制，又称为基因的调节控制。这种控 制理论最早是由雅各（Jacob）和莫诺德(Monod)于1960年 提出的操纵子学说来阐明的，1966年发现了启动基因，使 这一调节控制理论不断完善。
第一节 酶生物合成的基本理论
根据基因调节控制理论，在DNA分子中，与酶生物合 成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因(Regulator gene)、启动基因(Promoter gene)、操纵基因(Operator gene)和结构基因(Strutural gene)。其中，结构基因与 酶有各自的对应关系，结构基因中的遗传信息可转录成 mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链。操纵 基因可以特异性地与调节基因产生的边构蛋白（阻抑蛋白） 中的一种结构结合，从而操纵酶合成的时机及速度。结构 基因与操纵基因一起称为操纵子。启动基因决定酶的合成 能否开始，启动基因由两个位点组成，一个是RNA聚合酶 的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸接受 蛋白（CRP）的复合物（cAMP- CRP）的结合位点。只有在 cAMP- CRP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA
酶的生物合成
生产酪氨酸脱羧酶、链激酶、链道酶、双链酶等(有溶解血栓、血 块，加速伤口愈合等作用)
产生葡萄糖异构酶
.
8
2、 放线菌
菌种
(1) 链霉菌属
(Streptomyces)
委内瑞拉链霉菌 (S. venezulae)
灰色链霉菌 (S. griseus) 白色链霉菌 (S. albus)
不产色素链霉菌 (S. achromogenes)
(4) 透明质酸酶
治疗关节损伤、关节周围炎症及膝外伤，传染性肝炎及肝硬 化等
用做药物扩散剂
.
22
四、 产酶微生物的来源
1、土壤中的产酶微生物 2、水体中的产酶微生物 3、空气中的产酶微生物 4、极端环境中的产酶土壤是微生物生活的大本营，为微生物生长繁 殖及生命活动提供了各种条件
用于分析组成和杂质浓度的分析方法的细节
酶或微生物的毒理数据
微生物必须是非致病性的 微生物一定不能产生真菌素或其他毒性化合物 微生物一定不能产生抗生素
.
33
二、 微生物酶的发酵生产
1、酶的发酵生产方法 2、培养基的配制 3、种子培养 4、微生物发酵产酶的一般工艺
.
34
1、 酶的发酵生产方法
(1) 固体培养法 (2) 液体培养法
酶)
.
13
4、 霉菌
菌种 (4) 青霉(Penicillium)
酶及功能
点青霉 (P. notatum) 产紫青霉 (P. ururogenum)
产黄青霉 (P. chrysogenum)
橘青霉 (P. citrinum)
(5) 犁头霉(Absidia)
葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶，中性、碱性蛋白酶和青霉素V酰化酶 5’-磷酸二脂酶(水解RNA，生产4种5’-单核苷酸，肌苷酸和鸟苷
第三章 酶的生物合成
溶氧量过低，会对微生物生长、繁殖和新陈代 谢产生影响，从而使酶产量降低。但，过高的 溶氧量对酶的发酵生产业会产生不利影响，一 方面会造成浪费，另一方面高溶氧也会抑制某 些酶的生物合成，因此在整个发酵过程中应根 据需要控制好溶氧量。.
酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节， 在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的 调节控制机制，其中，转录水平的调控占主 导地位，是酶生物合成中最重要的调节
.
操纵子
操纵子（operon）是一组功能上相关且受同 一调控区控制的基因组成的遗传单位
操纵子是酶合成调控的结构基础
.
操纵子调控模型
根据基因调节理论，在 DNA 分子中，与酶的生物 合成有密切关系的基因有 4 种。它们是调节基因 （regulator gene）、启动基因（promoter gene）、 操纵基因（operator gene）和结构基因（structural gene）。
蛋白酶
. 皮革脱毛
酶发酵生产菌种要求
产酶量高，具有生产应用价值 易培养，既能适应大生产粗放的营养和生产条
件，包括能利用廉价原料、对工艺条件要求不 苛刻 代谢速率高，发酵周期短 产酶稳定性好，菌种的生产性能不易退化，不 易感染噬菌体 安全可靠，要求菌种不是致病菌，其代谢物安 全无毒，在系统发育上与病原体无关 选用产胞外酶菌种，有. 利于酶的分离提取
.
发酵条件控制及对产酶的影响
温度：影响微生物生长和合成酶、影响酶合成 后的稳定性
pH:影响微生物体内各种酶活性，从而导致微生 物代谢途径发生变化；影响微生物形态和细胞 膜通的透性，从而影响微生物对培养基中营养 成分的吸收以及代谢产物的分泌；影响培养基 中某些营养物质的分解或中间产物的解离，从 而影响微生物对这些营养物质的利用
酶合成的调节
酶合成的阻遏Enzyme Repression：
1.终产物的阻遏：(end product repression):（ 反馈阻
遏) 即在合成代谢中，终产物阻遏该途径 所有酶的合成。 为基因表达的控制 。 如：色氨酸(Try)合成的调控(正调节)
Figure 5. Genetic organization of the Trp operon and its control elements
P = Promoter specific nucleotide sequence on DNA to which RNA polymerase binds to initiate transcription. (The promoter site of the lac operon is further divided into two regions, an upstream region called the CAP site, and a downstream region consisting of the RNAp interaction site. The CAP site is involved in catabolite repression of the lac operon.). If the Repressor protein binds to the operator, RNAp is prevented from binding with the promoter and initiating transcription. Under these conditions the enzymes concerned with lactose utilization are not synthesized.
动植物细胞中酶生物合成的调节
动植物细胞培养是通过特定技术获得优良的 动物和植物细胞，然后在人工控制条件的反 应器中进行细胞培养，以获： 离心分离技术 杂交瘤技术 胰蛋白酶消化处理技术 植物细胞获得： 机械捣碎或酶解外植物体 诱导愈伤组织（常用）
动植物细胞中酶生物合成的调节
诱导酶是抗体酶制备的主要方法，根据所采用的抗 原不同，诱导法又有半诱导法和酶蛋白诱导法
细胞分化改变酶的生物合成
• 多细胞组成的动物和植物，同一生物个体的不同细胞都含 有相同的染色体DNA，即所含有的基因的种类和数量一样， 但是在个体发育的不同阶段和不同类型的分化细胞中，由 于受到不同的调节控制，基因的表达有很大的差异酶的生 物合成有显著的不同，这就说明基因的表达具有时间性和 空间性。 • 例如，胰蛋白酶主要在胰细胞中合成，木瓜蛋白酶主要在 果皮细胞中合成等。其中，与细胞的的衰老和癌症的发生 有密切关系的端粒酶是细胞分化改变酶生物合成的一个典 型的例子。
• • • • 细胞分化改变酶的生物合成 基因扩增加速酶的生物合成 增强子促进酶的生物合成 抗原诱导抗体酶的生物合成
动植物细胞中酶生物合成的调节
• •
合成原理：动植物细胞酶生物合成的途径与微生物相似， 都是由DNA转录成RNA，加工成核酸酶，或者生成的 RNA翻译成多肽链，加工成蛋白质多肽酶。 动植物细胞与微生物细胞相比，结构要复杂得多，除了受 转录水平和翻译水平的调节之外，还受到激素水平等的调 节，到目前为止还没有完整的理论和模型来阐述动植物细 胞中酶生物合成的调节规律。这里我们从细胞改变酶的生 物合成，基因扩增酶加速的生物合成，增强子促进酶的生 物合成抗原诱导抗体酶的生物合成等方面介绍动植物细胞 酶生物合成的调节。
基因扩增加速酶的生物合成
第三章酶的生产
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
34
2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数
酶的生物合成调节机理
1.酶生物合成的分解代谢物阻遏作用
利用碳源阻遏诱导酶的合成 原因：当过量时，要通过分解代谢途径降解；释放能量， 促使ADP和AMP磷酸化生成ATP，使ATP浓度升高， AMP 浓度降低 又cAMP可通过磷酸二酯酶作用水解生成AMP cAMP＋H2O AMP
由于AMP 浓度降低，又cAMP水解生成 AMP，所以导致 cAMP浓度降低，必然使CAMP -CRP复合物的浓度降低。
酶的生物合成调节机理
•究竟那些因素对酶的生物合成起作用,研究表明转录水平的调节 控制对酶的生物合成起关键作用 •转录水平的调节控制又称为基因的调节控制 (一) 基因调节理论:调节基因R,启动基因P,操纵基因O,结构基 因:S,他们都存在于DNA中 S: R:可以产生阻抑蛋白;是一种变构蛋白,与低物特异结合而改变构 象,阻止其与操纵基因结合. O:可与阻抑蛋白特异性的结合 S与O一起称为操纵子
启动基因决定酶的合成能否开始,原因如下:
P有两个位点: 1. RNA聚合酶的结合位点； 2. 环腺赶酸苷酸（CAMP）与环腺苷酸的接受蛋白（CRP）的结合复 合物（ CAMP -CRP ）的结合位点。
只有复合物CAMP -CRP结合到P上时,聚合酶才能结合到P的第一个位 点上,这样酶合成才能开始.
当阻抑蛋白蛋白结合到操纵基因O上时，RNA聚合酶即使已经结合到 启动基因P上也无法通过操纵基因O进入结构基因S；因而无法转 录，只有当阻抑蛋白改变结构而不与操纵基因O结合时，聚合酶才 能正常工作。
基因对酶生物合成的调节控制有三种模式
1）分解代谢物阻遏作用 2）酶生物合成的诱导作用 3）酶生物合成的反馈阻遏作用
Hale Waihona Puke
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
米曲霉：半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科， 曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉菌落生长快， 10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变 为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状， 一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢 子梗2mm左右。
链霉菌
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3．酵母菌 酵母菌(yeast)是—类单细胞微生物，但不同于细菌，
属于真核微生物。
酿酒酵母 球拟酵母 假丝酵母
拟酵母
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4. 霉菌 霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主
二、产酶微生物的来源
1．土壤中的产酶微生物 2．水体中的产酶微生物 3．空气中的产酶微生物 4．极端环境中的产酶微生物
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三、产酶微生物的分离和筛选
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第三章 酶的生物合成
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
第一节 微生物发酵产酶
微生物发酵产酶的优点： 1）微生物种类繁多； 2) 微生物生长周期短，繁育快； 3) 微生物易改造，可通过多种手段育种。
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一、产酶微生物的种类 用于酶的生产的细胞必须具备几个条件 (1)酶的产量高 (2) 容易培养和管理 (3) 产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染 (4) 利于酶的分离纯化 (5) 安全可靠，无毒性
第三章第一节酶生物合成的调节PPT课件
AUG
反密码
GUU UAC ACA
5’
3’ mRNA
密码(codon)与反密码(anticodon) 的碱基配对
.
31
蛋白质合成的几个要素-核糖体，ribosome
• 核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。 是存在于细胞质内的微小颗粒。
.
32
The ribosome composition of
.
Few example
2
一、提取分离法
• 酶的提取：在一定的条件下，用适当的溶剂处理 含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。
• 主要提取方法：
– 盐溶液提取
– 酸溶液提取
– 碱溶液提取
– 有机溶剂提取等
注意选择适当 的溶剂！！！
.
3
• 优点：提取方法简单方便 • 缺点：
– 必须先获得含酶组织或细胞 – 受气候环境影响 – 若培养细胞则工艺路线变复杂 – 产品含杂质较多，分离纯化较困难
.
4
适用范围
• 在动植物资源丰富的地区 • 从动物胰脏中提取各种胰蛋白酶，小肠中
提取碱性磷酸酶
.
5
二、生物合成法（发酵法）
• 利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的 生命活动而获得人们所需酶的技术。
依细胞 种类不同
微生物 植物细胞 动物细胞
发酵产酶 培养产酶 培养产酶
.
6
• 酶的发酵生产：经过预先设计，通过
60年代中期，在操纵子中还发现了另一个开关基因，称为启动基因。启
动基因位于操纵基因之前，二者紧密相邻。启动基因由环腺苷酸（cAMP）启 动，而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。这样，葡萄糖便通过抑制环腺苷酸而间 接抑制启动基因，使结构基因失活，停止合成半乳糖苷酶。
酶工程教学大纲
《酶工程》课程教学大纲总学时数：30一、课程的地位、性质和任务酶工程（enzyme engneering）是生物技术专业的主干必修课，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的一门新的科学技术，在生物技术人才培养中处于至关重要的地位。
它涉及细胞工程、基因工程、发酵工程、生物分离工程和化学工程等诸多学科，主要内容包括酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶和细胞固定化以及酶的分子工程。
学生通过酶工程的学习，能够掌握酶的生产与分离纯化的基本理论、基本技术以及自然酶、化学修饰酶、固定化酶的研究和应用，了解酶在各行各业中的最新发展及研究趋势。
二、课程教学的基本要求学生通过酶工程的学习，应熟悉从应用目的出发研究酶，在一定生物反应装置中利用酶的催化性质的研究路线，掌握酶的生产与应用的基本理论、基本技术、酶的分离纯化、固定化酶以及酶的化学修饰的研究和应用，进一步了解酶在各行各业中实际应用的最新发展和发展趋势，在以后的毕业环节和工作中能够自觉地应用这些技术方法来指导自己的工作。
本课程理论课30学时，于本科三年级第二学期开设。
讲授方式：1．讲授2．利用CAI课件三、各章主要内容、学时分配及教学要求第一章绪论 2学时【单元目标】1．了解酶工程的研究意义；2．掌握酶工程的概念及研究内容。
【授课内容】一．酶与酶工程发展简史（一）酶学研究简史（二）酶工程研究简史二. 酶工程简介1.酶工程2.组成3.分类第二章微生物发酵产酶 4学时【单元目标】1.掌握酶生物合成的调节类型及调节机制2.了解产酶微生物的分离和选育方法3.了解动植物细胞与微生物细胞发酵产酶的异同【授课内容】第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成（一）RNA的生物合成--转录(transcription) （二）蛋白质的生物合成--翻译(translation) 1．翻译2．翻译过程即蛋白质的合成过程二、酶生物合成的调节（一）基因调控理论（二）酶合成调节的类型1.诱导 (induction)2.阻遏 (repression)（三）酶合成的调节机制三、提高酶产量的策略（一）菌种选育1.诱变育种2.基因工程育种（二）条件控制第二节酶发酵动力学一、细胞生长动力学（Monod方程）二、产酶动力学(一) 酶生物合成的模式1.生长偶联型2.部分生长偶联型3.非生长偶联型(二) 产酶动力学第三节微生物发酵产酶一、产酶微生物的分离和选育二、微生物发酵产酶方法1.固体培养2.液体培养3.固定化细胞三、微生物酶的类型1.胞外酶2.胞内酶第三章动、植物细胞培养产酶2学时一、动植物细胞与微生物细胞主要特性差异二、植物细胞培养产酶1.植物细胞培养的特点、提取法缺点2.培养基特点3.培养方法4.培养条件的影响与控制5.植物细胞培养产酶实例三、动物细胞培养产酶1.动物细胞培养的特点2.培养基3.培养方法4.培养条件的影响与控制第四章酶的提取与分离纯化 12学时【单元目标】1．掌握酶分离纯化的常用方法及其原理2．掌握几种常用的电泳方法及操作步骤2．了解酶的纯化方案的设计【授课内容】第一节酶的分离4学时一、发酵液预处理(一)发酵液的相对纯化(二)发酵液的固液分离二、细胞破碎（一）细胞壁组成（二）细胞破碎的方法（三）细胞破碎确认三、酶的提取(extraction)（一）理想提取液具备的条件、目标原则（二）提取方法四、离心分离（一）基本原理（二）离心机的种类（三）常用离心方法1．差速离心2．密度梯度离心3. 等密度梯度离心又称沉降平衡离心（四）应用五、沉淀分离（根据溶解度的不同）（一）盐析沉淀法（改变离子强度）（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）（三）等电点沉淀(isoelectric precipitation) （四）有机聚合物沉淀法（五）选择性变性沉淀法六、萃取（extraction）分离（一）溶剂萃取法（二）双水相萃取技术（三）超临界流体萃取（四）反胶团萃取第二节酶的精制5学时一、膜分离技术（一）扩散膜分离（二）加压膜分离（三）电场膜分离二、层析法（一）吸附层析（adsorption chromatography）1.原理2.吸附剂3.洗脱剂4.应用（二）凝胶过滤层析)(gel filtration chromatography)1.基本原理2.凝胶的种类和性质3.操作4.应用（三）离子交换层析（ion exchange chromatography，IEC）1. 原理2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程3. 操作4. 应用- 制备纯化生物大分子（四）疏水层析（hydrophobic interaction）1、原理2. 吸附剂3. 操作4. 应用（五）亲和层析(affinity chromatography)1. 原理2. 基质的选择3. 配体的选择4. 偶联（亲和吸附剂的制备）5. 操作及应用(六) 高效（压）液相层析（HPLC：high performance（pressure）liquid chromatography)1. 基本原理2. 分类3. 色谱仪组成第三节电泳一、电泳的基本理论1. 原理2. 电泳的分类3. 电泳常用设备二、聚丙烯酰胺凝胶电泳1.原理2.分离效应三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 原理2. 操作四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )1. 原理2. 操作3. 应用第四节酶的浓缩、干燥与结晶2学时一、酶的浓缩(一)蒸发浓缩(二)超滤浓缩(三)吸水剂(四)反复冻融浓缩(五)沉淀法二、酶的干燥三、酶的结晶（一）结晶的条件（二）结晶的方法第五节纯化方案的设计与评价１学时一、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据（二）纯化方法的排序二、纯化方案的评价（一）酶活力测定（二）蛋白质浓度测定（三）提纯倍数与回收率第五章酶分子的化学修饰 2学时【单元目标】1．掌握酶活性中心的概念及共性2．了解酶化学修饰的目的及原理3．了解酶化学修饰的种类及应用【授课内容】第一节酶的活性中心一、活性中心的概念二、活性中心的共性三、研究酶活性中心的方法1.物理学方法2.化学修饰法3.蛋白质工程第二节酶化学修饰及修饰目的一、酶化学修饰1.限制酶大规模应用的原因2.改变酶特性有两种主要的方法3.酶化学修饰的概念二、酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围第三节酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境第四节酶化学修饰的设计一、充分认识酶分子的特性二、修饰剂的选择三、反应条件的选择第五节酶化学修饰的种类及应用一、酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）1．定义2．修饰剂3．应用（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）1．定义2．侧链基团修饰剂3．几种重要的修饰反应（三）交联修饰（交联法）（四）固定化修饰（共价偶联法）二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（二）氨基酸置换修饰（三）金属离子置换修饰第六章酶与细胞的固定化 2学时【单元目标】1．掌握固定化酶和固定化细胞的定义及特点2．了解固定化酶和固定化细胞的性质及应用【授课内容】第一节酶与细胞的固定化一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点1.固定化酶 (immobilized enzyme)2.固定化细胞（immobilized cell）二、固定化方法（一）酶的固定化方法1.吸附法（adsorption）2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）3.交联法（crosslinking）4.包埋法(encapsulation)（二）各种固定化方法的优缺点比较（三）细胞的固定化方法1.固定化细胞的分类2.固定化方法（四）原生质体的固定化方法第二节固定化酶和固定化细胞的性质与表征一、固定化酶的性质二、固定化细胞的性质三、固定化酶（细胞）的评价指标第三节固定化酶与固定化细胞的应用一、在工业生产上的应用1．氨基酰化酶（Aminoacylase）2．葡萄糖异构酶二、固定化酶在医学上的应用1．消血栓2. 人工肾三、在分析检测中的应用1. 酶传感器1）酶传感器的原理2）酶传感器的应用2. 酶联免疫测定第七章酶反应器 2学时【单元目标】1．了解酶反应器的几种类型2．了解酶反应器的设计原理及操作【授课内容】第一节酶反应器的特点与类型一、酶反应器的类型（一）搅拌罐型（Stirred Tank Reacter, STR）（二）固定床型（也称填充床，Packed Bed Reactor, PBR ）（三）流化床型(Fludized Bed Reactor, FBR)（四）膜式反应器(Membrane Reactor)（五）鼓泡塔型反应器二、酶反应器的发展第二节酶反应器的设计与选择一、酶反应器的设计1.设计目的2.设计原理（依据）二、酶反应器的选择（一）酶的应用形式（二）底物的物理性质（三）反应操作要求（四）酶的稳定性（五）应用的可塑性及成本三、酶反应器的操作第八章酶的应用 4学时【单元目标】1．了解酶在医药方面的应用2．了解酶在食品方面的应用3．了解酶在化工方面的应用4. 了解酶在环境保护方面的应用5. 了解酶在生物技术领域的应用【授课内容】第一节酶在医药方面的应用第二节酶在食品方面的应用第三节酶在化工方面的应用第四节酶在环境保护方面的应用第五节酶在生物技术领域的应用四、使用教材与主要参考书目录1教材《酶工程》（第二版）作者：郭勇科学出版社 20042 主要参考书目郭勇现代生化技术，华南理工大学出版社， 1996郭勇酶的生产与应用，化学工业出版社个，2003罗贵民酶工程，化学工业出版社，2002张树政酶制剂工业，科学出版社，1984邹国林酶学，武汉大学出版社， 1997五、考核方法和成绩构成本课程为考试考核，包括两部分：期中及平时为30%，期末70%。
第三章酶的生物合成法生产
• 10）红曲霉
• 淀粉酶、糖化酶、蛋白酶
• 11）啤酒酵母
• 啤酒和酒类生产 • 转化酶、丙酮酸脱羧酶
• 12假丝酵母
• 脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱氢酶
2植物细胞
• 植物细胞培养主要用于:色素、药物、香精 和酶蛋白的生产 • 其中用于产酶的细胞 • 番木瓜细胞------木瓜蛋白酶 • 大蒜细胞----------超氧化物歧化酶 • 胡萝卜细胞-------糖苷酶
•解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株 •解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株
2. 基因工程育种
（二）条件控制 1. 添加诱导物
酶的底物类似物最有效。
2. 降低阻遏物浓度
除去终产物 产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖 分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMP
固定化原生质体技术
• 20世纪80年代发展 • 便于胞内酶的分离纯化
微生物酶的类型
1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、
纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的 大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞 内也能维持较低水平，受到的调节控制少。 2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶， 酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。
所需的 酶
分离纯化技术
酶的发酵液
第一节 细胞的选择
• • • • • • 用于酶生产的细胞必须具备条件： 1）酶的产量高； 2）容易培养和管理； 3）产酶稳定性好； 4）利于酶的分离纯化； 5）安全可靠，无毒性。
大多数酶采用微生物发酵生产，部分采用 植物细胞和动物细胞
1产酶微生物
• 利用微生物产酶优势：
4动物细胞培养基
第三章 酶的修饰方法
抗原诱导抗体酶的生物合成 抗体酶/催化性抗体是一种具有催化功能的抗体分子。
抗体是由抗原诱导产生的能与抗原特异结合的免疫球蛋白。
重链 哺乳动物有5种重链：α、δ、ε、γ和μ，对应组成的抗体为 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM。 不同的重链在大小和组成上有所区别。 恒定区和可变区。 轻链 哺乳动物有2种轻链（λ型和κ型） 恒定区和可变区。 每个抗体包含的2条相同的轻链；哺乳动物抗体的轻链只有 一个型:κ或λ型。 Fc段和Fab段 Fc段抗体标记部位；ELISA 过程中抗体固定的部位，结合 二抗的部位。 Fab抗原结合部位。
具有高效的催化活性。一般抗体酶催化反应速度比非酶催化反应速 度快102-106倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度。
抗体酶具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。
第二节 植物细胞培养产酶
植物是各种色素,药物，香精和酶等天然产物的主要来源。 目前已知的天然化合物30000多种，80%以上来自植物； 从植物中得到的药物有17类。 我国普遍使用的中草药及其制剂80%以上来自植物。 美国每年使用的植物来源的药物价值超过30亿美元。 植物来源的物质与人们生活密切相关。
增强子促进酶的生物合成
增强子是一段能够增强或促进基因转录的DNA序列。 1.比如，胰岛素基因增强子和胰凝乳蛋白酶基因的增强子都能够促进氯霉素乙酰 转移酶基因的表达（胰脏细胞） 2.NF-κB促进CASP9基因表达
增强子特点。 （1）无方向性； （2）不受增强子与其调控基因的之间距离影响。 （3）有些增强子有细胞和组织特异性。
第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节
酶合成原理：遵循中心法则。
酶生物合成的调节： 转录水平调节 蛋白翻译水平调节 激素水平调节 神经水平调节等， 但是到目前为止还没有完整的理论和模型来阐述动植物细胞中酶合成 的调节规律。
《酶生物合成的调节》课件
目录
01.
02.
03.
04.
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06.
酶具有高效性、专一性和稳 定性等特点
酶是一种生物催化剂，能够 加速生物化学反应的速度
酶在生物体内参与各种代谢过 程，如糖代谢、脂质代谢、蛋
白质代谢等
酶的缺乏或异常会导致代谢 紊乱和疾病发生
转录： DNA模板 链被RNA 聚合酶识 别并转录 成mRNA
酶生物合成调节在药物筛选 中的应用
酶生物合成调节在药物研发 中的作用
酶生物合成调节在药物合成 中的应用
酶生物合成调节在药物代谢 中的应用
酶生物合成调节 在生物制药中的 应用
酶生物合成调节 在生物能源中的 应用
酶生物合成调节 在生物环保中的 应用
酶生物合成调节 在生物农业中的 应用
农业：提高作物产量，改善作物品质 工业：提高生产效率，降低生产成本 环保：减少污染，降低能耗 医药：开发新药，提高药物疗效
翻译效率可以通过翻译起始、延伸和终止来调节
蛋白质稳定性可以通过蛋白质的降解和合成来调节
翻译水平调节在细胞内具有广泛的应用，如细胞分化、细胞周期和应激 反应等
转录后修饰：在 mRNA转录后进行 的修饰，如5'端加 帽、3'端加尾等
修饰类型：包括甲 基化、乙酰化、磷 酸化、泛素化等
பைடு நூலகம்
修饰作用：影响 mRNA的稳定性、 翻译效率和蛋白质 的活性
免疫球蛋白的合成调节实例： 抗体的产生、免疫应答等
基因克隆：通过 PCR技术将目标基 因克隆到载体中
基因表达分析：通 过RT-PCR、 Western blot等技 术分析基因表达情 况
蛋白质纯化：通过 亲和层析、离子交 换等技术纯化目标 蛋白质
酶生物合成的调节
第三节酶生物合成的调节一、原核生物细胞中酶生物合成的调节二、真核细胞中酶生物合成的调节知识点Review生物中心法则与酶生物合成的关系酶的调节控制转录水平的调控转录产物的加工翻译水平的调节翻译产物的加工调节酶降解的调节细胞内组成型酶和调节型酶组成型合成蛋白质适应型或调节型蛋白质1 组成型酶：(constitutive)每一个生物细胞都可以在一定的条件下，合成几千种酶：有的酶在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大，这类酶称为~例：DNA聚合酶、RNA聚合酶等。
2 调节型酶：酶在细胞中含量变化较大，即其合成速率明显受到环境因素影响,这类酶称为~例：半乳糖苷酶一、原核生物细胞中酶生物合成的调节•原核基因组的一个典型特征：绝大多数的基因都按照功能的相关性组成基因群首尾连接。
•原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节（transcriptional regulation）。
原核生物细胞转录水平的调节模式1.分解代谢物的阻遏作用2.酶生物合成的诱导作用3.酶生物合成的反馈阻遏作用分解代谢物阻遏作用是指某些物质(主要是指容易利用碳源)经过分解代谢产生的如解代谢物阻遏某些酶(主要是诱导酶)生物合成现象。
(一)分解代谢物的阻遏作用结果：cAMP-CAP复合物浓度随之降低，而启动基因上存在cAMP-CAP复合物的结合位点，这样在低浓度时，会影响到RNA聚合酶与启动子的结合。
酶的生物合成受到阻遏。
(二)酶生物合成的诱导作用Lactose operon操纵子（operon）•Jacob和Monod根据对lac Z,Y,A基因突变体的研究,于1961年提出了操纵子学说。
•其要点是:一个或几个结构基因与一个调节基因和一个操纵位点组成一个转录单元。
这个单元就称其为操纵子。
调节基因产生的阻遏蛋白与操纵位点结合从而阻碍了结构基因转录成为mRNA;而诱导物又可以与阻遏蛋白相结合从而阻止阻遏蛋白与操作子的结合。
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转录过程的特点
1、转录的不对称性
反义链 antisense strand（无意义链，负链） 有义链 coding strand（编码链，正链）
2、转录所需酶
转录过程
• 起始位点的识别 recognition • 转录起始 initiation • 链的延伸 elongation • 转录终止 termination • 转录后加工 modification
mRNA 30S-IF 3 mRNA复合物
IF1
30S起始复合物
fMet- tRNAF +IF2+GTP
fMet- tRNAF -IF2-GTP
70S核糖体
IF1、IF2、IF3 GDP+Pi
肽链的延伸
进 位
成肽 转 位
合成终止
高效率的蛋白 质合成体系
4、酶生物合成的调节 (regulation)
mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。
• Reverse translation 逆转录：以RNA为模板，在逆
转录酶的作用下，生成DNA的过程。
2、RNA的生物合成(转录)- Transcription
细胞内RNA的生物功能
(1) 在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。
(2) 在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。 tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子 上的密码子； mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控 制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序； rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白 质生物合成的场所。 (3) 某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下， 可以催化有关的生化反应。 (4) 各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。
操纵子
调节 基因 启动 操纵 基因 基因 结构 基因
…
R
P O S1 S2 … … DNA
mRNA 与阻遏蛋白结合
1.RNA聚合酶结合位点 2.cAMP及其受体蛋白复合物 （cAMP-CRP）结合位点
产生阻遏蛋白
• 诱导型操纵子
– 无诱导物——不表达或低表达、 – 有诱导物——转录成mRNA——合成酶
Reverse transcription
• Replication 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作
用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。
• Transcription 转录：以DNA为模板，按照碱基配对
原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA
链互补的RNA的过程。
• Translation 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将
Enzyme assembly, promoter recognition, activator binding
Possible catalytic subunits
Role unknown (not needed in vitro)
151 155 36.5 kDa 11 kDa
Promoter specificity
酶的类型
组成酶：DNA酶，RNA酶，糖酵解途 径的酶（与生长发育条件无关， 常进行定量合成的酶） 调节酶：适应酶，β-半乳糖苷酶（诱导 酶）
细胞内酶的调控模式 E
A
底物水平 的调节
酶水平 的调节
B 辅助因 子调节
酶活性的调节 酶含量的调节 酶的定位调节
X
产物调节
生长发育的不同时期 外界环境变化 酶合成与分解速度的变化（基因表达调控）
– 受气候环境影响 – 若培养细胞则工艺路线变复杂 – 产品含杂质较多，分离纯化较困难
适用范围
• 在动植物资源丰富的地区
• 从动物胰脏中提取各种胰蛋白酶，小肠中 提取碱性磷酸酶
二、生物合成法（发酵法）
• 利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的 生命活动而获得人们所需酶的技术。
依细胞 种类不同
微生物 植物细胞 动物细胞 发酵产酶 培养产酶 培养产酶
• 多数氨基酸拥有 2-4个密码
• tRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白 体。
蛋白质合成的几个要素- 转运RNA (transporter)
• tRNA有特异性，至少有20种以上。每种tRNA的反密码环 顶端均有由三个核苷酸组成的反密码，能与mRNA上相应 的密码互补结合。
酪
• 优点：
– 生产周期短 – 酶的产率较高 – 不受资源限制
• 缺点：对发酵设备和工艺条件要求较高
三、化学合成法
是一种新兴技术
• 局限性
– 单体底物要求纯度高 – 成本高昂 – 只能合成已经清楚化学结构的酶
化学合成法新进展
• 模拟酶
第一节 酶生物合成过程及调节
1、中心法则-Central Dogma
（1）操纵子学说 1960年Jacob和Monod提出的操纵子学说 调节基因(R)：产生阻遏蛋白 启动基因(P) 操纵子
1.RNA聚合酶结合位点 2.cAMP及其受体蛋白复合物 （cAMP-CRP）结合位点
操纵基因(O)：与阻遏蛋白结合
结构基因(S)：蛋白多肽链产物
• 操纵子学说
莫诺与雅可布最初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。这是一个十分巧妙 的自动控制系统，这个自动控制系统负责调控大肠杆菌的乳糖代谢。 乳糖可作为培养大肠杆菌的能源。大肠杆菌能产生一种酶（叫做“半乳 糖苷酶”），能够催化乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，以便作进一步的代谢利 用。编码半乳糖苷酶的基因（简称z）是一个结构基因。这个结构基因与操纵 基因共同组成操纵子。操纵基因受一种叫作阻遏蛋白的蛋白质的调控。当阻 遏蛋白结合到操纵基因之上时，乳糖会起诱导作用，它与阻遏蛋白结合，使 之从操纵基因上脱落下来。这时，操纵基因开启，相邻的结构基因也表现活 性，细菌就能分解并利用乳糖了，这样，乳糖便成了诱导半乳糖苷酶产生的 诱导物。 60年代中期，在操纵子中还发现了另一个开关基因，称为启动基因。启 动基因位于操纵基因之前，二者紧密相邻。启动基因由环腺苷酸（cAMP）启 动，而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。这样，葡萄糖便通过抑制环腺苷酸而间 接抑制启动基因，使结构基因失活，停止合成半乳糖苷酶。 由此可知，结构基因同时受两个开关基因——操纵基因与启动基因的调 控。只有当这两个开关都处于开启状态时，结构基因才能活化。当培养基中 同时存在葡萄糖和乳糖时，葡萄糖通过抑制环腺苷酸而间接抑制启动基因， 并进而抑制结构基因，使细菌不产生半乳糖苷酶。这种情况下，细菌便会自 动优先利用葡萄糖，因为葡萄糖果是比乳糖更好的能源。
模板DNA 局部变性
酶与模板结合
酶与启动子结合
DNA双螺旋部分解链
转录开始
σ因子释放
转录延伸
σ因子释放 核心酶移动
DNA双链解旋 核糖核苷酸互补 DNA双链重新缠绕
RNA链合成的终止
• RNA聚合酶到达终止密码子，RNA与酶从 DNA上脱离，RNA链合成终止
RNA前体的加工
剪切反应
剪接反应 末端连接反应 核苷修饰反应
蛋白质合成的几个要素-其他因子和酶
• 其他辅助因子
• 工具酶
蛋白质的合成过程
• 肽链合成的起始 initiation • 肽链合成的延伸 elongation • 肽链合成的终止与释放 termination and release • 合成多肽的输送和加工 transport and modification • 蛋白+ATP
氨酰tRNA合成酶
氨基酸活化生成 氨酰-tRNA
氨酰-tRNA+AMP+PPi
一般而言，原核生物的第一个氨 基酸是甲酰甲硫氨酸，起始tRNA 是fMet-tRNAF。 真核生物的第一个氨基酸是甲硫 氨酸，起始tRNA是MettRNAMET。
蛋白质合成起始
30 S亚基 +IF3
5’
酪氨酰- tRNA
5’
AUG GUU UAC ACA
反密码
3’ mRNA
密码(codon)与反密码(anticodon) 的碱基配对
蛋白质合成的几个要素-核糖体，ribosome
• 核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。 是存在于细胞质内的微小颗粒。
The ribosome composition of prokaryotic and eukaryotic cell
• 酶的发酵生产：经过预先设计，通过 人工操作，利用微生物的生命活动获 得所需的酶的技术过程。
细胞 培养 方式 不同
液体 深层 培养 发酵
固体 培养 发酵
固定化 细胞 发酵
固定 化原 生质体 发酵
1、固体培养发酵
• 培养基以麸皮、米糠等为主要原料，加入 其他必要的营养成分，制成固体或半固体 的曲麸，经过灭菌、冷却后，接种产酶微 生物菌株，在一定条件下进行发酵，以获 得所需的酶。
Chapter 3 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism
微生物发酵产酶
酶的生产：指通过各 种方法获得人们所需 的酶的技术过程
酶的生产方法
提取分离法 (Extraction)
生物合成法 (Biosynthesis)
化学合成法 (chemicalsynthesis)
是指容易利用的碳源 经过分解代谢产生的 物质阻遏某些酶（主 要是诱导酶）生物合 成的现象。
葡萄糖过 量降解
ATP ADP, AMP
cAMP ↓ + H2O
cAMP-CRP↓
磷酸二酯酶
AMP↓
启动基因上没有 cAMP-CRP结合
(32-90 kDa)
The E. coli RNA polymerase holoenzyme consists of six subunits: a2bb’ s.