蜘蛛丝蛋白聚吡咯复合纤维膜细胞相容性研究【开题报告】

毕业设计开题报告纺织工程蜘蛛丝蛋白/聚吡咯复合纤维膜细胞相容性研究一、选题的背景、意义组织工程材料是当前生命科学和材料科学共同的前沿研究热点之一。

目前已经开发应用于组织工程等生物医学领域的生物相容性高分子材料主要有胶原蛋白、聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等，但大多数这类材料的原创性研究工作属于国外。

我国是一个人口大国，因创伤和疾病造成的组织、器官丧失或功能障碍病例居世界各国之首，每年仅因烧伤需进行皮肤移植的患者就达百万之多。

因此，积极寻找合适的原料，研制具有我国自主知识产权的生物材料，对于减小我国组织工程支架等生物材料对国外的依赖性，培育新的高新技术产业和实现国民经济的可持续发展具有重要意义。

研究者一直在寻找具有良好的生物相容性的支架材料以应用于细胞培养中，以及研究支架材料在细胞培养中的各项性能指标以及实验环境对细胞培养的影响，了解细胞在支架材料上的生长情况，以便更好的应用在临床中[1]。

而导电支架细胞培养技术发展迅速，是近年来研究的热点。

本文主要选择蜘蛛丝蛋白和聚吡咯复合制得的支架材料，将细胞培养在带电的支架材料上，重点研究培养过程中支架材料的性质、电刺激的电流强度及电刺激的时间长短对细胞再生的影响。

二、相关研究的最新成果及动态2.1 蜘蛛丝蛋白的概况和研究现状2.1.1蜘蛛丝蛋白的概况蜘蛛丝的主要成份为蛋白质，如所有的蛋白质纤维一样，其组成长链蛋白质的单元为带不同侧链R的酰胺结构，同尼龙2结构相似[2]。

蜘蛛丝的氨基酸的摩尔分数和氨基酸的主链序列与天然聚肽如蚕丝、羊毛和人头发有很大的差异。

这种差异和组成取决于蜘蛛的种类、食物、气候及其它因素。

不同蜘蛛丝所含的氨基酸种类差异不大，为十七种左右，各种氨基酸的含量也因蜘蛛的种类不同而有一定的差异。

它们的共同点为具有小侧链的氨基酸如甘氨酸和丙氨酸的含量丰富，十字圆蛛和大腹圆蛛的这两者含量之和分别达到59.6％和53.2%与蚕丝的含量74.0％相比较就显得较低[3]。

蜘蛛丝是一种特殊的蛋白纤维，它具有很高的强度、弹性、柔韧性、伸长度和抗断裂功能，以及轻盈、较耐紫外线、生物可降解等优点，作为一种新兴的功能材料具有得天独厚的条件，是其他纤维材料无法比拟的，可以作为高性能的生物材料如人造肌腱、人工韧带、人工器官、组织修复等组织工程新材料，正逐步受到生物学、医学、材料科学等学科领域研究者的重视，具有十分诱人的应用前景。

2.1.2 蜘蛛丝蛋白的研究现状组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，材料在组织工程中起关键作用，成为组织工程研究的一个主流。

生物材料的研究经历了第一代惰性材料，第二代具有活性或具有降解性质的材料，现已发展到兼有可降解和生物活性的第三代生物材料[4]。

人们开始从生命科学的角度研究和设计生物材料，注重材料与细胞的相互作用，改变以往采用惰性材料的作法，将生物的某些功能引入材料。

丝蛋白纤维材料因具有良好的生物相容性、生物可降解性、细胞粘附活性和独特的机械特性，以及其本质是蛋白质的结构特点，使丝蛋白纤维(膜)在生物医学领域得以广泛的应用，成为在组织工程领域人们重新感兴趣的一类特殊的生物材料。

苏州大学的刘敏[5]等人对过对大腹园蛛主腺体内丝蛋白分子量和基酸组成的测定和分析，研究表明蜘蛛主腺体丝蛋白的氨基酸组成以甘氨酸、氨酸和谷氨酸为主，同时含有较多的脯氨酸和酪氨酸，与牵引丝的组成有一定差异；丝蛋白中甘氨酸、脯氨酸的含量比丝纤维中的含量更高，而丙氨酸的含则低于丝纤维，牵引丝纤维中丝氨酸的含量高于其在腺体内丝蛋白中的含量，且成丝后小侧链氨基酸含量增加，酸性氨基酸含量减少。

L0mbardi&Kap[6]的研究表明蛛丝纤维不溶于水、稀酸或稀碱、尿素和大多数有机溶剂，同时它们对大多数蛋白酶也具有相当强的抵抗力。

另外，Melloml等[18]的研究也表明蛛丝纤维能溶于高浓度的盐溶液如溴化锂、硫氰酸锂、氯化钙以及其他钙盐。

Min[7]等人将人体角化细胞和纤维原细胞种植在静电纺丝制得的蜘蛛丝纤维毡上，在实验室条件下培养了7天，用SEM观察纤维毡上的细胞形态，3天后发现细胞已经在丝素纤维表面黏附、繁殖，并开始通过纤维表面孔隙迁移，进入支架内部；与此同时，这些细胞与周围纤维相互融合，保持表型并按纤维的取向方向生长，形成一个三维的纳米纤维网状结构。

Jim[8]等人也对人骨髓干细胞在静电纺丝素纤维中的生长进行了研究，他们将细胞种植在由丝素和PEO共混后静电纺制备的纤维毡上，培养7天后，用SEM观察后发现，这种与细胞外基质结构相似的纳米纤维毡促进了细胞的黏附和增殖，有很好的生物相容性，可作为生物支架材料使用。

同时对蛛丝作为生物材料的研究报道较少，英文文献报道了用蛛丝包卵丝制备用于软骨生长的多孔3D支架[9]和用蛛丝弹性蛋白制备培养盘包被材料培养软骨细胞的研究[10]，此外Vollrath F等[11]利用哺乳动物伤口讨论天然蛛丝的组织相容性；而国内以蛛丝蛋白为材料制备组织工程材料除陈登龙关于RGD-重组蛛丝蛋白复合支架材料的研制[12]也未见相关报道。

2.2 聚吡咯2.2.1 聚吡咯的研究进展有吡咯黑之称的聚吡咯粉末早在1916年就已合成出来，1968年Dallolio用电化学方法制备出了聚吡咯，电导为8/cm，自Diaz等报道了含有1%乙腈溶液中制备出金属电导的、热稳定的聚吡咯以来[13]由于聚吡咯制备工艺相对简单，易于合成出各种各样的衍生物、共聚物和复合材料以得到较宽范围的电导率及其它特殊性能的材料，因此对聚吡咯的研究日益增多。

2.2.2 聚吡咯的生物相容性导电高分子的表面特性，如电荷密度和可润湿性等，可在电势存在下发生可逆性变化。

电荷密度和湿润性等表面特性，在蛋白吸收和细胞-底物相互作用中发挥着关键作用。

因此，PPy是组织工程中一种重要的备选材料。

而导电PPy制成的执行元件可在水溶液中工作，在生理环境具有应用前景。

吴坚等[ 14 ]用化学合成的PPy粉末提取液，进行了急性和亚急性毒性试验、热源实验、MTT、溶血实验、过敏实验、微核试验、皮肤刺激试验和眼结膜刺激试验，结果显示PPy是无毒、无致病原、不引起溶血和过敏、也无致突变和刺激作用的材料，具有良好的生物安全性。

2.2.3 聚吡咯在组织工程中的应用研究Guido in[15]等报告了有关聚吡咯膜在组织工程中的应用实验。

用编织聚酯制成小直径的管, 在上面用聚吡咯包被, 然后移植到小鼠的体内, 观察体内的反应以及血管上皮细胞在其上的增长情况。

磁共振研究和生物学研究显示, 电阻率较高的聚吡咯复合材料在整个移植过程中引发的组织反应最低, 这和它在体外试验结果一致。

Schmidt[16]以聚乳酸2羟基乙酸共聚物(PLGA )做支持物, 将较薄的聚吡咯植入老鼠体内,14 周后,PLGA已被降解, 聚吡咯没有变化, 没有负性组织增生和炎症的反应。

她又尝试将ECM 中的一种——透明质酸掺杂到聚吡咯中合成新的复合物[17] (聚吡咯-HA )。

这种复合物在体内起促进血管生成的作用。

聚吡咯-HA 在那些既能从电刺激中得到好处又需要增强血管生成作用的组织工程和伤愈应用中是很好的候选物。

聚吡咯是一种适合做组织生长支架的聚合物,可以用于刺激神经细胞、骨细胞再生、血管移值以及体外肝脏的培植等组织工程学领域。

聚吡咯用于伤愈再生和组织工程的优点是:(1)加电的区域定位准确；(2)聚吡咯便宜且易于合成, 通过加入不同的掺杂分子以及加电与否, 可以获得不同的表面特性, 使得在同一表面不同区域获得与细胞粘连和不粘连的表面格局成为可能。

从而在同一表面可获得清晰分界的不同生长阶段的细胞；(3) 基质类似物和生长因子可以偶联到聚吡咯载体上并依次释放, 给神经甚至骨的再生提供多种刺激。

2.3 支架材料研究现状及发展趋势2.3.1 支架材料在组织工程中的作用在组织工程中，种子细胞、可降解的支架材料以及细胞生长调节因子并称为组织工程的三大基本要素，构建组织工程化人体组织或器官涉及种子细胞在生物反应器中大规模培养、扩增，生物力学信号施加和化学信使(生长因子或细胞因子)的控制释放等关键技术。

其中，支架材料在组织工程研究中起中心作用，它不仅为特定的细胞提供结构支撑作用，而且还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构。

支架材料在组织工程中的具体作用主要如下[18]：(1)支架材料的结构和形貌控制再生组织的结构、尺寸和形貌，作为连接细胞和组织的框架，引导组织生长成特定形态；(2)作为信号分子的载体，将信号分子运送到缺损部位，并作为缓释体使诱导因子缓慢发挥作用，为工程化的组织提供一个赖以存在的空间，引导组织的再生和成长；(3)作为组织繁殖分化和新陈代谢的场所，为细胞生长输送营养、排除废物；(4)支架表面特殊位点与组织起特异性反应，对不同类型细胞起“身份鉴别”及选择粘附的作用；(5)起到机械支撑作用，可以抵抗外来的压力，并维持组织原有的形状和组织的完整性；(6)支架材料还可以作为活性因子的载体，用来承载一些生物活性物质，如生长因子，为细胞的生长、分化和增殖提供养分。

2.3.2 支架材料及发展生物材料的发展经历了以下3个阶段：(1)沿用通用高分子材料。

如涤纶Dacron用于血管移植物，醋酸纤维酯用做血液透析膜等，但此类材料存在生物相容性问题。

(2)应用生物医用高分子材料即生物相容性材料。

美国食品药品管理署(FDA)已批准聚乳酸(PLA)、聚乙醇酯(FGA)及其共聚物(PLGA)和医用聚氨酯p功等应用于医药装置。

(3)细胞特异性材料。

随着组织工程的发展，对相关生物材料提出新的挑战，除了生物安全性和生物相容性外，还希望植入的生物材料装置不为免疫系统排斥而且更能产生所期望的宿主响应：将生物材料推向第三阶段。

其研究和开发有赖于从细胞、分子乃至基因水平深入了解宿主．生物材料之间的相互作用。

正如1998年11月美国当代生物材料相关会议的共识：以往生物材料的研究和开发大多从材料的化学性质、物理性能及其加工方法方面构思，而未从细胞和分子水平进行生物材料设计[19]。

生物材料的研究对组织工程的研究是至关紧要的。

虽然许多生物材料都可介导细胞的生长，然而，由于体内的组织生长再生包括骨、神经、血管等的介导生长或角膜上皮细胞的生长等过程，这就要求细胞接受更多的特异性指令。

因此理想的组织工程支架材料必须能与细胞所表达的特异性粘附与生长因子受体相互作用，并能引导这些细胞迁移至受损部位且促进它们的生长和分化；此外，在组织修复的过程中，支架还必须能在细胞所分泌的基质重构酶的作用下逐渐降解[20]。

因此，随着组织工程研究的深入，对于支架用生物材料的要求也更高了。

为使组织工程支架用的生物材料具有生物功能化的特点，以及对生物信号作出反应，一般可通过在材料中引入细胞粘附肽段和蛋白酶来对材料进行仿生化设计，使之达到材料生物功能化的目的。