降解生物胺的酵母菌Millerozyma farinose及其在发酵食品中的应用的制作方法

本技术公开了粉状米勒氏酵母Millerozyma farinose在降解生物胺上的新用途，属于食品发酵技术领域。本技术公开的菌株能在20%氯化钠浓度下能降解组胺、酪胺、尸胺、腐胺等，最高能达到55.39%。本技术提供的菌株在发酵鱼露中也表现出良好的降胺能力，可明显降低鱼露生产过程中生物胺的含量，60天发酵降解效率最高可达57.13%，因此具有广泛的应用前景。

权利要求书

1.粉状米勒氏酵母（Millerozyma farinose）在降解生物胺上的应用。

2.粉状米勒氏酵母的培养方法，其特征在于，步骤为：将酵母菌按体积比2%的接种量接种至液体培养基，在28℃、160 r/min条件下培养48 h。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为：含盐YEPD培养基，其配方为蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠50g/L；含盐PDA培养基以及含盐麦芽汁培养基。

4.一种降解生物胺的方法，其特征在于，所述方法是按体积计，步骤为：

对粉状米勒氏酵母菌进行培养后，离心 (5000 r/min，10 min，4 ℃) 收集菌体，将菌体用无菌生理盐水（氯化钠 0.85％，w/v）制备成1.0×108CFU/mL的菌悬液，将该菌悬液按照体积比为2%的接种量加入含生物胺的食品中，对其中的生物胺进行降解。

5.一种降低发酵食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述方法是在发酵过程中接种权利要求1所述的酵母菌株。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵食品是鱼露、酱油、酱、虾酱、酒、食醋、果醋、发酵火腿、纳豆、豆腐乳、奶酪，以及发酵饲料。

技术说明书

降解生物胺的酵母菌Millerozyma farinose及其在发酵食品中的应用

技术领域

本技术涉及一株降解生物胺的酵母菌Millerozyma farinose及其应用，属于食品发酵技术领域。

背景技术

发酵食品是人们利用有益微生物加工制造的一类食品，通过微生物的作用，产生独特的风味和活性成分，科研人员经过对发酵食品的长期研究认为，现代人每天摄入一种或多种发酵食品可以维持健康，促进长寿。然而，目前很多发酵食品如奶酪、酱油、纳豆、鱼露等的生产还是采用传统的自然发酵技术，在此开放的发酵环境中，很容易发生外来微生物的污染，一旦被具有脱羧能力的微生物污染，这些食品含有的大量游离氨基酸就会脱羧生成生物胺。摄入过量生物胺会对人体产生毒害作用，主要会引起头痛，恶心，呼吸急促，心悸，血压过低，肠部痉挛等症状。人体内含有少量具有解毒作用的胺氧化酶，但是很多因素会使胺氧化酶减少，如疾病、遗传缺陷、服用DAO抑制剂药物以及饮酒，并且生物胺之间毒性具有协同效应。所以考虑到安全健康，应尽可能降低发酵食品中生物胺的含量。

目前，控制生物胺含量的方法主要是通过添加剂、控制卫生状况、辐照等来控制发酵食品生产过程中生物胺的产生。近年来选择具有降解生物胺能力的微生物作为发酵剂消除食品中已经生产了的生物胺是具有潜力的新方法。目前已报道的主要是从奶酪、腐乳以及发酵肉香肠中筛选具有降生物胺作用的菌株，但是目前筛选到具有降解生物胺作用的株菌种类少，效果不佳。因此，筛选具有高效降解生物胺菌株对于开展生物胺降解菌株的实际应用研究以及生

产健康安全的发酵食品具有重要的意义。

技术内容

本技术提供了一株具备较强生物胺降解能力的酵母菌，具体为粉状米勒氏酵母Millerozyma farinose。准确的说，本技术是提供了粉状米勒氏酵母Millerozymafarinose在降解生物胺上的新用途。

所述酵母菌从山东省青岛市灯塔调味公司的60天酱油酱醅中筛选分离得到，是一株对生物胺有较强降解能力菌株，经系统分类鉴定，为Millerozyma farinose。

所述酵母菌的培养方法，步骤为：将酵母菌按体积比2％的接种量接种至液体培养基，在28℃、160r/min条件下培养48h。

所述液体培养基为含盐YEPD培养基，其配方为：蛋白胨20g/L；酵母浸粉10g/L；葡萄糖

20g/L；氯化钠50g/L。

本技术提供的酵母菌Millerozyma farinose，本身不产生物胺，且可以降解已经产生了的生物胺。

本技术同时提供了一种利用所述酵母菌株进行发酵食品中生物胺的控制方法：对酵母菌进行培养后，离心(5000r/min，10min，4℃)收集菌体，将菌体用无菌生理盐水(氯化钠

0.85％，w/v)制备成1.0×108CFU/mL的菌悬液，将该菌悬液按照体积比为2％的接种量加入含生物胺的食品中，对其中的生物胺进行降解。

本技术的有益效果：

本技术首次发现并证实粉状米勒氏酵母Millerozyma farinose可以降解生物胺，并且其本身不产生物胺。即使在较高氯化钠情况下，Millerozyma farinose仍然对生物胺具有较高的降解率，表明能适用于较高渗透压的环境下的发酵和生物胺降解。

本技术公开的菌株能在20％氯化钠浓度下能降解组胺、酪胺、尸胺、腐胺，最高能达到55.39％。本技术提供的菌株在发酵鱼露中也表现出良好的降胺能力，可明显降低酱油生产过程中生物胺的含量，60天发酵降解效率最高可达57.13％，因此具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是生物胺液相色谱图；A中a-f依次为色胺，苯乙胺，腐胺，尸胺，组胺，酪胺，亚精胺和精胺；B和C分别为培养前和培养后测定生物胺液相色谱图。

具体实施方式

生物胺采用丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色谱法进行检测。

降解率(％)＝100％*(生物胺初始浓度—生物胺终浓度)/生物胺初始浓度。

实施例1：降胺酵母菌Millerozyma farinose的筛选鉴定

取发酵60天的发酵酱醅10g加入190mL无菌水中，混匀后梯度稀释，涂布于MYEPD(YEPD培养基+10％氯化钠+100mg/L混合生物胺)平板，28℃培养24h。挑选单菌落反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化单菌落，供下一步降解生物胺及鉴定用。

将菌株接种于液体YEPD培养基中，28℃，160rpm培养48h，使用Ezup柱式酵母基因组DNA 抽提试剂盒(上海生工)提取DNA。使用引物对NS1/NS6扩增26S rDNA，按照以下条件反应：94℃预变性4min后进入循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s,循环30次；72℃修复延伸10min，4℃终止反应。将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，目标条带使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行回收，回收产物送往上海生工公司进行DNA测序，将测序结果在NCBI上进行Blast对比，鉴定为Millerozyma farinose。

对保藏的Millerozyma farinose进行活化培养后，离心(5000r/min，10min，4℃)收集菌体，将菌体用无菌生理盐水(氯化钠0.85％，w/v)制备成1.0×108CFU/mL的菌悬液。以2％接种(按体积比)到50mL含氨基酸1％的含盐5％的YEPD液体培养基中，28℃、160r/min培养。检测培养