牛乳酪蛋白检测方法研究进展

牛乳酪蛋白检测方法研究进展

倪小琴，赖卫华*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌

330047）

摘 要：牛乳含有丰富的蛋白质，是比较理想的营养物质，但也是常见的过敏原之一。酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白，常作为牛乳过敏检测的主要参考指标之一。其检测方法主要包括基于免疫学的方法、聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction ，PCR ）、毛细管电泳分析、色谱法、质谱法等，本文就其检测方法的原理、特性及实际应用进行综述，并对未来检测的发展方向进行展望。关键词：酪蛋白；过敏原；检测方法

Research Progress in Methods for Detecting Cow ’s Milk Allergen Casein

NI Xiao-qin, LAI Wei-hua *

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang

330047, China)

Abstract: Cow ’s milk is rich in proteins, and an ideal nutritional substance, but it is also a common allergen in foods. Casein is the highest content of protein in milk, and is often used as a major index for detecting the allergenicity of cow ’s milk. The currently available detection methods include mainly immunological techniques, polymerase chain reaction (PCR), capillary electrophoresis, chromatography, and mass spectrometry. This article reviews the principles, characteristics and applications of these detection methods, and proposes future trends in the development of new detection methods.Key words: casein; allergen; detection methods

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）03-0290-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201403057

收稿日期：2012-12-07

作者简介：倪小琴（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品质量安全。E-mail ：xychun555@ *通信作者：赖卫华（1968—），男，教授，博士，研究方向为食品安全。E-mail ：talktolaiwh@

牛乳制品是一种营养丰富的蛋白制品，同时也是常见的八大过敏物质之一，其致敏性严重影响了婴幼儿的身体健康。根据修订后的2007/68/EC [1]，欧盟法规规定在食品的生产加工过程中，若原料或产品中的某种成分来自附件Annex Ⅲa 指定的过敏物质时，必须在食品标签上明确标出这些物质的成分。据调查[2]，在发达国家中，牛乳过敏占过敏事件的3%～7.5%，严重影响了婴幼儿的健康，部分甚至导致儿童死亡。而目前，对于食物过敏的最好最直接的办法是严格避免食用含过敏原的食物，但在食品的加工生产过程中，会掺杂着少量潜在的致敏物质，所以，人们亟需研究出能够快速检测食物中致敏物质的方法，达到预防的目的。

牛乳过敏原引起的过敏反应是一种由IgE 介导和非IgE 介导的超敏反应，可引起皮肤、肠胃道、呼吸系统的反应，严重时甚至会导致系统过敏反应或休克。牛乳蛋白常作为一种常见的食品添加剂，应用在食品生产的很多方面，这些残留的成分可能会引起致敏反应。本文通过总结归纳目前国内外常见的检测牛乳酪蛋白的方法，简述各种方法的原理及其应用，并对未来检测的发展方向进行展望。

1 检测酪蛋白的原理

牛乳中含有3%～3.5%的蛋白质，其中酪蛋白占总蛋白的80%[3]，是牛乳中最主要的过敏原之一。由于牛乳中酪蛋白含量较高，实验可通过检测酪蛋白的有无来判断食物中是否含有牛乳成分，以此作为过敏人群判断食品成分的一个依据。基于此，本文主要对目前应用在酪蛋白上的检测方法进行总结归纳。2 牛乳过敏原酪蛋白的检测技术2.1

基于免疫学的分析技术

基于免疫学原理建立的检测方法，是借助酶标记的抗体或抗原进行特异性结合的抗原抗体反应，并根据显色颜色的深浅来进行定量或定性的分析方法。根据标记物的显色物质的类型，将免疫类型可分为酶联免疫吸附技术、免疫荧光技术、火箭电泳免疫技术、时间分辨荧光免疫分析这四类。

在应用免疫学方法检测过敏物质时，考虑到酪蛋白

的种类较多，且有研究表明过敏患者中，存在着对酪蛋

白的各种成分过敏的人群，并且，发现人群中对β-、κ-酪蛋白过敏的同时也对α-酪蛋白过敏[4]，故在检测食品中是否含有过敏物质时，许多学者根据检测特定的不同的物质选用对应的抗体和检测原理，而在应用抗体方面，主要有两种来源：采用混合酪蛋白进行免疫制备的多克隆抗体和购买的针对某一种酪蛋白的单克隆抗体，本文在此基础上，总结归纳了各种实验方法。

2.1.1酶联免疫吸附技术（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是在建立在酶标记免疫的基础上，通过酶标记的抗体或抗原进行特异性结合，同时根据酶反应底物的显色颜色深浅来进行定量或定性分析的方法。目前，国内外ELISA检测的技术日益成熟，在过敏原检测方面的研究很多。ELISA的种类有很多，应用于食品过敏原检测的常见方法主要有双抗体夹心法和竞争法两类。邓小芳[5]通过免疫BALB/c小鼠建立双抗体夹心方法检测到酪蛋白的最低检出限为0.55 ng/mL，线性范围为0.78～100 ng/mL。王硕等[6]也通过建立双抗体夹心ELISA定量检测牛乳中酪蛋白方法，以免疫BALB/c小鼠制备的抗酪蛋白单克隆抗体包被，HRP标记抗酪蛋白的多抗，标准曲线在6～1666 ng/mL范围内线性良好，R2=0.9949，测得最低检出限为7 ng/mL。在此基础上，宋宏新等[7]以鸡卵黄抗体为多克隆抗体包被酶标板，封闭后，加入等量酶标抗原和待测物进行竞争反应，建立的竞争ELISA最低检出量为5.1 μg/mL，变异系数小于5%。除此之外，也有学者采用间接ELISA来检测。Atrick等[8]结合了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、蛋白质印迹、免疫染色方法和间接ELISA多种方法来检测白葡萄酒中是否存在酪蛋白物质，结果表明在不同的检测样品中，均可以检测到酪蛋白的存在，其估计的检测量在0.9 mg/L左右，甚至更低。同时，张涛等[9]通过制得的兔抗牛α

s

-酪蛋白的多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗，

以牛α

s

-酪蛋白包被抗原间接ELISA检测方法，检测的线性范围是25～1200 ng/mL，相关系数是0.9825，回收率在91.97%～115.61%之间，从而可计算出牛乳中酪蛋白的含量。近年来，市场上已有多种商品化的过敏原检测ELISA 试剂盒销售，如Tepnel、R-Biopharm、ELISA Systems等，这些试剂盒可在短时间内实现过敏原的定性和半定量检测。李妮等[10]通过对多种品牌的酪蛋白残留试剂盒进行对比实验，得出ELISA Systems试剂盒对检测食品中的酪蛋白成分特异性高，并与其他几种过敏食品均无交叉反应，试剂盒体现出了较高的精密度（变异系数＜5%）和准确度，定性检测限小于1.56 mg/L，定量范围为0.244～1.926 mg/L。

ELISA法灵敏性高、特异性强、快速、费用低，因而在过敏原检测中得到了广泛的应用，特别适用于食物中少量过敏原检测，但这种方法也有其局限性，检测的蛋白在食品加工处理过程中可能会发生变化，导致ELISA法假阴性的出现。故对于ELISA法，学者需要进一步的考虑食品加工处理过程中过敏原性质的变化，克服其对检测结果产生的不良影响。

2.1.2 免疫荧光法

免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，结合物在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光，根据荧光的强弱，来进行定量分析的方法。这种方法的特异性强、灵敏度高、速度快，主要缺点是非特异性染色问题会导致结果判定的客观性不足，且技术程序比较复杂。应用荧光标记的方法，Young等[11]从小鼠腺体内提取酪蛋白进行检测，通过标记免疫荧光素来检测标记的抗体来检测酪蛋白，结果表明荧光标记的方法特异性很强，对今后酪蛋白检测方法的发展具有一定的参考价值。

2.1.3 火箭电泳免疫技术（roket immunoele-ctrophoresis，RIE）

以半固态透明的琼脂凝胶为支持介质，使置于孔中的抗原和抗体相向扩散，两者相遇后，在浓度比例适当处结合成复合物形成沉淀峰，根据形成的峰行高度来判断抗原量的多少。Moen等[12]将RIE和ELISA两种方法进行了比较，选取了市场上的13种样品，分别用ELISA试剂盒和RIE进行检测，前者只能检测到酪蛋白在3种产品中的含量，而后者却检测到了每种产品中的酪蛋白含量，对比说明RIE的检测灵敏度比ELISA高，能检测到含量低的过敏原产品，从而提高了食品的准确性和扩大其应用范围。

在实际操作中，RIE制胶和染色过程操作过程复杂，稳定性不好，故需要进一步提高其准确性。

2.1.4 时间分辨荧光免疫分析（time resolved fluoroisn-munoassay，TRFIA）

TRFIA是一种非同位素免疫分析技术，用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数，进行信号分辨，由于镧系元素发射荧光效应时间长，可通过延迟检测时间而将标本或环境中的非特异荧光扣除，极大地提高了分析灵敏度。Sletten等[13]用TRFIA、Indirect TRFI、ELISA 3种不同的方法去检测不同食品中的酪蛋白的含量，对比发现三者都能在1～1.5mg/kg范围内做定量的检测，其中，TRFIA和i-TRFIA（60～68 ng/mL）的检测结果相近，敏感度和特异性比ELISA（30～38 ng/mL）低，为进一步找到与ELISA互补的方法提供了借鉴。

应用此方法具有检测范围宽、对标记物分子生物活