牛乳酪蛋白检测方法研究进展
实验二 牛乳中酪蛋白的分离
实验二牛乳中酪蛋白的分离一、实验目的掌握从牛乳中分离酪蛋白的原理，学会操作方法。
二、实验原理牛乳中含有多种蛋白质，它们有着不同的性质，在脱脂牛乳的蛋白质中酪蛋白约占80%，酪蛋白是一类含磷蛋白质的复杂混合物。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调到4.7（酪蛋白的等电点）时，酪蛋白就沉淀析出。
再用乙醇和乙醚洗涤沉淀，除去脂类杂质，便可制得纯酪蛋白。
三、实验器材1、实验仪器恒温水浴、普通离心机、精密pH试纸或酸度计、布氏漏斗、抽滤瓶、表面皿、离心管（80 mL）、量筒、烧杯（100 mL）、玻棒、电子天平。
2、实验材料新鲜牛乳3、试剂1）95%乙醇2）乙醚3）0.2 mol/L醋酸溶液先分别配制A 液和B 液：A 液（0.2 mol / L 醋酸钠溶液）称取分析纯醋酸钠（NaAc·3H2O）27.22 g溶于蒸馏水中，定容至1 000 mL。
B 液（0.2 mol / L 醋酸溶液）称取分析纯冰醋酸（含量大于99.8%）12.0 g溶于蒸馏水中，定容至1000 mL。
取A液885 mL和B液615 mL混合，即得pH 4.7 的醋酸－醋酸钠缓冲液1 500 mL。
四、实验步骤1、取10 mL鲜牛乳，置100 mL烧杯中，加热至40 ℃。
在搅拌下慢慢加入预热至40 ℃、pH 4.7的醋酸–醋酸钠缓冲溶液10 mL。
2、转移至离心管中，在4000 r / min下离心10 min，弃上清，所得沉淀为酪蛋白的粗制品。
3、用20 mL蒸馏水洗涤沉淀，将沉淀搅起，再次离心后弃上清。
4、向沉淀中加入10 mL 95%乙醇，把沉淀充分搅起至成悬浊液，将其转移到布氏漏斗中抽滤，先用10 mL 95%乙醇洗涤，再用10 mL乙醚洗涤，最后抽干制得酪蛋白。
5、将酪蛋白白色粉末摊在表面皿上风干，于电子天平称重，五、实验结果计算得率（牛乳中酪蛋白理论含量为3.5 g/100 mL）。
六、注意事项1、向牛乳中加入缓冲液时要缓慢，并充分搅拌。
实验室制备牛奶酪蛋白的技术研究
Ｔｅ ｈｎ ｌ ｇ ｆＥｘ ｒ ｃｉ ｇ Ｃａ ｅ ｎ ｆ ｏ Ｍ ｉｋ ｉ ｂ ｒ ｔ ｒ ｃ ｏ ｏ ｙ ｏ ｔ ａ ｔｎ ｓ ｉ ｒ ｍ ｌ ｎ Ｌａ ｏ ａ ｏ ｙ
下 进 行 酪 蛋 白凝 聚 ； 心 排 除 乳 清 ， 速 为 ３０ ０ｒ ｎ 时 间 为 １ 离 转 ０ ｍｉ， ／ ５ｍｉ ， 水 洗 涤 后 ５ ｎ 经 ０℃条 件 下 烘 干 ３ 用 石 油 醚 作 ． ｈ， ５
为有机溶 剂进行 抽提 ， 最终得 到 纯度 为 ９ ％左 右的 酪蛋 白制 品 。 ５
酪蛋 白是 哺乳 动物 包括母 牛 、羊 和人 乳汁 中的主要 蛋 白质 。纯净 酪蛋 白为非 结 晶 、 非吸潮 性物 质 ， 温下 在水 中 常 可 溶解 ０８ １ ％， 溶 于 ２ ．％～ ． 微 ２ ５℃的水 和 有 机溶 剂 ， 于 稀 溶 碱 和浓酸 中 ． 能吸收 水分 ． 入水 中则 迅速 膨 胀 ， 电点 ｐ 浸 等 Ｈ 值 为 ４６ 酪蛋 白在 牛乳 中 占蛋 白质 总量 的 ８ ％～ ２ 酪蛋 ．。 ０ ８ ％， 白在全 乳 中含量 通常在 ２ ～ ９ｇＬ之 间…。乳 中酪蛋 白大 部 ４ ２ ／
பைடு நூலகம்
好。 无乳 房 炎 、 消化 道疾 病等 。
合 理 的从 牛奶 中 提取 分 离 酪蛋 白的试 验 方 案 并 付诸 实 践 。 让 学 生利 用 所 掌握 的理 论 知识 和 实 验技 能 去 分 析 问题 、 解 决 问题 ， 养学 生 的创 新 思维 和综合 素质 。 培
酪蛋白的提取与测定
牛乳中酪蛋白的制备与浓度测定一、实验目的1、学习从牛乳中分离酪蛋白的原理和方法2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理，熟悉紫外分光光度计的使用4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度二、实验原理1、准备酪蛋白原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。
牛乳在PH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称为乳清蛋白。
酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。
乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水和能力很强，分散性高，在乳中呈高分子状态。
本法利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
2、紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理：大多数蛋白质由于有酷氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。
但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm，通过测定在280nm和260nm时A的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。
3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理：考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。
在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。
三、实验器材与试剂1、制备酪蛋白：烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、95%乙醇、无水乙醚2、紫外光吸收法：紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿0.9%NaCl、1mol/LNaOH溶液、1mol/L乙酸溶液3、考马斯亮蓝法：紫外可见光分光光度计、试管1.5cm×15cm(×9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白（0.1mg/ml）、考马斯亮蓝、0.9%NaCl四、实验步骤制备酪蛋白1、将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃2、将20mL牛奶加热至40℃，在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3、用精密pH试纸调pH至4.7，可见溶液变为乳白色悬浮液4、待悬浮液冷却至室温，4000rpm离心5min，弃上清，得酪蛋白粗制品5、用蒸馏水洗沉淀3次，3000rpm离心5min，弃上清6、在沉淀中加入20mL95％乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤7、用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次（10ml/次），最后用乙醚洗涤沉淀2次（10ml/次），抽干8、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品9、准确称量，计算含量和得率紫外光吸收法1．取待测样品溶液置于的石英比色皿中，于分光光度计波长280nm和260nm，分别读取A280nm和A260nm，用生理盐水为比色空白对照。
牛乳中β-酪蛋白基因分型及β-酪啡肽-7的研究进展
Recentadvancesofβ-caseingenotypinginbovinemilkandpotentialimpact ofβ-casomorphin-7onhumanhealth
， ， ， ， ， CHENLong1,3 FUWangyan2 FANGQiongyan1,3 TANGGuo1,3 LIULun1,3 XIANGSongtao1,3
： KeywordsA2Milk;β-casein;Geneticvariation;β-casomorphin-7(BCM-7);Humanhealth
0引 言
牛乳营养丰富，食用便利，富含优质的蛋白质、碳 水化合物、脂肪、维生素和微量元素，牛乳中的蛋白质 含有人体所需的全部必需氨基酸，消化率可达 ～ 98% 100%，因此被认为是自然界最接近完美的食品。乳蛋 白是牛乳中最主要和最有营养价值的成分，其含量约 占牛乳的 3.0%～3.6%，主要以酪蛋白和乳清蛋白为 主蛋，白还、有β-少酪量蛋的白酶、κ类-。酪酪蛋蛋白白、γ是-酪由蛋αs1 白-酪等蛋多白种、蛋αs 白2-酪质 组成的混合物，总含量约占乳蛋白的 80%。β-酪蛋白
： AbstractBovinemilkisrichinnutritionandmilkproteinisthemostnutritiousingredientinmilk.β-caseinaccountsforabout30%ofto
talmilkprotein,A1andA2arethetwomostcommontypesofβ-casein,ofwhichtypeA1ismutant.β-caseingenepolymorphism iscon trolledbycodominantautosomalgene,whichcouldbedetectedbyproteinlevelormolecularlevel.TypeA1β-caseinonenzymaticdiges tionproducesvariousspecificaminoacidresiduefragmentsinbody,ofwhichβ-casomorphin-7(BCM-7)isaheptapeptidewithopioidac tivityandspeculatedtobecloselyrelatedtotheoccurrenceofchronicnon-communicablediseases,suchastype1diabetesmellitus,cardio vasculardiseases,autism,schizophreniaanddigestivedisorders.Thisarticlereviewsthegeneticvariationandtypingmethodsofβ-casein,gen erationmechanism ofBCM-7anditspotentialimpactonhumanhealth,whichwillprovidesomedirectionsandrecommendationsforfu tureresearchofβ-caseinandA2milkindairyindustry.
牛乳酪蛋白基因多态性研究进展
牛乳酪蛋白基因多态性研究进展赵烜影，刘振民，雍靖怡，穆海菠，李 楠*（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436）摘 要：牛乳被称为“白色血液”，是最理想的天然食品之一，富含蛋白质、乳脂、钙、维生素和人体必需的8 种氨基酸，也被称为“接近完美的食品”。
但我国的牛乳多用于液态乳的加工，其营养价值未得到充分利用。
酪蛋白基因多态性被认为会影响乳产量、乳的理化特性和营养成分、乳制品加工特性以及营养价值，因此得到学者们的重视。
本文对现有研究中关于酪蛋白基因多态性及其检测方法和应用进行归纳总结，为奶牛的定向选育、改善牛乳品质、精准开发功能性乳制品提供一定参考。
关键词：酪蛋白；多态性；检测方法；加工特性；人体健康Progress in the Study of Bovine Milk Casein Gene PolymorphismZHAO Xuanying, LIU Zhenmin, YONG Jingyi, MU Haibo, LI Nan *(Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology, State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Dairy Research Institute, Bright Dairy and Food Co. Ltd., Shanghai 200436, China)Abstract: Bovine milk is known as the “white blood” and is one of the most ideal natural foods, rich in protein, milk fat, calcium, vitamins and the eight essential amino acids, also known as a near-perfect food. However, in China, cow ’s milk is mostly used for liquid milk processing, and its nutritional value has not been fully utilized. Casein gene polymorphisms are thought to affect milk yield, physicochemical properties and nutritional composition, dairy product manufacturing performance and nutrition, and hence have received much attention from scholars. In this paper, we summarize the existing studies on casein gene polymorphism, the methods used for its detection, and its application, hoping to provide some reference for the targeted breeding of dairy cows, the improvement of milk quality, and the precise development of functional dairy products.Keywords: casein; polymorphism; detection methods; processing performance; human health DOI:10.15922/ki.jdst.2021.01.009中图分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1671-5187（2021）01-0044-07引文格式：赵烜影, 刘振民, 雍靖怡, 等. 牛乳酪蛋白基因多态性研究进展[J]. 乳业科学与技术, 2021, 44(1): 44-50. DOI:10.15922/ki.jdst.2021.01.009. ZHAO Xuanying, LIU Zhenmin, YONG Jingyi, et al. Progress in the study of bovine milk casein gene polymorphism[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2021, 44(1): 44-50. DOI:10.15922/ki.jdst.2021.01.009. 收稿日期：2020-10-26基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2018YFC1604205）；上海乳业生物工程技术研究中心项目（19DZ2281400）第一作者简介：赵烜影（1993—）（ORCID: 0000-0002-0478-2455），女，硕士，研究方向为乳品营养与加工。
211026294_乳制品中A1_β-酪蛋白、A2_β-酪蛋白检测方法研究进展
Quality Control乳制品中A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白检测方法研究进展袁兆丰，杨秀梅，王 丹，王青云*，车佳玲北大荒完达山乳业股份有限公司，黑龙江哈尔滨 150000摘 要：随着消费者对A2 β-酪蛋白的关注度提升，A2 β-酪蛋白相关产品不断更新换代。
A2 β-酪蛋白常用检测方法有反相高效液相色谱法（RP-HPLC）、液相色谱－高分辨串联质谱法、毛细管区带电泳法、试剂盒检测法等。
本文对β-酪蛋白遗传变体A1 β-酪蛋白和原始形态A2 β-酪蛋白的功能特点、检测方法、定量分析进行综述，说明检测方法的原理和试剂药品的作用机理，加强对A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白检测方法的改进与优化，为A2 β-酪蛋白应用于功能性食品、婴幼儿配方食品提供理论依据。
关键词：A1 β-酪蛋白；A2 β-酪蛋白；反相高效液相色谱法；液相色谱－高分辨串联质谱法；毛细管区带电泳法；快速试剂盒检测法文章编号：1671-4393（2023）03-0080-05 DOI:10.12377/1671-4393.23.03.150 引言随着消费者对牛奶中A2β-酪蛋白的关注度和需求量不断增加，对牛奶中A2β-酪蛋白的检测方法也日渐出新。
各检测方法出现的时间不同，其原理也受制于当时的检测仪器、试剂耗材和理论认识。
随着检测仪器行业的快速发展，新检测方法随之产生。
目前现有的检测方法有反相高效液相色谱法（RP-HPLC）、液相色谱－高分辨串联质谱法、毛细管区带电泳法、试剂盒检测法等。
通过对现有的检测方法进行分析，掌握其中的原理，有利于优化现有检测方法，同时也为开发新的检测方法做理论支持。
1 β-酪蛋白酪蛋白和乳铁蛋白是组成牛乳中蛋白质的主要成分。
酪蛋白是牛奶中含量最丰富的蛋白质，生物基金项目：黑龙江省“百千万”工程科技重大专项-超高端有机A2系列乳制品研制开发及产业化示范（2021ZX12B01）作者简介：袁兆丰（1982-），男，黑龙江哈尔滨人，硕士，工程师，研究方向为乳制品检验；杨秀梅（1975-），女，黑龙江铁力人，本科，食品高级工程师，研究方向为乳制品检验；王 丹（1983-），女，黑龙江宁安人，硕士，高级畜牧师，研究方向为乳制品研发；车佳玲（1996-），女，黑龙江海伦人，硕士，研究方向为乳制品研发。
牛乳中蛋白质的提取与鉴定
离心机、分光光度计、电泳仪、恒温水浴锅、天 平、烧杯、容量瓶
实验步骤与操作
1. 牛乳样品处理
将新鲜牛乳过滤去除杂质，冷藏 备用。
2. 硫酸铵沉淀
向牛乳样品中加入硫酸铵粉末， 搅拌均匀后静置，待蛋白质沉淀
。
3. 离心分离
将沉淀后的溶液在离心机中离心 ，分离出上清液和沉淀物。
6. 蛋白质纯度鉴定
通过电泳和分光光度计等方法检 测蛋白质纯度。
02
随着人们对食品营养和安全的要 求不断提高，对牛乳中蛋白质的 提取和鉴定技术也提出了更高的 要求。
研究目的与意义
研究目的
本研究旨在探究牛乳中蛋白质的提取与鉴定方法，以提高牛 乳中蛋白质的提取率和纯度，为牛乳资源的进一步利用提供 技术支持。
研究意义
通过本研究，可以更好地了解牛乳中蛋白质的组成和性质， 为牛乳的营养价值和功能特性提供科学依据。同时，本研究 也有助于推动牛乳产业的可持续发展，提高牛乳产品的质量 和附加值。
功能性食品
利用牛乳蛋白质的功能特 性，开发具有特定功能的 食品，如低脂食品、高纤 维食品等。
03 牛乳中蛋白质的提取方法
酸提取法
总结词
利用酸性条件溶解蛋白质，适用于蛋白质含量较高的原料。
详细描述
在酸性条件下，牛乳中的蛋白质会溶解，形成乳清蛋白，通过离心或过滤可分 离出沉淀的蛋白质。该方法简单易行，但可能会影响蛋白质的生物活性。
微流控技术
利用微流控芯片进行蛋白质的分离、纯化和鉴定，具有高效、快速、 低成本等优点。
人工智能与机器学习
应用于蛋白质鉴定和数据分析，提高蛋白质鉴定的准确性和可靠性。
提高蛋白质提取与鉴定效率的方法
优化实验条件
通过调整实验参数，如pH值、离子强度、温度等，提高蛋白质的 提取和鉴定效率。
牛乳蛋白提取实验报告
一、实验目的1. 学习从牛乳中提取蛋白质的基本原理和方法。
2. 掌握等电点沉淀法提取蛋白质的操作步骤。
3. 了解蛋白质的检测方法及其原理。
二、实验原理牛乳是一种复杂的胶体溶液，其中含有多种蛋白质。
蛋白质是两性化合物，其溶解度受溶液pH值的影响。
当溶液pH值达到蛋白质的等电点时，蛋白质所带正、负电荷相等，呈电中性，此时蛋白质的溶解度最低，会以沉淀形式从溶液中析出。
本实验采用等电点沉淀法提取牛乳蛋白。
三、实验材料与仪器1. 材料：新鲜牛乳、醋酸、NaOH、乙醇、乙醚、蒸馏水、精密pH试纸或酸度计、离心机、烧杯、漏斗、滤纸等。
2. 试剂：95%乙醇、无水乙醚、0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液等。
四、实验步骤1. 牛乳预处理：取50mL新鲜牛乳于150mL烧杯中，用热水浴加热至40℃，维持此温度，边搅拌边加入稀醋酸溶液约2mL，观察现象。
2. 沉淀形成：继续搅拌并使悬浊液冷却至室温，然后将混合物转入离心杯中，于3000r/min离心15min。
3. 沉淀分离：离心完毕后，取上清液于另一烧杯中，沉淀用蒸馏水洗涤两次。
4. 沉淀纯化：将沉淀转移到布氏漏斗中，用95%乙醇和乙醚混合液清洗沉淀2次，最后用乙醚清洗沉淀2次。
5. 沉淀干燥：将清洗后的沉淀抽干，风干后得到牛乳蛋白。
五、实验现象1. 牛乳预处理过程中，随着醋酸溶液的加入，溶液逐渐变浑浊，出现白色沉淀。
2. 离心过程中，沉淀逐渐下沉，上清液变得清澈。
3. 沉淀洗涤过程中，沉淀颜色逐渐变浅，洗涤液变得浑浊。
4. 沉淀干燥后，得到白色粉末，为牛乳蛋白。
六、实验结果与分析1. 牛乳蛋白的提取：通过等电点沉淀法，成功从牛乳中提取出蛋白质。
实验过程中，观察到白色沉淀的形成和沉淀的分离，说明蛋白质已从牛乳中提取出来。
2. 沉淀纯化：通过洗涤和干燥等操作，进一步纯化了牛乳蛋白。
实验过程中，观察到沉淀颜色逐渐变浅，洗涤液变得浑浊，说明杂质已被去除。
3. 蛋白质检测：实验中可选用双缩脲反应、茚三酮反应等方法检测提取的牛乳蛋白。
牛乳酪蛋白检测方法研究进展
牛乳酪蛋白检测方法研究进展倪小琴，赖卫华*（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌330047）摘 要：牛乳含有丰富的蛋白质，是比较理想的营养物质，但也是常见的过敏原之一。
酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白，常作为牛乳过敏检测的主要参考指标之一。
其检测方法主要包括基于免疫学的方法、聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction ，PCR ）、毛细管电泳分析、色谱法、质谱法等，本文就其检测方法的原理、特性及实际应用进行综述，并对未来检测的发展方向进行展望。
关键词：酪蛋白；过敏原；检测方法Research Progress in Methods for Detecting Cow ’s Milk Allergen CaseinNI Xiao-qin, LAI Wei-hua *(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang330047, China)Abstract: Cow ’s milk is rich in proteins, and an ideal nutritional substance, but it is also a common allergen in foods. Casein is the highest content of protein in milk, and is often used as a major index for detecting the allergenicity of cow ’s milk. The currently available detection methods include mainly immunological techniques, polymerase chain reaction (PCR), capillary electrophoresis, chromatography, and mass spectrometry. This article reviews the principles, characteristics and applications of these detection methods, and proposes future trends in the development of new detection methods.Key words: casein; allergen; detection methods中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）03-0290-05doi:10.7506/spkx1002-6630-201403057收稿日期：2012-12-07作者简介：倪小琴（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品质量安全。
荧光微球免疫层析法定量检测牛乳中酪蛋白
*通讯作者: 赖卫华, 教授, 主要研究方向为食品安全。E-mail: talktolaiwh@ *Corresponding author: LAI Wei-Hua, Professor, State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, No.235, Nanjing East Road, Nanchang 330047, China. E-mail: talktolaiwh@
Fluorescent microsphere-based lateral flow assay for the quantitative detection of casein in milk
YANG Ya-Jie1, NI Xiao-Qin1, WANG Qian2, YOU Qiong2, ZHANG Fu-Sheng2, LAI Wei-Hua1*
ABSTRACT: Objective To develop a fluorescent microsphere-based lateral flow assay for the quantitative detection of casein in milk. Methods Casein was used as the antigen to immunize the New Zealand rabbits to make the corresponding polyclonal antibody against the antigen, and EDC mediated method was used to couple the purified polyclonal antibody with fluorescent microspheres. The filter pad, sample pad, conjugate pad, NC membrane, and absorption pad were assembled to develop the fluorescent microsphere-based lateral flow assay for the quantitative detection of casein in milk. Results The results could be obtained within 25 min without sophisticated equipment, and the limit of detection of the test strip was 100 ng/mL. The developed assay was highly specific to the casein protein as a result of that it had no cross-reactivity with other non-target proteins, such as BSA and OVA. The recovery rates of the intra-assay at casein concentrations of 100.0, 500.0, and 1000.0 ng/mL were (89.03±5.2)%, (93.47±6.9)% and (91.2±7.8)%, respectively, while the inter-assay were (87.69±6.2)%, (92.73±8.3)% and (89.82±8.5)%, respectively. Conclusion The fluorescent microsphere-based lateral flow assay for the quantitative detection of casein in milk with the advantages of rapid, convenient, and high sensitivity was established preliminarily. KEY WORDS: casein; lateral flow assay; fluorescent microspheres; quantitative detection
牛乳中酪蛋白及制品的研究与应用
牛乳中酪蛋白及制品的研究与应用摘要：酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质，占牛奶中蛋白质总量的80%，是一种全价蛋白。
本文就酪蛋白及制品的研究现状、功能特性、应用进行了阐述。
关键词：酪蛋白及制品研究现状功能特性应用Research and Application on Casein and Its Products of Milk Abstract：Casein is a main protein in milk，make up 80% in total protein. It is a kind of full-price protein. The paper elaborated research status，functional characteristic and application of casein and its products.Key words：casein and its products，research status，functional characteristic，application.酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质，含量约为2.6 g/100 ml，占牛奶中蛋白质总量的80%，分子量约75，000～375，000。
酪蛋白主要有四种类型:αs- 酪蛋白、β- 酪蛋白、k - 酪蛋白、γ- 酪蛋白。
酪蛋白在牛乳中以酪蛋白酸钙·磷酸钙复合体形式存在于乳中，呈胶体状，等电点为pH4.6。
鲜乳加酸(调pH4.5) 或凝乳酶可使酪蛋白沉淀而分离出来[ 1 ]。
酪蛋白是一种全价蛋白，含有人体必需的8种氨基酸，极易消化吸收，是优质氨基酸供给源，成为婴幼儿及幼畜的主要蛋白源。
目前酪蛋白及制品主要用于造纸工业、皮革工业、乳酸工业、国防工业、塑料、油漆、化妆品、中草药分析、水果保鲜、医药、营养保健品等行业中。
1 酪蛋白及制品的研究现状1.1酪蛋白的研究酪蛋白（casein）作为产品被称着干酪素，是一种白色或微黄色，无臭味的颗粒状物质，难溶于水，但易溶于碱溶液，强酸溶液，碳酸盐溶液，工业用干酪素在10 %四硼酸钠溶液中完全溶解。
乳制品中酪蛋白百分含量检测方法的研究
乳制品中酪蛋白百分含量检测方法的研究摘要我国乳品工业正处于快速发展阶段，当乳及乳制品中的组分被掺入的其它非乳成分替代时，就被称作乳品掺假。
为了保护公众和保证乳制品免受掺杂使假的危害，就需要一个切实可行的乳品掺假检验方法。
酪蛋白是牛乳中的特征性组分，乳蛋白质中的酪蛋白含量（被称作酪蛋白百分含量）（g/g 蛋白质）一般会稳定在77%～78%（w/w），因此，酪蛋白定量检验可以作为乳品掺假检验的最有效方法。
探讨了国内外酪蛋白定量检测方法的研究现状，分析结果表明，等电点沉淀法无疑是一种适合我国国情的、操作简单的酪蛋白检验方法，对防治乳品掺假具有重要的现实意义。
关键词：乳制品；掺假；酪蛋白；等电点沉淀法；检验Study on Quantitative Determination of Casein as a Method forTesting of Dairy ProductsABSTRACTDairy industry is developing rapidly in China. However, some milk and dairy products are having a specified ingredient substituted by a nonspecified ingredient,thus they are considered adulterated. To protect the public and ensure that dairy products are not adulterated, it is in good demand for a reliable and practical method to test the adulteration of dairy products.It is well known that casein is a characteristic component of milk. The amount of casin in milk proteins is always within the range of 77-78% (w/w). Therefore, quantitative determination of casein, which is expressed as the percentage of casein （g/g protein）,can be an effective method for the adulteration testing of milk and milk products.The research status of the quantitative testing methods of casein at home and abroad was discussed. The results showed that isoelectric precipitation was a reliable method for casein testing fitting to chinese status and having a simple operation which have important realism significance for preventing adulteration in milk and milk products. Through analysis the study contents about this testing method had been put forward.KEY WORDS: dairy; adulteration; casein; isoelectric precipitation; testing目录摘要 (I)ABSTRACT (II)目录 (III)1 前言 (1)1.1 乳制品中各组分的概述 (1)1.2 乳及乳制品掺假鉴定已成为困扰我国乳品工业发展的一个突出问题 (1)1.3 酪蛋白是牛乳中的特征性成分可以有效鉴定乳及乳制品是否掺假 (2)1.4 明胶是最常见的水溶性蛋白质替代品 (5)1.5 酪蛋白定量检测方法的研究现状 (6)1.6 等电点沉淀法检测酪蛋白百分含量的试验方法是最方便的 (9)2 实验材料与方法 (10)2.1 实验器材 (10)2.1.1 实验材料 (10)2.1.2 试验试剂 (10)2.1.3 试验仪器 (10)2.2 试验内容及方法 (11)2.2.1 要检测的内容 (11)2.2.2 实验条件的确定 (11)2.2.3 试验方法的确定 (12)2.2.4 检测步骤 (13)2.2.5主要操作步骤说明 (13)3 实验结果与讨论 ........................................ 错误！未定义书签。
牛乳中酪蛋白的制备实验报告
牛乳中酪蛋白的制备实验报告实验目的：掌握牛乳中酪蛋白的制备方法。
实验原理：牛乳中含有丰富的酪蛋白，可以通过调节pH值和添加酸性物质来使酪蛋白凝聚并沉淀。
实验器材与试剂：1. 牛乳2. 醋酸或柠檬汁3. pH试纸4. 试管或锥形瓶5. 酒精灯或电热板6. 离心机或漏斗和滤纸7. pH调节剂实验步骤：1. 取适量的牛乳倒入试管或锥形瓶中。
2. 添加少量的pH调节剂（醋酸或柠檬汁），同时观察试管中的液体颜色变化。
3. 使用pH试纸检测试管中的pH值，确保其达到需要的酸性条件。
4. 将试管（或锥形瓶）置于酒精灯或电热板上加热，加热至牛乳开始沸腾。
5. 烧热约5分钟后，关闭酒精灯或电热板，待试管中的液体冷却至室温。
6. 可选择使用离心机进行离心，或者使用漏斗和滤纸将液体过滤，得到沉淀。
7. 将沉淀储存在干燥的容器中，即可得到制备好的酪蛋白。
实验结果与分析：根据实验操作可以得到一定量的酪蛋白沉淀。
如果沉淀量较少，可能是因为pH值的调节不当或加热时间过短导致酪蛋白无法充分凝聚。
实验注意事项：1. 操作过程中要注意使用酒精灯或电热板时的安全问题，避免发生火灾或烫伤。
2. 操作时要注意保持试管或锥形瓶的干净，以避免其他杂质对实验结果的影响。
3. 在添加pH调节剂时应慎重，防止pH值过低或过高的情况发生。
4. 在离心或过滤沉淀时，要注意避免将沉淀溅出或损坏滤纸。
实验总结：通过本实验，我们成功地制备了牛乳中的酪蛋白。
实验的成功与否与调节pH值的准确性和加热时间的充分性有关。
这个实验方法可以用于其他酪蛋白的制备和分离过程中。
牛αS1-酪蛋白基因研究新进展
（ Ａ ｈ ｎ ｉｅａ． ０ １ ｌ Ｗ ＮＧ Ｚ ａ —ｌ ｔ１２ １ ）１ 计 算 机 辅 助 ， ＿ 钉用 方 法研 究 了牛奶 酪蛋 白血管 紧张素 转化 酶 （ Ｅ） ＡＣ 活
性 抑 制 肽 ， 然 发现 了 一 个 Ｉ Ｓ 偶 Ｃ Ｏ值 为 ２ ． ５ Ｏ ８ ｍｏ ｌ Ｌ 有 效抑 制活 性肽段 （ １ ， 肽包含 一个 单 一 序列 Ｐ ）此 Ｌ ｓ Ｖａ— ｅ－ｌ —Ｌ ｕ Ａｌ， 是 一 种 新 的 具有 降 ｙ— ｌＬ ｕ ｉ ｅ— ａ这 ｅ
产 的乳 蛋 白量存 在差 异 。
（ ｈａ ｅｅＬ，ｔｌ ０ ９ ［ 采 用 免 疫 电 泳 技 术 、 Ｃ ｉｎ ｓ ｅａ ２ ０ ）５ １
色谱 技术 和质 谱 分 析 相 结 合 的 方 法 ， 究 了意 大 利 研 南部 地 中海水 牛 酪蛋 白遗 传 多态 性 ， ａ １ 酪 蛋 白 与 ｓ一 变体 Ａ 相 比发 现 了一种 新 的 ａ ｌ ｓ一酪蛋 白变体 Ｂ， 这
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血管 紧张 素转 化酶 （ Ｅ） Ａｃ 其主要 作用 是 将血 管 紧张素 Ｉ（Ａｎ ）转 换 为血 管 紧 张 素 Ⅱ， ｇＩ 而后 者 是
一
种强 烈 的血 管 收缩物 质 ， 而使 得 血压 升 高 ； 从 而血
中图 分 类 号 ： ８ ３ ２ ￥ ２ ． 文献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ０ １ ９ １ （ ０ １ ０ —０ ３０ １ ０ — １ １ ２ １ ） ５０ ４ — ３
酪 蛋 白是 牛乳 中 主要 蛋 白质 ， 占乳 蛋 白含 量 约
实验二 牛乳中酪蛋白的分离
实验二牛乳中酪蛋白的分离一、实验目的掌握从牛乳中分离酪蛋白的原理，学会操作方法。
二、实验原理牛乳中含有多种蛋白质，它们有着不同的性质，在脱脂牛乳的蛋白质中酪蛋白约占80%，酪蛋白是一类含磷蛋白质的复杂混合物。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调到4.7（酪蛋白的等电点）时，酪蛋白就沉淀析出。
再用乙醇和乙醚洗涤沉淀，除去脂类杂质，便可制得纯酪蛋白。
三、实验器材1、实验仪器恒温水浴、普通离心机、精密pH试纸或酸度计、布氏漏斗、抽滤瓶、表面皿、离心管（80 mL）、量筒、烧杯（100 mL）、玻棒、电子天平。
2、实验材料新鲜牛乳3、试剂1）95%乙醇2）乙醚3）0.2 mol/L醋酸溶液先分别配制A 液和B 液：A 液（0.2 mol / L 醋酸钠溶液）称取分析纯醋酸钠（NaAc·3H2O）27.22 g溶于蒸馏水中，定容至1 000 mL。
B 液（0.2 mol / L 醋酸溶液）称取分析纯冰醋酸（含量大于99.8%）12.0 g溶于蒸馏水中，定容至1000 mL。
取A液885 mL和B液615 mL混合，即得pH 4.7 的醋酸－醋酸钠缓冲液1 500 mL。
四、实验步骤1、取10 mL鲜牛乳，置100 mL烧杯中，加热至40 ℃。
在搅拌下慢慢加入预热至40 ℃、pH 4.7的醋酸–醋酸钠缓冲溶液10 mL。
2、转移至离心管中，在4000 r / min下离心10 min，弃上清，所得沉淀为酪蛋白的粗制品。
3、用20 mL蒸馏水洗涤沉淀，将沉淀搅起，再次离心后弃上清。
4、向沉淀中加入10 mL 95%乙醇，把沉淀充分搅起至成悬浊液，将其转移到布氏漏斗中抽滤，先用10 mL 95%乙醇洗涤，再用10 mL乙醚洗涤，最后抽干制得酪蛋白。
5、将酪蛋白白色粉末摊在表面皿上风干，于电子天平称重，五、实验结果计算得率（牛乳中酪蛋白理论含量为3.5 g/100 mL）。
六、注意事项1、向牛乳中加入缓冲液时要缓慢，并充分搅拌。
牛乳中酪蛋白的提取以及鉴定
摘 要：本实验通过提取纯化 3 种市售牛奶中的酪蛋白，并对所提取的酪蛋白进行 SDS-PAGE 鉴定。实验结 果显示：所提取的酪蛋白平均浓度为 2.02 mg/mL，蛋白的分子量为 28 kD。
关键词：牛乳；酪蛋白；SDS-PAGE
Abstract：Casein is the main allergen in milk. In this study, casein was extracted and purified from three commercially available milks, and the extracted casein was identified by SDS-PAGE gel electrophoresis. The experimental results showed that the average concentration of casein extracted was 2.02 mg/mL, and the molecular weight of the protein was 28 kD.
[4]WAISARAYUTT C，SUROJANAMETAKUL V，KAEWPRADUB
S，et al. Investigation on the understanding
and implementation of food allergen management
（下转第 129 页）
126 / 现代食品 XIANDAISHIPIN
XIANDAISHIPIN 现代食品 /125
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分析检测 Analysis and Testing
留样电泳分析。将样品置于透析袋透析 36 h 后，取出 进行冷冻干燥。
酪蛋白检测方法的分析与研究
分析检测T logy科技酪蛋白检测方法的分析与研究分析与研究GB31638-2016酪蛋白的检测方法，以降低检测成本和缩短检测时间，提高工作效率。
方法：对膜分离酪蛋白的检测方法进行了探讨，依据对具体检测步骤的剖析，溶解样品采用旋涡振荡仪、器皿选择50 mL锥形瓶和直径为9 cm滤纸过滤沉淀等方法操作节约成本和提高检测效率。
结果：改变溶解样品采用手摇操作方式、选择合适器皿及滤纸等，此法涉及药品种类少，检测效率高，对于检测收集沉淀量较小的样品，有较高的优势。
结论：此法操作便捷，工作效率高，精密度好，在实际的检测工作中，可以辅助使用。
酪蛋白[1]是一种含有磷钙的结合蛋白，对酸敏感，pH值较低时会沉淀，这种蛋白质主要存在哺乳动物中，是哺乳动物的主要蛋白质，可以降低蛋白质的降解率以及氨基酸的氧化率，从而加大蛋白质的身体吸收和利用率。
酪蛋白对幼儿既是氨基酸的来源，也是钙和磷的来源，酪蛋白在胃中形成凝乳以便消化。
因此市场中也有很多酪蛋白产品，比如酪蛋白磷酸钛、酪蛋白钙都是以酪蛋白为主要成分的营养品[2]，对人体的营养效果也是非常的好。
不仅如此，鉴于这种缓释特性，酪蛋白还会让你有持续的饱腹感，这样就是为什么健身减肥的人食用酪蛋白后减肥效果更加明显。
酪蛋白是以乳和/或乳制品为原料,经酸法或酶法或膜分离工艺制得的产品[3]，它是由α、β、κ和r及其亚型组成的混合物,对酸敏感，pH值较低时会沉淀。
以乳及乳制品为原料，经脱脂、膜分离酪蛋白，再经浓缩、杀菌、干燥等工艺制得的产品即为膜分离酪蛋白[4]。
本文主要对膜分离酪蛋白的测定方法进行研究。
由于每位实验操作者的理解认知不同，在进行GB31638-2016酪蛋白测定时，检测者无法快速检测酪蛋白。
基于此，笔者综述实验过程中的问题，探讨更为方便的检测新方法。
通过对膜分离酪蛋白的具体检测步骤的分析，溶解样品采用旋涡振荡仪和直径为9cm滤纸过滤沉淀等方法操作节约时间，提高检测效率。
实验三 牛乳中酪蛋白的制备与鉴定
2
二、实验原理
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电 点为4.8。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛 乳的pH调至4.8时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗 涤沉淀物，乙醚除去脂类杂质后便可得到纯的酪 蛋白。
二、实验原理
两分子尿素加热Leabharlann 180℃左右时，生成双缩脲6
四、实验步骤
1、酪蛋白的制备： （1）量取10mL牛奶置于25mL刻度试管中，水浴中加 热至40℃。在搅拌下慢慢加入10mL预热至40℃的乙酸-乙 酸钠缓冲液（pH4.6）。用精密试纸调pH值至4.8（可选择 1%氢氧化钠或10%乙酸溶液进行调整）。40℃保温10min， 使沉淀完全。 （ 2）将上述悬浮液冷却至室温。 2000r/min离心 5min ，
（6）准确称重，计算牛乳中酪蛋白含量（g/100mL）, 并与理论含量为3.5g/100mL牛乳相比较，求出实际得率。
8
四、实验步骤
2、酪蛋白的溶解度鉴定： 取6支试管，分别加入蒸馏水、10%氯化钠、0.5%碳 酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化钙各 1mL。于每管中加入少量酪蛋白，不断摇荡，观察并记录
弃去上清液。
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四、实验步骤
1、酪蛋白的制备： （ 3 ）往沉淀物中加入 5mL 蒸馏水，混匀后 2000r/min 离心5min， 弃去上清液。 （ 4 ） 将 洗 净 的 沉 淀 物 加 入 3mL 无 水 乙 醇 ， 混 匀 后
2000r/min离心5min， 弃去上清液，得酪蛋白粗制品。
（ 5 ）将沉淀物全部摊开在已称过重的滤纸上，置于 25℃烘箱中烘干。
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五、实验结果、计算与分析
1、酪蛋白含量（g/mL）=酪蛋白g/10mL ×100%
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牛乳酪蛋白检测方法研究进展倪小琴，赖卫华*（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌330047）摘 要：牛乳含有丰富的蛋白质，是比较理想的营养物质，但也是常见的过敏原之一。
酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白，常作为牛乳过敏检测的主要参考指标之一。
其检测方法主要包括基于免疫学的方法、聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction ，PCR ）、毛细管电泳分析、色谱法、质谱法等，本文就其检测方法的原理、特性及实际应用进行综述，并对未来检测的发展方向进行展望。
关键词：酪蛋白；过敏原；检测方法Research Progress in Methods for Detecting Cow ’s Milk Allergen CaseinNI Xiao-qin, LAI Wei-hua *(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang330047, China)Abstract: Cow ’s milk is rich in proteins, and an ideal nutritional substance, but it is also a common allergen in foods. Casein is the highest content of protein in milk, and is often used as a major index for detecting the allergenicity of cow ’s milk. The currently available detection methods include mainly immunological techniques, polymerase chain reaction (PCR), capillary electrophoresis, chromatography, and mass spectrometry. This article reviews the principles, characteristics and applications of these detection methods, and proposes future trends in the development of new detection methods.Key words: casein; allergen; detection methods中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）03-0290-05doi:10.7506/spkx1002-6630-201403057收稿日期：2012-12-07作者简介：倪小琴（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品质量安全。
E-mail ：xychun555@ *通信作者：赖卫华（1968—），男，教授，博士，研究方向为食品安全。
E-mail ：talktolaiwh@牛乳制品是一种营养丰富的蛋白制品，同时也是常见的八大过敏物质之一，其致敏性严重影响了婴幼儿的身体健康。
根据修订后的2007/68/EC [1]，欧盟法规规定在食品的生产加工过程中，若原料或产品中的某种成分来自附件Annex Ⅲa 指定的过敏物质时，必须在食品标签上明确标出这些物质的成分。
据调查[2]，在发达国家中，牛乳过敏占过敏事件的3%～7.5%，严重影响了婴幼儿的健康，部分甚至导致儿童死亡。
而目前，对于食物过敏的最好最直接的办法是严格避免食用含过敏原的食物，但在食品的加工生产过程中，会掺杂着少量潜在的致敏物质，所以，人们亟需研究出能够快速检测食物中致敏物质的方法，达到预防的目的。
牛乳过敏原引起的过敏反应是一种由IgE 介导和非IgE 介导的超敏反应，可引起皮肤、肠胃道、呼吸系统的反应，严重时甚至会导致系统过敏反应或休克。
牛乳蛋白常作为一种常见的食品添加剂，应用在食品生产的很多方面，这些残留的成分可能会引起致敏反应。
本文通过总结归纳目前国内外常见的检测牛乳酪蛋白的方法，简述各种方法的原理及其应用，并对未来检测的发展方向进行展望。
1 检测酪蛋白的原理牛乳中含有3%～3.5%的蛋白质，其中酪蛋白占总蛋白的80%[3]，是牛乳中最主要的过敏原之一。
由于牛乳中酪蛋白含量较高，实验可通过检测酪蛋白的有无来判断食物中是否含有牛乳成分，以此作为过敏人群判断食品成分的一个依据。
基于此，本文主要对目前应用在酪蛋白上的检测方法进行总结归纳。
2 牛乳过敏原酪蛋白的检测技术2.1基于免疫学的分析技术基于免疫学原理建立的检测方法，是借助酶标记的抗体或抗原进行特异性结合的抗原抗体反应，并根据显色颜色的深浅来进行定量或定性的分析方法。
根据标记物的显色物质的类型，将免疫类型可分为酶联免疫吸附技术、免疫荧光技术、火箭电泳免疫技术、时间分辨荧光免疫分析这四类。
在应用免疫学方法检测过敏物质时，考虑到酪蛋白的种类较多，且有研究表明过敏患者中，存在着对酪蛋白的各种成分过敏的人群，并且，发现人群中对β-、κ-酪蛋白过敏的同时也对α-酪蛋白过敏[4]，故在检测食品中是否含有过敏物质时，许多学者根据检测特定的不同的物质选用对应的抗体和检测原理，而在应用抗体方面，主要有两种来源：采用混合酪蛋白进行免疫制备的多克隆抗体和购买的针对某一种酪蛋白的单克隆抗体，本文在此基础上，总结归纳了各种实验方法。
2.1.1酶联免疫吸附技术（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）ELISA是在建立在酶标记免疫的基础上，通过酶标记的抗体或抗原进行特异性结合，同时根据酶反应底物的显色颜色深浅来进行定量或定性分析的方法。
目前，国内外ELISA检测的技术日益成熟，在过敏原检测方面的研究很多。
ELISA的种类有很多，应用于食品过敏原检测的常见方法主要有双抗体夹心法和竞争法两类。
邓小芳[5]通过免疫BALB/c小鼠建立双抗体夹心方法检测到酪蛋白的最低检出限为0.55 ng/mL，线性范围为0.78～100 ng/mL。
王硕等[6]也通过建立双抗体夹心ELISA定量检测牛乳中酪蛋白方法，以免疫BALB/c小鼠制备的抗酪蛋白单克隆抗体包被，HRP标记抗酪蛋白的多抗，标准曲线在6～1666 ng/mL范围内线性良好，R2=0.9949，测得最低检出限为7 ng/mL。
在此基础上，宋宏新等[7]以鸡卵黄抗体为多克隆抗体包被酶标板，封闭后，加入等量酶标抗原和待测物进行竞争反应，建立的竞争ELISA最低检出量为5.1 μg/mL，变异系数小于5%。
除此之外，也有学者采用间接ELISA来检测。
Atrick等[8]结合了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、蛋白质印迹、免疫染色方法和间接ELISA多种方法来检测白葡萄酒中是否存在酪蛋白物质，结果表明在不同的检测样品中，均可以检测到酪蛋白的存在，其估计的检测量在0.9 mg/L左右，甚至更低。
同时，张涛等[9]通过制得的兔抗牛αs-酪蛋白的多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗，以牛αs-酪蛋白包被抗原间接ELISA检测方法，检测的线性范围是25～1200 ng/mL，相关系数是0.9825，回收率在91.97%～115.61%之间，从而可计算出牛乳中酪蛋白的含量。
近年来，市场上已有多种商品化的过敏原检测ELISA 试剂盒销售，如Tepnel、R-Biopharm、ELISA Systems等，这些试剂盒可在短时间内实现过敏原的定性和半定量检测。
李妮等[10]通过对多种品牌的酪蛋白残留试剂盒进行对比实验，得出ELISA Systems试剂盒对检测食品中的酪蛋白成分特异性高，并与其他几种过敏食品均无交叉反应，试剂盒体现出了较高的精密度（变异系数＜5%）和准确度，定性检测限小于1.56 mg/L，定量范围为0.244～1.926 mg/L。
ELISA法灵敏性高、特异性强、快速、费用低，因而在过敏原检测中得到了广泛的应用，特别适用于食物中少量过敏原检测，但这种方法也有其局限性，检测的蛋白在食品加工处理过程中可能会发生变化，导致ELISA法假阴性的出现。
故对于ELISA法，学者需要进一步的考虑食品加工处理过程中过敏原性质的变化，克服其对检测结果产生的不良影响。
2.1.2 免疫荧光法免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，结合物在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光，根据荧光的强弱，来进行定量分析的方法。
这种方法的特异性强、灵敏度高、速度快，主要缺点是非特异性染色问题会导致结果判定的客观性不足，且技术程序比较复杂。
应用荧光标记的方法，Young等[11]从小鼠腺体内提取酪蛋白进行检测，通过标记免疫荧光素来检测标记的抗体来检测酪蛋白，结果表明荧光标记的方法特异性很强，对今后酪蛋白检测方法的发展具有一定的参考价值。
2.1.3 火箭电泳免疫技术（roket immunoele-ctrophoresis，RIE）以半固态透明的琼脂凝胶为支持介质，使置于孔中的抗原和抗体相向扩散，两者相遇后，在浓度比例适当处结合成复合物形成沉淀峰，根据形成的峰行高度来判断抗原量的多少。
Moen等[12]将RIE和ELISA两种方法进行了比较，选取了市场上的13种样品，分别用ELISA试剂盒和RIE进行检测，前者只能检测到酪蛋白在3种产品中的含量，而后者却检测到了每种产品中的酪蛋白含量，对比说明RIE的检测灵敏度比ELISA高，能检测到含量低的过敏原产品，从而提高了食品的准确性和扩大其应用范围。
在实际操作中，RIE制胶和染色过程操作过程复杂，稳定性不好，故需要进一步提高其准确性。
2.1.4 时间分辨荧光免疫分析（time resolved fluoroisn-munoassay，TRFIA）TRFIA是一种非同位素免疫分析技术，用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数，进行信号分辨，由于镧系元素发射荧光效应时间长，可通过延迟检测时间而将标本或环境中的非特异荧光扣除，极大地提高了分析灵敏度。
Sletten等[13]用TRFIA、Indirect TRFI、ELISA 3种不同的方法去检测不同食品中的酪蛋白的含量，对比发现三者都能在1～1.5mg/kg范围内做定量的检测，其中，TRFIA和i-TRFIA（60～68 ng/mL）的检测结果相近，敏感度和特异性比ELISA（30～38 ng/mL）低，为进一步找到与ELISA互补的方法提供了借鉴。