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通常10分钟以上不显粉红色的大豆饼粕其脲酶 活性丧失。
PH增值法（续）
操作方法
准确称取0.400g样品2份，分别置于两支比色管中，一只比 色管中加入20ml磷酸缓冲液，作为空白试验（A管），另一 只比色管中加入20ml尿素缓冲液（B管）。盖塞混匀，在 30℃恒温水浴中准确保持30min。在此期间，每隔5min摇 匀一次。取出后立即加入饱和氯化汞溶液2～3滴，在冷水中 冷却，5min内测定溶液的PH值。
大豆中脲酶活性测定
为什么要测定脲酶？
脲酶毒性
一般脲酶并没有毒性作用，但在一定温度和pH值条件下，生 大豆的脲酶遇水迅速将含氮化合物分解成氨，引起氨中毒。 大豆中的抗营养因子：胰蛋白酶抑制剂最重要
评估胰蛋白酶抑制剂活性
大豆饼粕中胰蛋白酶抑制剂抑制动物的生长和引起胰腺肥大。 而直接测定大豆饼粕中的胰蛋白酶抑制剂的活性比较困难、 耗时。脲酶和胰蛋白酶抑制剂在加热时有相近的速率变性， 并且脲酶对热的抵抗力比胰蛋白酶抑制剂强，又易于测定， 所以常用脲酶活性指标来判断大豆饼粕加热的程度和估计大 豆饼粕中胰蛋白酶抑制剂是否已经被破坏。
生产实践中人们常将脲酶活性和蛋白质溶解度结合起来评价
大豆饼粕的品质，用脲酶活性反映大豆饼粕是否过生，用蛋 白质溶解度反映大豆饼粕是否受热过度。
适宜的脲酶活性值
大多数美国的测定表明：为破坏抗营养物质尿 酶值应在0.20或以下。美国饲料工业协会建议 的尿酶值为0.05-0.20。反刍家畜的日粮中往 往加有尿素，因而过高的尿酶值有可能导致氨 中毒。因此，在美国，反刍动物饲养者对豆粕 尿酶值的要求是≤0.20。在欧洲则认为0.5是 可接受的尿酶值（Deschrifver，1977）。
PH增值法
原理
用样品溶液PH值与试剂空白的PH值差计算尿素酶的活性。
仪器与器皿
PH计、恒温水浴、比色管
试剂
磷酸缓冲液：取3.403g磷酸二氢钾溶于100ml水中，取 4.335g磷酸氢二钾溶于100ml水中，合并上述两种溶液 并配制成1000ml，用酸溶液或碱溶液调至PH＝7。
尿素缓冲液：取15g尿素，溶于500ml磷酸缓冲液中，调 解pH＝7。为了防止霉菌滋生，可以加入5ml甲苯作为防 腐剂。
计算
溶液PH值（A）与试剂空白pH（B）值差为尿素酶活性，计 算如下：
尿素酶活性＝B－A
PH增值法（续）
注意事项：
应提前一天浸泡电极，保持电极清洁。 有时样品中的可溶性物质附着在电极上，
可以降低测定准确度，操作时要快速果 断。
滴定法
原理
将粉碎的大豆与中性尿素缓冲液混合， 在30±0.5℃保持30min，尿素酶催化 尿素水解产生氨，用过量盐酸中和氨， 再用氢氧化钠标准溶液回滴。酶的活性 用1g分析材料在30±0.5℃下1分钟产生 的氨态氮的毫克数来表示。
我国《饲料用大豆》标准（GB1038489）规定：“饲料用大豆需加热后使用， 尿素酶活性不得超过0.4”。台湾省标准为
0.02～0.3△pH 。
脲酶的测定方法
比色法 滴定法 PH增值法 快速检测法
比色法
实验原理
向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓冲液的分析悬 浮液中加入尿酸溶液，在30℃下保温5min， 加入磷钨酸终止酶作用并沉淀蛋白质。产生的 氨在次溴酸钠和麝香草酚作用下形成蓝色的靛 麝香草酚，借以比色。
滴定法（续）
仪器与器皿 pH计 恒温水浴 比色管 10ml移液管
滴定法（续）
试剂
尿素：分析纯 尿素缓冲液：4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并
稀释至1000ml，再将30g尿素溶于此缓冲液中。 0.1mol/l盐酸 0.1mol/l氢氧化钠标准溶液
标定方法：取基准邻苯二甲酸氢钾0.6g，溶于50ml水中，加 热至沸，加入2～3滴酚酞指示剂，用配制的氢氧化钠标准溶液 滴定至呈粉红色30s不退色为终点。以下列公式计算浓度：
M＝m/(V×0.2042) 式中：m：邻苯二甲酸氢钾质量，g；
V：消耗氢氧化钠体积，ml。
滴定法（续）百度文库
操作方法
称取0.2000g试样，转入比色管中，加入10ml尿素缓冲液， 立即盖好盖子并剧烈摇动。置于30±0.5℃恒温水浴上准确保 持30min后立即加入10ml0.1mol/l盐酸，迅速冷却到20℃， 将比色管内容物全部转入烧杯，用水冲洗比色管2～3次，立 即用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。
滴定法
结果计算
14×C（V0－V） 尿素酶活性＝
30×m C——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L； V0——空白试验消耗氢氧化钠的体积， ml； V——测定试验消耗的氢氧化钠的体 积，ml； m——试验质量，g。
快速测定方法
酚红法
称取0.2克的样品于试管中，加入0.2克的尿 素，再加入2滴酚红指示剂及20ml蒸馏水，摇动10 分钟，观察溶液的颜色。 1分钟内呈粉红色，脲酶活性很强； 1-5分钟呈粉红色，脲酶活性强； 5-15分钟呈粉红色，活性有点强； 15-30无色，没有活性。
尿素酶活性与抗胰蛋白酶之间关系，Wright(1981)
脲酶活性测定的局限性
局限性
尿酶活性没有负值，它对任何过熟豆粕的最低值为零；对于 加热过度的豆粕尿酶测定值不是一个可靠的指标 。
解决办法：
利用蛋白质溶解度去评价。原理是：加热使游离氨基酸与其 它化合物的基团形成不能为消化酶所打开的分子间和分子内 的结合键，因而降低了蛋白质的溶解度 。一般要求蛋白质溶 解度（0.2%KOH溶液）应在70%～85%之间。PS＞85% 时，表示加热不足，PS＜70%时则表示加热过度
另取比色管做空白试验，加入10ml尿素缓冲液，10ml0.1 mol/l盐酸。称取与上述试样量相当的试样，迅速加入比色管中，
立即盖好比色管并剧烈摇动，在30±0.5℃恒温水浴上准确保 持30min，冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用 水冲洗比色管2～3次，用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。
PH增值法（续）
操作方法
准确称取0.400g样品2份，分别置于两支比色管中，一只比 色管中加入20ml磷酸缓冲液，作为空白试验（A管），另一 只比色管中加入20ml尿素缓冲液（B管）。盖塞混匀，在 30℃恒温水浴中准确保持30min。在此期间，每隔5min摇 匀一次。取出后立即加入饱和氯化汞溶液2～3滴，在冷水中 冷却，5min内测定溶液的PH值。
大豆中脲酶活性测定
为什么要测定脲酶？
脲酶毒性
一般脲酶并没有毒性作用，但在一定温度和pH值条件下，生 大豆的脲酶遇水迅速将含氮化合物分解成氨，引起氨中毒。 大豆中的抗营养因子：胰蛋白酶抑制剂最重要
评估胰蛋白酶抑制剂活性
大豆饼粕中胰蛋白酶抑制剂抑制动物的生长和引起胰腺肥大。 而直接测定大豆饼粕中的胰蛋白酶抑制剂的活性比较困难、 耗时。脲酶和胰蛋白酶抑制剂在加热时有相近的速率变性， 并且脲酶对热的抵抗力比胰蛋白酶抑制剂强，又易于测定， 所以常用脲酶活性指标来判断大豆饼粕加热的程度和估计大 豆饼粕中胰蛋白酶抑制剂是否已经被破坏。
生产实践中人们常将脲酶活性和蛋白质溶解度结合起来评价
大豆饼粕的品质，用脲酶活性反映大豆饼粕是否过生，用蛋 白质溶解度反映大豆饼粕是否受热过度。
适宜的脲酶活性值
大多数美国的测定表明：为破坏抗营养物质尿 酶值应在0.20或以下。美国饲料工业协会建议 的尿酶值为0.05-0.20。反刍家畜的日粮中往 往加有尿素，因而过高的尿酶值有可能导致氨 中毒。因此，在美国，反刍动物饲养者对豆粕 尿酶值的要求是≤0.20。在欧洲则认为0.5是 可接受的尿酶值（Deschrifver，1977）。
PH增值法
原理
用样品溶液PH值与试剂空白的PH值差计算尿素酶的活性。
仪器与器皿
PH计、恒温水浴、比色管
试剂
磷酸缓冲液：取3.403g磷酸二氢钾溶于100ml水中，取 4.335g磷酸氢二钾溶于100ml水中，合并上述两种溶液 并配制成1000ml，用酸溶液或碱溶液调至PH＝7。
尿素缓冲液：取15g尿素，溶于500ml磷酸缓冲液中，调 解pH＝7。为了防止霉菌滋生，可以加入5ml甲苯作为防 腐剂。
计算
溶液PH值（A）与试剂空白pH（B）值差为尿素酶活性，计 算如下：
尿素酶活性＝B－A
PH增值法（续）
注意事项：
应提前一天浸泡电极，保持电极清洁。 有时样品中的可溶性物质附着在电极上，
可以降低测定准确度，操作时要快速果 断。
滴定法
原理
将粉碎的大豆与中性尿素缓冲液混合， 在30±0.5℃保持30min，尿素酶催化 尿素水解产生氨，用过量盐酸中和氨， 再用氢氧化钠标准溶液回滴。酶的活性 用1g分析材料在30±0.5℃下1分钟产生 的氨态氮的毫克数来表示。
我国《饲料用大豆》标准（GB1038489）规定：“饲料用大豆需加热后使用， 尿素酶活性不得超过0.4”。台湾省标准为
0.02～0.3△pH 。
脲酶的测定方法
比色法 滴定法 PH增值法 快速检测法
比色法
实验原理
向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓冲液的分析悬 浮液中加入尿酸溶液，在30℃下保温5min， 加入磷钨酸终止酶作用并沉淀蛋白质。产生的 氨在次溴酸钠和麝香草酚作用下形成蓝色的靛 麝香草酚，借以比色。
滴定法（续）
仪器与器皿 pH计 恒温水浴 比色管 10ml移液管
滴定法（续）
试剂
尿素：分析纯 尿素缓冲液：4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并
稀释至1000ml，再将30g尿素溶于此缓冲液中。 0.1mol/l盐酸 0.1mol/l氢氧化钠标准溶液
标定方法：取基准邻苯二甲酸氢钾0.6g，溶于50ml水中，加 热至沸，加入2～3滴酚酞指示剂，用配制的氢氧化钠标准溶液 滴定至呈粉红色30s不退色为终点。以下列公式计算浓度：
M＝m/(V×0.2042) 式中：m：邻苯二甲酸氢钾质量，g；
V：消耗氢氧化钠体积，ml。
滴定法（续）百度文库
操作方法
称取0.2000g试样，转入比色管中，加入10ml尿素缓冲液， 立即盖好盖子并剧烈摇动。置于30±0.5℃恒温水浴上准确保 持30min后立即加入10ml0.1mol/l盐酸，迅速冷却到20℃， 将比色管内容物全部转入烧杯，用水冲洗比色管2～3次，立 即用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。
滴定法
结果计算
14×C（V0－V） 尿素酶活性＝
30×m C——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L； V0——空白试验消耗氢氧化钠的体积， ml； V——测定试验消耗的氢氧化钠的体 积，ml； m——试验质量，g。
快速测定方法
酚红法
称取0.2克的样品于试管中，加入0.2克的尿 素，再加入2滴酚红指示剂及20ml蒸馏水，摇动10 分钟，观察溶液的颜色。 1分钟内呈粉红色，脲酶活性很强； 1-5分钟呈粉红色，脲酶活性强； 5-15分钟呈粉红色，活性有点强； 15-30无色，没有活性。
尿素酶活性与抗胰蛋白酶之间关系，Wright(1981)
脲酶活性测定的局限性
局限性
尿酶活性没有负值，它对任何过熟豆粕的最低值为零；对于 加热过度的豆粕尿酶测定值不是一个可靠的指标 。
解决办法：
利用蛋白质溶解度去评价。原理是：加热使游离氨基酸与其 它化合物的基团形成不能为消化酶所打开的分子间和分子内 的结合键，因而降低了蛋白质的溶解度 。一般要求蛋白质溶 解度（0.2%KOH溶液）应在70%～85%之间。PS＞85% 时，表示加热不足，PS＜70%时则表示加热过度
另取比色管做空白试验，加入10ml尿素缓冲液，10ml0.1 mol/l盐酸。称取与上述试样量相当的试样，迅速加入比色管中，
立即盖好比色管并剧烈摇动，在30±0.5℃恒温水浴上准确保 持30min，冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用 水冲洗比色管2～3次，用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。