免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作流程
免疫组化操作流程免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或组织中是否存在其中一种抗原或蛋白质，并进一步定位其在细胞或组织中的分布情况。
下面是免疫组化的一般操作流程：1.样本制备：a.细胞培养：对于体外培养的细胞，将其定植在培养皿中，使其附着在载玻片上。
b.组织切片：将组织固定、石蜡包埋后，用切片机将其切割成小片。
2.抗原修复：a.细胞：用4%的甲醛或冰醋酸将细胞固定，然后用PBS（磷酸缓冲盐溶液）进行洗涤。
b. 组织：将石蜡包埋的组织切片用xylene去除石蜡，并通过一系列浓度递减的酒精进行洗涤。
3.抗体选择和制备：a.选择合适的一抗体与待检测的目标蛋白或抗原有特异性结合。
b.对于小分子抗原，可以直接用抗体进行染色。
对于较大的蛋白质抗原，需要通过特殊方法将抗体标记。
4.抗体染色：a.细胞：将细胞孵育在含有一抗体的PBS中，并进行特定时间的孵育，然后通过洗涤去除未结合的抗体。
b.组织：将抗体加到待检的组织切片上，经过适当的孵育时间，然后通过洗涤去除未结合的抗体。
5.反应显色：a.一抗染色：根据抗体的结合情况，选择适合的检测方法，如发光、颜色显现等。
b.二抗染色：对于无法直接检测的一抗染色结果，需要加入二抗，二抗可以与一抗特定的Fc部分结合，形成复合物。
二抗通常被标记为酶，可以与底物反应产生颜色或发光。
6.显微镜观察：a.细胞：将染好的细胞载玻片通常先底片固定，然后在显微镜下观察并拍照。
b.组织：将染好的组织切片在载玻片上，然后将其加入显微镜下观察，并通过摄影或记录图像。
7.数据分析和结果解读：a.根据具体的研究目的，对显微镜下观察到的结果进行统计和分析。
b.根据染色的结果和显微镜下观察到的细胞或组织分布情况，对目标蛋白或抗原的表达进行解读。
总结：免疫组化是一种重要的实验方法，可用于检测和定位细胞或组织中的目标蛋白或抗原。
操作流程包括样本制备、抗原修复、抗体选择和制备、抗体染色、反应显色、显微镜观察、数据分析和结果解读。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种在细胞或组织中检测特定抗原或抗体的方法。
免疫组化广泛应用于医学诊断、生命科学研究和药物研发等领域。
下面是免疫组化的操作流程。
1.样本处理：首先，需要准备待检测的样本。
样本可以是组织片、细胞悬液或液体样本（如血清或尿液）。
对于组织样本，通常需要固定、切片和脱水等处理步骤，以保持细胞和组织的结构和形态。
2.抗原修复：组织样本中的抗原通常会在固定处理过程中被破坏或失活。
为了恢复抗原的免疫反应性，需要进行抗原修复步骤。
常用的抗原修复方法包括加热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复。
3.抗原检测：制备好的样本可以用于检测抗原。
抗原检测通常通过选择与目标抗原特异性结合的一组试剂，如特异性抗体或亲和素。
这些试剂将与待检测样本发生特异性结合，从而形成特定的抗原-抗体结合物。
4.一次抗体结合：首先，将样本与一次抗体结合。
一次抗体是与目标抗原结合的特异性抗体。
待检测样本与一次抗体一起孵育，使其与目标抗原发生特异性结合。
5.洗涤：为了去除未结合的一次抗体和其他非特异性结合物，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以用缓冲液溶液进行多次重复，以确保样本的纯净性。
6.二次抗体结合：接下来，需要将与检测物发生特异性结合的二次抗体与样本反应。
二次抗体是与一次抗体特异性结合的抗体。
这些二次抗体通常与标记物结合，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
7.洗涤：与一次抗体结合后，需要再次进行洗涤步骤，以去除未结合的二次抗体和其他非特异性结合物。
8.标记物探测：二次抗体中的标记物将通过检测技术进行可视化。
最常用的检测技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），其中酶标记物与底物反应产生可见的颜色变化。
其他常用的标记物包括荧光染料、生物素-链霉亲和素等。
9.观察和分析：最后，需要使用光学显微镜或显微镜等工具观察标记物，并进行结果分析。
可以根据标记物的位置、数量和强度等进行定量和定性的分析。
总之，免疫组化操作流程包括样本处理、抗原修复、抗原检测、一次抗体结合、洗涤、二次抗体结合、洗涤、标记物探测和观察分析等步骤。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。
b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。
c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。
2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。
b.将切片平均分配在载玻片上。
3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。
b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。
c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。
4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。
b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。
c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。
5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。
b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。
c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。
d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。
6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。
b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。
7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。
b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。
8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。
b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。
9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。
b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。
10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。
b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN免疫组化染色实验操作流程实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。
一、病例资料和实验分组标本：经10% 福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4µm厚切片编号备用。
二、试剂及免疫组化方法实验试剂：xx两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。
抗体1,抗体2。
二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、Triton液、中性树脂等。
仪器(1)10µl、100µl、200µl、1000µl可调微量加样枪（2）4℃冰箱(3)光学显微镜(4)恒温水浴锅(5)恒温烤箱(6)电热蒸馏水器(7)LEICA显微镜及VISITRON照相系统(8)其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。
主要试剂的配置（1） PBS缓冲液NaCl g磷酸氢二钠 g磷酸二氢钠 g加入1000ml容量瓶，加ddH2O至1000ml定容。
充分混合（2）L柠檬酸盐溶液（PH ）A液：柠檬酸溶液(4℃保存)柠檬酸1000mlddH2OB液：柠檬酸钠溶液(4℃保存)柠檬酸钠1000mlddH2O900ml dH2O 缓冲液现用现配（1000ml mol/L）A液（18ml）+B液(82ml)充分混合，调整PH ，充分混合，调整PH （3）3% H2O230% H2O2：甲醇=1：9(4)%Triton的配制Triton原液 ml液4℃保存备用。
（5）5%羊血清的配制（1ml）羊血清 50µl%Triton 950µl4℃保存。
免疫组化方法(1)石蜡切片60℃烤箱烤片30min.(2)石蜡切片常规脱蜡二甲苯Ι15min -- 二甲苯Ⅱ15min -- 无水乙醇Ι15min -- 无水乙醇Ⅱ5min -- 无水乙醇Ⅲ 5min -- 95%乙醇5min -- 90%乙醇5min -- 80%乙醇5min -- 70%乙醇5min -- 蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中）。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化方法和步骤
免疫组化方法和步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平，以及研究细胞或组织中的蛋白质定位和相互作用。
免疫组化方法涉及一系列步骤，包括样本固定、抗原检测与标记、抗体与抗原结合、可视化和结果分析。
以下是免疫组化方法及步骤的详细介绍。
一、样本固定免疫组化实验的第一步是固定样本，通常使用福尔马林或乙醛等化学物质进行固定。
固定的目的是保持细胞和组织的形态结构，并防止蛋白质的降解。
固定过程中，需要将样本固定在载玻片或膜上，以便之后的实验操作。
可使用刷子或杆状工具将样本涂布在载玻片上，或者使用离心管和离心机将细胞沉淀在载膜上。
二、抗原检测与标记样本固定后，下一步是检测和标记目标抗原。
有两种常用的方法供选择：直接法和间接法。
1.直接法：直接法在一个步骤中同时检测和标记抗原。
直接法可以快速获得结果，但受到抗体的特异性和标记物的可用性的限制。
2.间接法：间接法需要两个步骤，先使用特异性初级抗体与抗原结合，再使用标记有染料或标记物的二级抗体与初级抗体结合。
间接法具有较高的灵敏度和特异性，可以用于多重标记和检测多个蛋白质。
三、抗体与抗原结合蛋白质和抗体结合是免疫组化的关键步骤。
待检样本上固定的抗原与抗体结合可以直接检测或通过信号增强来检测。
抗体与抗原结合的时间和温度取决于抗体的亲和力和特异性，通常需要在较低的温度下进行孵育，并在孵育过程中提供充分的抗体与抗原接触时间。
四、可视化可视化是将抗原抗体结合信号转化为可见光信号的过程。
最常见的可视化方法之一是使用酶标测定法。
酶标测定法将酶（如辣根过氧化物酶）结合到标记物（如荧光素黄标记的二级抗体）上，然后通过加入底物（如DAB）产生可见的色素反应。
除了酶标测定法外，还有其他可视化方法，如免疫荧光技术和原位杂交。
免疫荧光技术使用标记的荧光染料标记一级或二级抗体，然后通过荧光显微镜观察样本。
原位杂交使用与DNA序列互补的标记探针识别特定的DNA序列，并通过可视化标记（如荧光）来检测靶标。
简述免疫组化实验流程及注意事项
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免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。
下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。
一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。
2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。
二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。
2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。
3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。
三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。
2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。
四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。
2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。
五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。
3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。
六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。
2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。
3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。
七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。
2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。
3.分析结果并记录数据。
八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。
2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。
九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。
2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。
免疫组化操作规程
引言概述在免疫组化实验中，操作规程的制定和遵守对于获得稳定和准确的实验结果至关重要。
本文旨在介绍免疫组化操作规程的基本要点，以及在这些要点下的详细步骤和注意事项，以帮助研究人员在实验过程中取得良好的成果。
正文内容1.样本处理1.1采集样本1.1.1准备合适的样本收集工具1.1.2样本收集前的准备工作1.1.3样本收集技巧1.2样本保存与运输1.2.1样本保存条件1.2.2样本运输前的准备工作1.2.3样本运输技巧2.标本处理2.1标本固定2.1.1选择合适的固定剂2.1.2固定时间和温度的控制2.1.3固定过程中的操作技巧2.2组织切片制备2.2.1切片前准备工作2.2.2切片仪的选择和使用2.2.3切片制备的关键步骤3.免疫反应3.1抗原解蔽3.1.1解蔽试剂的选择和使用3.1.2解蔽时间和温度的控制3.1.3解蔽过程中的注意事项3.2抗体处理3.2.1抗体稀释比例的确定3.2.2抗体染色的时间和温度的控制3.2.3抗体处理过程的操作技巧3.3染色方法3.3.1直接染色法的步骤和注意事项3.3.2间接染色法的步骤和注意事项3.3.3特殊染色方法的选择和使用4.影像分析4.1显微镜检查4.1.1显微镜选择和调节4.1.2显微镜检查的技巧和注意事项4.2图像获取4.2.1数码相机的选择和设置4.2.2图像获取的技巧和注意事项4.3图像分析4.3.1图像处理软件的选择和使用4.3.2图像分析方法的选择和运用5.结果解释与报告5.1数据统计与分析5.1.1实验数据的整理与统计5.1.2数据分析的方法与工具5.2结果解释5.2.1实验结果的评估与解释5.2.2结果可能存在的误差和异常情况的识别与解决5.3报告撰写5.3.1报告结构和格式的要求5.3.2结果描述和讨论的撰写方法5.3.3参考文献的引用和列表的编写总结免疫组化操作规程在实验过程中起着至关重要的作用，本文详细介绍了样本处理、标本处理、免疫反应、影像分析以及结果解释与报告的相关内容。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定蛋白质、抗原或标记物在细胞或组织中的表达和分布情况。
它被广泛应用于病理学、生物学和医学研究中。
以下是一份免疫组化操作规程的示例，供参考。
一、实验前准备1.准备所需材料：组织切片、抗体、缓冲液等。
2.检查试剂和设备是否正常，确保实验所需材料的质量和有效性。
3.清洗工作台和实验器具，确保无细菌和异物。
4.根据实验需要，制定实验计划和操作流程，合理安排实验时间。
二、标本处理1.取出组织切片，将其置于洗涤缓冲液中浸泡，去除可能存在的阻碍抗体结合的物质。
2.如果组织切片需要去除蜡质包埋，可在60°C恒温水浴中使其溶解。
3.将样本置于蛋白酶解液中，进行抗原修复，以使抗原暴露。
三、抗体操作1.根据实验目的和样本特性选择合适的一抗和二抗。
2.确定一抗和二抗的工作浓度，一般根据厂家推荐进行稀释。
3. 将抗体加入到含有牛血清白蛋白和Triton X-100的缓冲液中，制成一抗溶液。
4.将一抗溶液加入组织切片上，使其充分覆盖，孵育时间根据抗体性质而定。
5.用洗涤缓冲液进行洗涤，去除未结合的抗体。
6.加入二抗，孵育一段时间以进行特异性结合。
7.再次用洗涤缓冲液进行洗涤。
四、染色和显微镜观察1.加入显色底物，使目标分子显示出颜色或荧光。
2.使用显微镜观察样本，以获得目标蛋白质的表达和分布信息。
3.根据需要进行图像获取和数据分析。
五、清洗和保存1.清洗实验用具和工作台，防止污染和交叉污染。
2.保存样本和显微镜图像的数据，方便后续分析和检索。
3.处理和处置废弃物，遵循相关安全和环保规定。
注意事项：1.实验操作时应穿戴实验服和手套，采取必要的安全措施，尽量避免直接接触有害试剂。
2.操作过程中严格按照冷链保存抗体，并避免其受到高温和臭氧等破坏因素。
3.各操作步骤中的温度、时间等参数应根据具体实验需要进行优化调整。
4.实验结果的解释需要结合正常组织和阴性对照进行比较和分析。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。
下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。
注意保护好标本的完整性和质量。
2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。
3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。
4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。
5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。
6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。
7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。
8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。
以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。
希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。
免疫组化操作程序
免疫组化操作程序免疫组化操作程序是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达及定位的方法。
它是一种广泛应用于生物医学研究和诊断中的技术，可以帮助我们了解细胞和组织中的分子机制并在疾病诊断中起到重要的作用。
本文将详细介绍免疫组化操作程序的步骤和注意事项。
一、实验前准备：1.样本准备：收集并固定适当的组织样本，使用适当的方法固定样本，如福尔马林或酒精。
2.抗体选择：根据所需研究的蛋白质，选择合适的一抗和二抗。
同时，选择用于检测的标记物，如酶、荧光物质等。
3.条件优化：根据本实验的具体情况，优化实验条件，包括温度、时间和浓度等。
二、免疫组织染色步骤：1.切片制备：将固定的组织样本切片，厚度约为4-6微米。
2.抗原修复：根据实验需求，选择适当的方法进行抗原修复，如高温加热、酶解或酸解等。
3.阻断非特异性结合：将组织切片加入阻断液，如10%牛血清蛋白（BSA）或5%牛血清中所含的非离子阻断剂。
封闭其非特异性结合位点。
4.一抗孵育：将选择的一抗溶液滴于组织切片上，孵育在适当的温度和时间下，让一抗与目标蛋白结合。
5.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的一抗。
6.二抗孵育：将选择的针对一抗的二抗溶液滴于切片上，孵育在适当的温度和时间下，让二抗结合到一抗上。
7.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的二抗。
8.标记物检测：根据选择的标记物，使用适当的方法检测其在切片上的存在，如化学染色、荧光显微镜等。
9.涂覆封片：将固定和染色好的切片放置在玻璃片上，并用适当的封片溶液覆盖切片。
三、实验注意事项：1.样本处理：合适的样本处理和固定方法对实验结果至关重要。
选择适当的固定剂并注意固定时间。
2.抗原修复：不同的抗原修复方法适用于不同的蛋白质，需要根据实验要求选择适当的方法。
3.阻断非特异性结合：添加适当的非特异性结合阻断剂能够减少非特异性结合。
4.孵育温度和时间：根据抗体和样本的特性选择适当的孵育温度和时间，以提高特异性和灵敏度。
免疫组化基本原理及操作流程
免疫组化基本原理及操作流程免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的方法，用于检测和定位特定的抗原或抗体在细胞或组织中的存在和分布。
免疫组化的基本原理是利用抗原与抗体之间的高度特异性结合来实现抗原的检测和定位。
免疫组化的基本操作流程如下：第一步：标本处理标本可以是细胞培养物、组织切片、血液等。
在进行免疫组化前，首先需要对标本进行适当的处理，以使得抗原能够得到良好的保存和定位。
处理方法包括固定、脱水、包埋等。
固定是将标本用适当的化学物质处理，使其固定在载玻片上，并保持其原有的形态和结构。
第二步：抗原检测与定位在标本处理完成后，可以开始进行抗原的检测和定位。
这一步需要使用特异性的抗体来与目标抗原结合。
抗体通常通过动物免疫技术获得，即将纯化的抗原注射到动物体内，激发其产生特异性的抗体。
抗体经过收集和纯化后，将其与抗原所在的标本接触，通过抗原与抗体的特异性结合来检测和定位抗原的存在和分布。
第三步：抗体检测抗体检测是免疫组化中至关重要的一步。
通常使用标记抗体来检测抗原的存在和定位。
标记抗体是一种与特定抗体共价结合的物质，它可以通过荧光染料、辣根过氧化物酶、生物素等标记物来实现抗原的检测和定位。
标记抗体通过特异性结合抗原，使得抗原能够在显微镜下观察到，并确定其存在的位置。
第四步：显色与观察在完成抗体检测后，需要进行显色以使抗原能够在显微镜下观察到。
显色方法包括使用荧光显色、暗场显色、免疫酶染色等。
其中，免疫酶染色是最常用的方法，它通过在抗体中添加酶标记物，如辣根过氧化物酶（HRP），再加入适当的显色底物，使其生成可见的色素沉淀。
经过显色后，使用显微镜观察标本，可见到抗原的存在和定位。
第五步：结果分析与解读在观察到显色结果后，需要对结果进行分析和解读。
根据显色的程度和分布情况，可以判断抗原的阳性与阴性。
阳性表示抗原在样品中存在，而阴性则表示抗原在样品中不存在。
结果的解读需要结合临床和实验的背景知识进行综合分析。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化（immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗体-抗原反应来检测组织中特定蛋白质表达的方法。
它广泛应用于医学研究和临床诊断中，常用于检测肿瘤标志物、免疫细胞浸润和病毒感染等。
I.免疫组化操作规程1.样本处理a.组织固定：将组织标本进行固定，一般使用10%中性缓冲福尔马林进行固定，固定时间一般为24-48小时。
b.去脂化：对于脂肪较多的组织，需要将其进行去脂处理，可使用二甲苯或其他去脂剂进行处理，处理时间一般为20-30分钟。
2.抗原恢复a.热诱导抗原恢复：将固定的组织样本放入蒸汽气锅中，用缓冲液浸泡标本，加热至高压下，进行抗原恢复处理。
具体温度和时间根据样本类型和抗体要求而定。
b.酶诱导抗原恢复：对于抗原蛋白固定后被交联、无法热诱导恢复的样本，可使用酶解剂（如胰蛋白酶）进行抗原恢复。
3.阻断非特异结合a.使用非特异结合阻断剂：在进行免疫染色之前，需要将非特异结合位点进行阻断，可使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼凝胶蛋白（FSG）等，在阻断液中孵育样本。
4.抗体反应a.一抗孵育：将目标抗体（一抗）稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为1-2小时。
b.二抗孵育：选择免疫印迹试剂盒中对应一抗的二抗，将其稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为30-60分钟。
5.染色和显色a.底物酶标：使用底物和酶的复合物，进行染色和显色反应。
常用的底物有DAB（二氨基苯），TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等，反应时间一般为5-10分钟。
b.荧光染色：若使用荧光标记的二抗，需进行相应波长的激发光照射，观察荧光信号。
6.降解和清理a.用超纯水洗涤：使用超纯水进行标本洗涤，彻底清除底物和底物残留物。
b.孵育升级脱位溶液：将样本浸泡在脱位溶液中，使特异结合的抗体与抗原分离。
c.用盖玻片封装：涂上透明胶和玻片，使其固定在盖玻片上，并封住。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HP O4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N 的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。
b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；b、油和TBS(或PBS)配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
XX医院免疫组化技术操作流程
免疫组化技术操作规程
一、石蜡切片免疫组化步骤(手工EnVision法)：
1、切片常规脱蜡至水洗。
2、根据一抗的要求进行修复：枸橼酸缓冲液（0.01M，PH6.0）高压锅修复（排气以后1 min 40s）；EDTA微波炉98℃20min；酶修复。
3、冷却至室温后水洗，3%过氧化氢处理10min。
4、以下步骤同冰冻3-7步。
所用试剂盒是机器所剩余的二抗（IgG多聚物技术，避免了生物素的影响）；还有中山的二抗，二抗前需要增加一步增强剂20min。
二、石蜡切片免疫组化步骤(机器)：
1、切片烤好后贴好标签入10%奶粉浸泡15 min。
2、充分冲洗后上机。
3、根据机器提示时间滴加一抗。
4、染色结束后清洗去油，脱水透明后中性树胶封固。
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免疫组化操作规程
一、实验原理与意义
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通
过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧
光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋
白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材
微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、
计时器和通风橱等。
三、试剂配制
1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml
0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸
水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；
B. 0.2
M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷
却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
4. 5％羊血清或封闭血清，用PBS 稀释。
5. 含0.03％H 2 O 2 的0.05％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30%
H 2 O 2 ＋95 ul PBS。
6. 一抗、二抗均用PBS 稀释。
7. Xylene、梯度Ethanol（100％×2、95％、80％、70％、50％）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。
8. 苏木精染液：
四、操作步骤
1 、脱蜡、水化
1) 60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；
2) 100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；
3) 95% ethanol 2 minutes；
4) 80% ethanol 2 minutes；
5) 70% ethanol 2 minutes；
6) distilled water:5 min；
7) PBS 洗3 次×3 min。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶
8) 用封闭通透液浸润切片30 min（RT 避光）。
配法是用预热40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％H 2 O 2 。
9) PBS 溶液洗3 次×3 min。
3、抗原修复暴露抗原决定族
10) 切片放入0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4 min 至沸腾后，再加热约6 min×4 次，每次间隔补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
11) PBS 溶液洗3 次×3 min；
12) 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴
入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min；
5、一抗孵育
13) 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1 小时，然后4 度过夜，从冰箱中取出需
37 ℃复温45 min。
6、二抗孵育
14) 将一抗倒掉并用PBS 洗5 min×5 次；
15) 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min （回收）。
16) 用PBS 洗5 次×5 min；
7、SP 反应
17) 加入SP 后放入37 度烤箱中30 min。
18) 用PBS 洗5 次×5 min；
8、显色
19) 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5 min（3～10 min），由镜下观察颜色控制时间。
0.05％DAB（避光）（1:20 储备液）：5 ul 20×DAB ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS。
1%DAB 储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS 充分溶解，-20 ℃保存。
9、复染、脱水、透明、封片
20) 用PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗5 min；
21) 加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s 后自来水冲洗，双蒸水洗5 min，再用PBS 返蓝5 min。
22) 脱水：50% ethanol 1-2 min，
70% ethanol 1-2 min
95% ethanol 1-2 min；
95% ethanol 1-2 min；
100% absolute ethanol: (1-2) min；
100% absolute ethanol: (1-2) min。
23) 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min
24) 封片：中性树胶。
五、注意事项
1. 苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。
2. DAB 显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。
3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。
尤其一抗孵育最好在4 度过夜。
4. 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。
5. 片子着色不均匀的原因如下：
①脱蜡不充分。
可以60 ℃烤20 min，立即放入新鲜的xylene1；
②水化不全。
应经常配制新鲜的梯度乙醇；
③抗体没混匀。
用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；
④抗体孵育时，切片放倾斜；
⑤抗体孵育后PBS 冲洗不充分。
⑥制片厚薄不均匀等问题。
染片盒不平，切片倾斜。
6. 一抗从4 ℃拿出后，为什么有人说要37 度复温，目的是什么？
①一方面，防止切片从4 ℃直接放入PBS 易脱片；②另一方面，使抗原抗体结合更稳定。
一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有
用,4 ℃和37 ℃度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后
者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
7. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？
①抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。
这可通过缩短一抗/二抗孵育时
间、稀释抗体来控制；
②一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
③内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时
间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
④非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和
适当增加浓度来加强封闭效果；
⑤DAB 显色时间过长或浓度过高；
⑥PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；
⑦标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。
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