酵母菌的培养与分离

微生物学大实验

实验指导

编者：

生物技术教研室

目录

实验一酵母菌的培养与分离 (2)

实验二酵母菌的鉴定 (7)

实验三酵母菌耐受能力的测定 (19)

实验四酵母菌发酵工艺条件的优化 (22)

实验五耐高温酵母菌株的诱变选育 (24)

实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵 (27)

耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究

实验一酵母菌的培养与分离

一、实验目的

学习培养和分离酵母菌的技术和方法

二、基本原理

大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为-6,常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。

利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样

做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。

三、实验主要内容和要求

（一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括：

1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。

2. 菌株的筛选, 根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。

3. 酵母菌的分离,要求接种一次,28-30 C,培养24小时，转接一次，28-30 C,培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。

4. 用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。

四、实验的准备

1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、%美蓝染液、1ml 的无菌吸管、无菌培养皿等。

2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：

原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）配制方法：

（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布

过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。

（2）在20喲马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115C条件下高压灭菌20分种。

（3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，但不加琼脂而加乳酸，按每1000ml培养液中含5ml 乳酸的量加入，并分装试管。

五、实验设计

l 、接种：取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置

28-30 °C，培养24小时，可见培养液变混浊。

2、培养，用无菌吸管取上述培养后培养液，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28 一30C再培养24小时或稍长（过长则霉菌长出）。

3、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。

活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。

4、分离：马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板。用划线法分离酵母菌培养液，

从而得到单个菌落。挑取单个菌落反复再次划线分离纯化，最终可获得纯培养。

六、实验注意事项

1. 配制培养基时，应注意琼脂的加量，不同规格及批次的琼脂的加量应由实验确定，不能照搬书上的加量。

2. 对培养基加热时应注意琼脂的糊底与暴沸。

3. 灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。

4. 接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒。

七、实验结果的观察及记录

小时，观察试管内培养液的情况并作记录，每组转接2支试管。

小时，观察试管内培养液的情况，镜检培养液内菌的数量，粗略判断是否为酵母菌并作记录，每人蘸取培养液进行划线分离，并作记录。

小时后，观察培养皿内菌的生长的情况，挑取单个菌落进一步划线分离，直到为纯菌落。

4. 每组转接10支斜面试管，备用。

八、实验的延伸

自然条件下酿造苹果酒，葡萄酒、猕猴桃酒。

七实验报告要求

1. 实验完毕后，每位同学都应独立作出实验报告，实验报告应类似于小型论文格式。

2. 实验报告内容包括：

（1）立题意义。

（2）实验设计。

（3）实验步骤详细记录。

（4）对实验结果的分析讨论和总结。

（5）实验延伸。

（6）实验心得体会。

附1：果酒的酿制方法

—、目的要求

了解果酒酿制原理，学习苹果酒酿制技术。

二、基本原理

果酒是一类营养丰富、含酒精度低的上乘饮料。它是用含一定糖分和水分的果实压汁，经微生物发酵而成。其生化作用，除酒精发酵的主产物外，还有甘油、醋酸、琥珀酸、杂醇油等的形成；同时，陈酿期中，各种酸类与醇类的酯化反应，赋予果酒特殊的香味；果酒中

的单宁、色素、果屑微粒及蛋白质（包括酵母尸体）等的氧化和下沉，使酒液澄清、风味增浓。

各种果酒以原料而称名。除坚果外，所有栽培果，野生果均可做酿果酒的原料。本实验以苹果酒为例，学习其酿制方法。

三、实验材料

1 、菌种在7° Be'麦芽汁琼脂斜面培养基上的葡萄酒酵母（ellipsoieleus ）。

2、器材苹果汁培养基，7° Be'麦芽汁培养基，10ml/管、100ml/三角瓶等装量，白糖，食用酒精，亚硫酸，果胶酶，发酵缸，破碎机，果汁分离器等。

a. 苹果汁培养基

粗滤新鲜果汁（蔗糖调至13° Be,酸度％以下）1000ml

K2HPO4 0.1g MgSO4 • 7H2O 0.1g

配好后，加热煮沸3〜5分钟，静置10小时以上，过滤、分装，0.7Kg/cm2灭菌20 分钟。

四、实验步骤

（一）酒母培养

1 、菌种活化（一级种）取装有10ml苹果汁或7° Be'麦芽汁培养基1支，按无菌操作法接种葡萄酒酵母菌一环，混匀后置28〜30°C下培养2〜5天（用苹果汁活化菌种时需培养5天以上），镜检酵母繁殖良好，无杂菌即可。

2 、母发酵剂制备（二级种）在装有100ml苹果汁培养基的三角瓶中，接1〜2ml

经活化的葡萄酒酵母菌液，于28C下培养2〜3天，当培养液表面有气泡产生，嗅之有酒香味、取样镜检无杂菌时使用。

3、生产发酵剂的制备（三级种）方法与母发酵剂相同，只是采取更大的容器。一般采用500〜1000ml 的三角瓶或卡氏罐，盛装占容积1/2〜3/5 的果汁培养液，灭菌冷却后，按10%接种量接人母发酵剂，在25〜28C下培养24〜48小时，待发酵正常，镜检无杂菌方可使用。

4、如果使用活性干酵母，添加量为20g/L 发酵醪，复水用水量是干酵母重量的5〜10倍。复水用水的温度应保持在40C左右（38〜43C），将酵母静置5〜10min后搅拌，酵母在水中的时间不能超过30mi n。然后使酵母溶液缓慢冷却到与将被接种发酵醪的温差小于10C，然后直接加入发酵醪。