果酒酵母发酵及菌种保藏

果酒酵母发酵及菌种保藏

选取1-2 种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。

1. 实验目的和内容

1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。

3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。

4 ）学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。

2. 实验原理

果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。

可用以下反应式来说明：

果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。

果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。

微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，

才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。代谢能力

低温、干燥和隔绝空气是使微生物

降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因

素而设计的。

保藏方法大致可分为以下几种：

1）传代培养保藏法

又称斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6 C

冰箱内保存。

2 ）液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3 ）载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4）寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须

在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5 ）冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20至-30 C, -50至-80 C）、干冰酒精快速冻结（约-70 C）和液氮（-196 C）等保藏法。6）冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70 C左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

3. 实验材料和用具样品：新鲜水果及压榨汁。

试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl 、干冰、95% 乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土（有机物含量少的黄土）或者红土；

器皿：三角烧瓶（250mL）、无菌试管、无菌吸管（1mL 及5mL）、无菌滴管、接种环、40 目及

100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（0.5 X1.2cm ）冰箱，低温冰箱（-30 C）,液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W ），磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。

4. 操作步骤

4.1 自选酵母发酵性性能的检测试验：用选育菌种发酵果酒

4.1.1 果酒酿造的工艺流程

鲜果T分选T破碎、除梗T果浆T分离取汁T澄清T清汁T发酵T倒桶T贮酒T过滤T冷处

理T调配T过滤T成品

4.1.2 工艺简述

1 ）发酵前的处理前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。

①破碎、除梗：破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。破碎机有双辊压破机、鼓形刮板式破碎机、离心式破碎机、锤片式破碎机等。

②二氧化硫处理：二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物

质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L 。此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加。

2）果汁的调整

①糖的调整：酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需17-20 °Bx。如果糖度达不到

要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。

②酸的调整：酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使红葡萄酒颜色鲜明；使酒味清爽，并

具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。干酒易在0.6%-0.8% ，甜酒

0.8%-1% 一般pH 大于3.6 或可滴定酸低于0.65% 时应该对果汁加酸。

3）酒精发酵

发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为容器容积的4/5 ，然后加入3%-5%的酵母，搅拌均匀，温度控制在20-28 C,发酵时间随酵母的活性和发酵

温度而变化，一般约为3-12 天。残糖降为0.4%以下时主发酵结束。然后应进行后发酵，即将酒容器密闭并移至酒窑，在12-28 C下放置1个月左右。发酵结束后要进行澄清，澄

清的方法和果汁相同。

4）成品调配

果酒的调配主要有勾兑和调整。勾兑即原酒的选择与适当比例的混合；调整即根据产品质量标准对勾兑酒的某些成分进行调整。勾兑，一般先选一种质量接近标准的原酒作基础原酒，据其缺点选一种或几种另外的酒作勾兑酒，加入一定的比例后进行感官和化学分析，从而确定比例。调整，主要有酒精含量、糖、酸等指标。酒精含量的调整最好用同品种酒精含量高的酒进行调配，也可加蒸馏酒或酒精；甜酒若含糖不足，

用同品种的浓缩汁效果最好，也可用砂糖，视产品的质量而定；酸分不足可用柠檬酸。

5 ）过滤、杀菌、装瓶过滤有硅藻土过滤、薄板过滤、微孔薄膜过滤等。果酒常用玻璃瓶包装。装瓶时，空瓶用

2-4 %的碱液在50 C以上温度浸泡后，清洗干净，沥干水后杀菌。果酒可先经巴氏杀菌再进行热装瓶或冷装瓶，含酒精低的果酒，装瓶后还应进行杀菌。

4.1.3 发酵性能测定

测定一个发酵周期内酒精度及含糖量变化，绘制发酵曲线，并对自制果酒进行感官评定，分析测定理化指标（糖度、酒度、酸度）。

还原糖、总糖的测定：直接滴定法。

总酸的测定：中和滴定法。

酒度的测定：蒸馏法。