菠萝果酒酵母菌选育

实验目的
本研究以1 株有一定发酵能力和产香能力的 菠萝果酒用专用酵母菌株 H10为出发菌株，由于 该菌株在耐酒精度、耐SO 2 、增加风味物质等方 面还有待进一步提高，所以实验采用原生质体紫 外诱变的育种方法对其进行改良，并经过初筛和 复筛以期得到 1 株 SO 2 和酒精耐受性强，产香 能力高，遗传稳定性好，适合热带地区菠萝果酒 生产的优良酵母菌株。
自选菠萝果酒酵母菌的诱变育种
实验背景 实验目的 实验材料与方法 实验结果与分析 遗传稳定性实验 讨论
实验背景
菠萝是我国南方栽培面积较大，产量较多的 大宗水果之一，成熟时含有大量的水分、还原糖 和有机酸，并含多种维生素及矿物元素 ，是生产 果酒的良好原材料。但目前由于没有专用的菠萝 果酒专用酵母菌，企业在生产菠萝果酒时，一般 都是采用市售的葡萄酒用活性干酵母或其它果酒 用酵母进行发酵生产，虽然产酒率能够得到保证， 但成品菠萝果酒缺乏菠萝果实特有的香气，风味 过于平淡，典型性欠佳。因此，选育优良的菠萝 果酒专用酵母菌种对于规模化生产菠萝果酒就显 得尤为必要和迫切。
2. 4 诱变菌株的复筛
• 经过初筛得到的 6 株酵母菌，在 SO 2 为较高的 添加量 100 mg/L 及 30℃ 下，18°Brix 的菠萝汁 进行发酵。发酵 5 d 后测定发酵液的酒度进行复 筛，结果见图 6。
遗传稳定性实验
• 对经过诱变筛选出来的酵母菌 H10 －15 保存菌 株进行连续 7 次传代实验，考察该菌株的遗传稳 定性，每次都对该菌株进行活化和扩大培养后， 在30℃、SO 2 添加量为 60 mg/L、pH 5. 0 的 条件 下对18°Brix 的菠萝汁进行发酵，5 d 后分别测 定各批次发酵液的酒度和总酯含量，结果见表 2。
• 1.3 原生质体的紫外诱变时间的确定
致死率 = (紫外线照射前的菌落总数 － 紫外线照射后的菌落总数) / 紫外线照 射后的菌落总数
• 1.4 诱变酵母菌初筛
8%乙醇，12%乙醇，测OD值
• 1.5 诱变酵母菌株复筛
糖度为 18°Brix 的新鲜菠萝汁， 38℃
结来自百度文库与分析
• 2. 1 原生质体制备的单因素试验 • 2. 1. 1 菌龄对原生质体制备的影响
2. 3 诱变菌株的初筛
将经过紫外诱变的酵母菌原生质体进行高渗平 板培养，挑选形态发生变化的菌落，共 34 株，依 次编号为 H10 －1、H10 －2、……H10 －34。将这 些菌株分别转移到完全培养基上培养至菌落成熟后， 转入试管中培养后备用。将所选取的 34 株酵母菌， 用完全培养基试管活化两次后，接入麦芽汁液体培 养基培养 18 h，将此麦芽汁培养基平分为 2 批相同 的份数，一批加入 8% 的酒精，另一批加入 12% 的 酒精，同时培养 72 h 后，在λ 600 下测定光密度 OD 值，结果见表 1。
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实验材料与方法
• 实验材料
• 1.1 实验菌种：一种从菠萝果皮中分离并经初步鉴定的酿酒 酵母，自编号 H10 • 1.2 主要试剂：蜗牛酶、β-巯基乙醇、Na 2 HPO 4 、NaH 2 PO 4 ，分析纯;山梨醇:生化试剂 • 1.3 培养基与溶液的配制：完全培养基(YEPD):葡萄糖 2%，蛋 白胨 2%，酵母膏 1%，蒸馏水，自然 pH，固体培养基中添 加 2%琼脂高渗再生培养基(下层):在完全培养基中加入0. 8 mol/L 山梨醇。 • PB 溶液:取 8. 0 mL 0. 2 mol/L Na 2 HPO 4 溶液与92. 0 mL 0. 2 mol/L NaH 2 PO 4 ;混合。 • PBS 溶液:0. 2 mol/L PB 溶液(含 0. 8 mol/L 山梨醇，pH 5. 8)。 • 酶液:蜗牛酶，用 PBS 溶液溶解(0. 45 μm 微孔滤膜过滤除菌)， 使用浓度 1%。
• 实验方法
• 1.1 原生质体的制备 • 1.2 原生质体的再生
将制备好的原生质体菌悬液用高渗稳定液适当稀释后，用双层平板法涂布 于 YEPDS 再生培养基上，28℃培养、再生，待长成菌落后计数(C);另外，原生质 体菌悬液用用无菌水稀释，涂布于 YEPD 培养基上，长出菌落后计数(B)。同时做 一对照组，菌悬液经预处理和洗涤后加入不含蜗牛酶的 PBS 溶液后保温，无菌水 稀释后涂布于 YEPD 平板上，计算长出的菌落数记为 A。原生质体的形成率和再 生率计算 :
2. 1. 3 酶解液 pH 对酵母菌原生质体的影响
• 酶解液 pH 对酵母菌原生质体的影响结果如 图 3所示。
2. 1. 4 酶解时间对酵母菌原生质体制备的影响
• 酶解时间对酵母菌原生质体制备的影响结果见图 4。
2. 2 原生质体紫外诱变时间的确定
在照射功率和照射距离固定的前提下，辐射剂 量的大小由照射的时间来决定 。采用紫外线对酵 母菌 H10 原生质体照射不同的时间，原生质体照 射时间与致死率的关系如图 5 所示。
• 不同生长期的菌体因其生理状态不同，对脱壁酶 的反应有所不同。取培养至对数期的不同时间的 离心菌体即菌龄对原生质体制备过程进行考察， 结果如图 1
• 2. 1. 2 酶解温度对酵母菌原生质体制备的影响
在研究酶解温度对酵母菌原生质体制备的影响 时，除考虑酶作用适宜温度外，还要考虑温度对菌 体生长的影响，以免对原生体活性的造成不良影响。 温度对原生质体制备的影响如图 2 所示
讨论
• (1)自选菠萝果酒酵母菌出发菌株 H10 原生质体 制备优化得到的工艺条件为:菌龄(对数生长期开 始后)10 h，酶解温度为 32℃，酶解液 pH 6. 2， 酶解时间 90 min。 • (2)最优紫外灯照射时间为150s。 • (3)原生质体紫外诱变后的菌株经过初筛和复筛， 得到1 株乙醇和 SO 2 耐受性好的，产酯量高，遗 传稳定性好，适合热带地区菠萝酒生产的优良酵 母菌株，自编号为 H10 －15。