高温蛋白酶产生菌株的筛选

高温蛋白酶产生菌株的筛选

一、实验目的

1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术

2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法

3. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法

二、基本原理

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有：

平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面：

1. 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

三、实验材料

1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样，

并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取）

2. 培养基

①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。

组成：牛肉膏0.5% 蛋白胨1% NaCl 0.5% pH 7.2～7.4 121℃，灭菌20min

②酪素培养基（附录Ⅱ-1.10）：200 mL/500 mL△×1（10-12个平板，每组6个平板）

* 酪素的母液浓度为4%，是将4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃热水稀释到所需浓度（即定容到100 mL），即得到母液浓度围4%的酪素溶液。

各组分的母液由老师配制好，学生按照200ml的体积直接取样加入即可。

pH 6.5～7.0，121℃，灭菌20min，倒好平板后进行无菌检查。

③生理盐水：0.85% NaCl水溶液，9 mL/支×10支

④其他：平皿10套、温度计、水浴锅、移液管、显微镜、涂布器2个，三角瓶（250mL， 500 mL规格）、革兰氏染色液等。

四、实验内容

1.采样

学生从地表下10～15cm的土壤中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等等。

2. 增殖培养（富集培养）

一般来讲，样品所占欲分离微生物的数量较少，利用微生物所需营养的区别，在增殖培养基中使某些微生物的

生长受到抑制，而对某些微生物可促进它们的生长，从而达到分离所需微生物的目地，这种培养称为增殖培养。

取土样平摊于一干净的纸上，从四个角和中央各取一点土，混匀，称取1g，置于装有20ml肉汤培养基的250ml 三角瓶中，六层纱布封口，于80℃水浴加热处理10min，以杀死样品中的微生物营养体细胞。然后30℃，150 r/min，振荡培养24h。取样镜检形成芽孢的情况。

3. 涂布分离

将增殖培养液置于80℃水浴中加热10min，再次杀死不形成芽孢的营养体细胞，以浓缩芽孢杆菌（第二次加热处理前，取1ml培养液经适当稀释后作革兰氏染色，观察是否有枯草芽孢杆菌存在，本实验中略去该步骤）。

然后取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释到10-4，10-5，10-6等。分别取0.1mL菌液于无菌的酪素培养基平板上（初筛平板，每个稀释度平均两皿），用灭过菌的涂布棒将菌液均匀涂布在酪素平板上，倒置于30℃培养箱中培养24~48h。观察酪素平板上菌落周围的透明圈，挑(H/C)比值大的菌接入斜面培养基，30℃培养24h，备用。

4. 纯化

用平板划线分离法在酪素平板或牛肉膏蛋白胨平板上分离纯化挑选出的菌株。

5. 纯种鉴定

菌种经革兰氏染色，油镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。

①细胞形态，菌落特征，芽孢形成情况。

②产蛋白酶能力的测定：直接观察在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈。

6.菌种保藏该实验分离得到的枯草芽孢杆菌作为后续实验的菌种使用。

五、结果与讨论

绘制菌体形态图，计算不同单菌落的H/C。

六、实验任务

获得的H/C比值大、产蛋白酶活力高的枯草芽孢杆菌菌株。