食品中大肠菌群计数——第二法检测程序步骤.
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食品中大肠菌群计数——第二法检 测程序步骤
食品营养与检测专业教学资源库
目录页
一
检测设备的准备 检测药品的配制 样品的稀释 平板培养 平板菌落数的选择 验证试验
二 三
四
五
六
— 1—
食品营养与检测专业教学资源库
过渡页 检测设备的准备
一
— 2—
食品营养与检测专业教学资源库
设备及条件 名称
恒温培养箱 冰箱 恒温水浴箱 天平 均质器 振荡器
配制说明
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH 至7.4±0.1。煮沸2min,将培养基融 化并恒温至45 ℃~50 ℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3h。
— 4—
食品营养与检测专业教学资源库
培养基和试剂
名称
煌绿乳糖 胆盐(BGLB) 肉汤
物料名称
蛋白胨 乳糖 牛胆粉溶液 0.1%煌绿水溶液 蒸馏水
1:100
用 1mL 无菌吸管 或微量移液器吸 取1∶10样品匀液 1mL,沿管壁缓缓 注入9mL磷酸盐缓 冲 液或生理盐水 的无菌试管中(注 意吸管或吸头尖 端不要触及稀释 液面),振摇试管 或换用1支1mL 无 菌吸管反复吹打, 使其混合均匀,制 成1∶100的样品 匀液。
其他稀释度
根据对样品 污染状况的 估计,按上述 操作,依次制 成十倍递增 系列稀释样 品匀液。每 递增稀释 1 次,换用1支 1mL无菌吸管 或吸头。
用量
10.0g 200mL 13.3mL 800mL
配制Biblioteka Baidu明
将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL 蒸馏水中,加入 牛胆粉溶液200 mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于 200mL 蒸馏水中,调节pH 至7.0~7.5),用蒸馏 水稀释到975mL,调节pH 至7.2±0.1,再加入 0.1% 煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到 1000mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的 试管中,每管 10mL。121 ℃高压灭菌15min。
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食品营养与检测专业教学资源库
培养基和试剂 名称
磷酸盐缓 冲液
物料名称
磷酸二氢钾 蒸馏水
用量
34.0g 500mL
配制说明
贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中, 用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶 液调节pH 至 7.2±0.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。 稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏 水稀释至1000mL,分 装于适宜容器中, 121 ℃高压灭菌15min。 称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌 15min。 称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。 移取浓盐酸90mL,用无菌蒸馏水稀释至1000mL。
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食品营养与检测专业教学资源库
过渡页 证实试验
六
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食品营养与检测专业教学资源库
证实试验 从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃ 培养 24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
条件
36 ℃±1 ℃ 2 ℃~5 ℃ 46℃±1℃ 感量0.1g 无特殊要求 无特殊要求
无菌吸管
无菌锥形瓶 无菌培养皿
1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头
500mL 直径90mm
pH 计或pH 比色管或精密 pH 试纸
菌落计数器
无特殊要求
无特殊要求
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食品营养与检测专业教学资源库
固体 和半 固体 样品
稀释方式 1:10
称取25g样品,放入盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌均质杯 内 ,8000r/min~10000r/min均 质1min~2min,或放入盛有 225mL磷酸盐缓冲液或生理盐 水的无 菌均质袋中,用拍击式 均质器拍打1min~2min,制成 1∶10的样品匀液。 以无菌吸管吸取25mL样品置盛 有225mL磷酸盐缓冲液或生理 盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置 适当数量的无菌玻璃珠)或其 他无菌容器中充分振摇或置于 机械振荡器中振摇,充分混匀, 制 成1∶10的样品匀液。
1：100样品匀液
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食品营养与检测专业教学资源库
过渡页 平板培养
四
1. 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释 度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 2. 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中 性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。 小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀， 待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平 板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
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食品营养与检测专业教学资源库
平板培养
15 mL～20 mL 冷至46 ℃ 加3 mL～4 mLVRBA覆盖平 板表层
1mL
培养基与样液 充分混匀 每个稀释度 接种2个无 菌平皿，每 皿1 mL 15 mL～20 mL 冷至46 ℃
结晶紫中性 红胆盐琼脂 （VRBA）
待琼脂凝固后 加3 mL～4 mLVRBA覆盖平 板表层 待琼脂凝固后
— 4—
谢谢
无菌生理 盐水 1mol/LNaO H 溶液 1mol/LHCl 溶液
氯化钠 蒸馏水 NaOH 蒸馏水 HCl 蒸馏水
8.5g 1000mL 40.0g 1000mL 90mL 1000mL
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食品营养与检测专业教学资源库
过渡页 样品的稀释
三
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食品营养与检测专业教学资源库
样品稀释
样品 类型
盛有225mL 磷酸盐缓冲液或 生理盐水的无菌均质杯内
1：10样品匀液
1mL 1mL 9mL 无理 冲 磷 菌盐 液 酸 试水 或 盐 管的 生 缓 1：1000样品匀液
9mL 无理 冲 磷 菌盐 液 酸 试水 或 盐 管的 生 缓
无理 冲 磷 菌盐 液 酸 试水 或 盐 管的 生 缓
1：100样品匀液
过渡页 检测药品的配制
二
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食品营养与检测专业教学资源库
培养基和试剂 名称 物料名称
蛋白胨 酵母膏
乳糖 结晶紫 中性红 氯化钠 胆盐琼 胆盐或3号胆 脂(VRBA) 盐 中性红 结晶紫 琼脂 蒸馏水
用量
7.0g 3.0g
10.0g 5.0g 1.5g 0.03g 0.002g 15g~18g 1000mL
选取2个～3 个适宜的连 续稀释度 无菌生 1mL 理盐水
36 ℃±1 ℃ 培养18 h～ 24 h
空白对照
空白对照
36 ℃±1 ℃ 培养18 h～ 24 h
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食品营养与检测专业教学资源库
过渡页 平板菌落数的选择
五
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平板菌落数的选择 选取菌落数在15～150cfu之间的平板，分别计数平板上出现的典型和 可疑大肠菌群菌落（如菌落直径较典型菌落小）。典型菌落为紫红 色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大，最 低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。
注意事项
1.从制备样品 匀液至样品接 种完毕,全过 程不得超过 15min。 2.1:10的样品 匀液的pH 应 在6.5~7.5之 间,必要时分 别用 1mol/LNaOH 或1mol/L HCl 调节。
液体 样品
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样品稀释
均质、振荡均匀 1mL
25g或25ml检样
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目录页
一
检测设备的准备 检测药品的配制 样品的稀释 平板培养 平板菌落数的选择 验证试验
二 三
四
五
六
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食品营养与检测专业教学资源库
过渡页 检测设备的准备
一
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食品营养与检测专业教学资源库
设备及条件 名称
恒温培养箱 冰箱 恒温水浴箱 天平 均质器 振荡器
配制说明
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH 至7.4±0.1。煮沸2min,将培养基融 化并恒温至45 ℃~50 ℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3h。
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培养基和试剂
名称
煌绿乳糖 胆盐(BGLB) 肉汤
物料名称
蛋白胨 乳糖 牛胆粉溶液 0.1%煌绿水溶液 蒸馏水
1:100
用 1mL 无菌吸管 或微量移液器吸 取1∶10样品匀液 1mL,沿管壁缓缓 注入9mL磷酸盐缓 冲 液或生理盐水 的无菌试管中(注 意吸管或吸头尖 端不要触及稀释 液面),振摇试管 或换用1支1mL 无 菌吸管反复吹打, 使其混合均匀,制 成1∶100的样品 匀液。
其他稀释度
根据对样品 污染状况的 估计,按上述 操作,依次制 成十倍递增 系列稀释样 品匀液。每 递增稀释 1 次,换用1支 1mL无菌吸管 或吸头。
用量
10.0g 200mL 13.3mL 800mL
配制Biblioteka Baidu明
将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL 蒸馏水中,加入 牛胆粉溶液200 mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于 200mL 蒸馏水中,调节pH 至7.0~7.5),用蒸馏 水稀释到975mL,调节pH 至7.2±0.1,再加入 0.1% 煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到 1000mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的 试管中,每管 10mL。121 ℃高压灭菌15min。
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培养基和试剂 名称
磷酸盐缓 冲液
物料名称
磷酸二氢钾 蒸馏水
用量
34.0g 500mL
配制说明
贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中, 用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶 液调节pH 至 7.2±0.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。 稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏 水稀释至1000mL,分 装于适宜容器中, 121 ℃高压灭菌15min。 称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌 15min。 称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。 移取浓盐酸90mL,用无菌蒸馏水稀释至1000mL。
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过渡页 证实试验
六
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食品营养与检测专业教学资源库
证实试验 从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃ 培养 24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
条件
36 ℃±1 ℃ 2 ℃~5 ℃ 46℃±1℃ 感量0.1g 无特殊要求 无特殊要求
无菌吸管
无菌锥形瓶 无菌培养皿
1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头
500mL 直径90mm
pH 计或pH 比色管或精密 pH 试纸
菌落计数器
无特殊要求
无特殊要求
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固体 和半 固体 样品
稀释方式 1:10
称取25g样品,放入盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌均质杯 内 ,8000r/min~10000r/min均 质1min~2min,或放入盛有 225mL磷酸盐缓冲液或生理盐 水的无 菌均质袋中,用拍击式 均质器拍打1min~2min,制成 1∶10的样品匀液。 以无菌吸管吸取25mL样品置盛 有225mL磷酸盐缓冲液或生理 盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置 适当数量的无菌玻璃珠)或其 他无菌容器中充分振摇或置于 机械振荡器中振摇,充分混匀, 制 成1∶10的样品匀液。
1：100样品匀液
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过渡页 平板培养
四
1. 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释 度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 2. 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中 性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。 小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀， 待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平 板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
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平板培养
15 mL～20 mL 冷至46 ℃ 加3 mL～4 mLVRBA覆盖平 板表层
1mL
培养基与样液 充分混匀 每个稀释度 接种2个无 菌平皿，每 皿1 mL 15 mL～20 mL 冷至46 ℃
结晶紫中性 红胆盐琼脂 （VRBA）
待琼脂凝固后 加3 mL～4 mLVRBA覆盖平 板表层 待琼脂凝固后
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谢谢
无菌生理 盐水 1mol/LNaO H 溶液 1mol/LHCl 溶液
氯化钠 蒸馏水 NaOH 蒸馏水 HCl 蒸馏水
8.5g 1000mL 40.0g 1000mL 90mL 1000mL
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过渡页 样品的稀释
三
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样品稀释
样品 类型
盛有225mL 磷酸盐缓冲液或 生理盐水的无菌均质杯内
1：10样品匀液
1mL 1mL 9mL 无理 冲 磷 菌盐 液 酸 试水 或 盐 管的 生 缓 1：1000样品匀液
9mL 无理 冲 磷 菌盐 液 酸 试水 或 盐 管的 生 缓
无理 冲 磷 菌盐 液 酸 试水 或 盐 管的 生 缓
1：100样品匀液
过渡页 检测药品的配制
二
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培养基和试剂 名称 物料名称
蛋白胨 酵母膏
乳糖 结晶紫 中性红 氯化钠 胆盐琼 胆盐或3号胆 脂(VRBA) 盐 中性红 结晶紫 琼脂 蒸馏水
用量
7.0g 3.0g
10.0g 5.0g 1.5g 0.03g 0.002g 15g~18g 1000mL
选取2个～3 个适宜的连 续稀释度 无菌生 1mL 理盐水
36 ℃±1 ℃ 培养18 h～ 24 h
空白对照
空白对照
36 ℃±1 ℃ 培养18 h～ 24 h
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过渡页 平板菌落数的选择
五
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食品营养与检测专业教学资源库
平板菌落数的选择 选取菌落数在15～150cfu之间的平板，分别计数平板上出现的典型和 可疑大肠菌群菌落（如菌落直径较典型菌落小）。典型菌落为紫红 色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大，最 低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。
注意事项
1.从制备样品 匀液至样品接 种完毕,全过 程不得超过 15min。 2.1:10的样品 匀液的pH 应 在6.5~7.5之 间,必要时分 别用 1mol/LNaOH 或1mol/L HCl 调节。
液体 样品
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样品稀释
均质、振荡均匀 1mL
25g或25ml检样