实验二 饮料中大肠菌群的测定

EMB（伊红美蓝琼脂）
蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 磷酸氢二钾 2.0g 琼脂 15.0g 伊红γ 0.4g 美蓝 0.065g 或20ml 伊红γ (20g /L)和 10ml 美蓝(6.5 g /L) 蒸馏水 1000.0mL 最终pH7.1±0.2 (25℃)
先将蒸馏水中加入磷酸氢二钾及蛋白胨、乳糖使之溶解，后 加琼脂加热溶解，再调pH=7.2-7.4,再加入伊红,美蓝水溶液, 高压灭菌115℃、15分钟。
乳糖胆盐发酵培养基：P99
蛋白胨20g、胆盐5g、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、 蒸馏水1000ml（将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正PH值 至7.4，加入指示剂）；或购买制好的乳糖胆盐发酵培养基、 按说明配置。分装试管，每管10ml，并放入一个到气管（杜氏 小管），高压灭菌115℃、15分钟。 双料乳糖胆盐发酵培养基除蒸馏水外，其它成分加倍。
大肠菌群和大肠杆菌的关系
耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养基中35/37 ℃ 培养48h产 酸产气，并在44.5℃培养24h产酸产气的细菌（依据ISO标准）
卫生学意义
大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪 便污染指标。 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病 菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。 大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康 危害性的大小。 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预 示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指 示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测 作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
大肠杆菌的生物学特性
基本形态：
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约 0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或
成双，但不呈长链排列。约50%的菌株
有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般 不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株
有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成
芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰 氏染色阴性。
GB4789.3-2010 大肠菌群计数
GB4789.3-2010 大肠菌群计数
（一）最先准备的器材
规格名称 1、500ml三角瓶 2、250ml三角瓶 3、18×180mm试管 4、18×180mm试管 5、1ml移液管 6、10ml移液管 7、直径为90mm平皿 8、250ml量筒 9、玻璃珠：直径约5mm 数量 1个 1个 9支 3支 5支 3支 2套 1支 用途 稀释样品 制EMB琼脂 单料乳糖胆盐发酵管 稀释样品（9ml）
2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易
在生理盐水中自凝；
3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。
大肠菌群及大肠杆菌测定 ——MPN法检验流程（FDA BAM）
检样50g+450ml稀释液 适当十倍稀释样品 选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9ml LST肉汤并加有导管）， 每管接种1mL 35℃ ，24 ± 2h ~48 ± 2h 没有产气管 报告阴性 接种BGLB肉汤管
大肠杆菌的定义
大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科， 归属于埃希氏菌属。 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产 气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验） 为++--或-+--的细菌。 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括 五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌 （EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠 杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。
菌株
菌号
生长情况
菌落
产气肠杆菌 大肠埃希氏菌 肺炎克雷伯氏菌 奇异变形杆菌 鼠伤寒沙门氏菌 金黄色葡萄球菌
ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC
13048 25922 13883 25933 14028 25923
好 好，极好 好 好，极好 好，极好 被抑制
粉红，无光泽 有紫绿金属光泽中心 绿金属光泽，有黑心 无色 无色 －
样品
1.酸奶1 2.鲜奶 3.水样1 4.水样2 5.水样3 6.水样4 7.水样5 8.酸奶2
A1组
酸奶1
A2组
水样1
A3组
水样2
A4组
水样3
B1组
鲜奶
B2组
水样4
B3组
水样5
B4组
酸奶2
三、实验方法与步骤 1、采样及稀释 ①以无菌操作将检样 25g（或 25ml）放于含有 225ml灭菌生理 盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃 珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1：10的均匀稀释 液。固体检样最好用无菌均质器，以 800r/min～1000r/min的 速度处理1min，做成1：10的稀释液。 ②用 1ml灭菌吸管吸取 1：10稀释液 1ml，注入含有 9ml灭菌生 理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释 液，换用 1支 1ml 灭菌吸管，按上述操作依次作 10倍递增稀释 液
制EMB平板
（二）应灭菌消毒的器材
剪刀1把 不锈钢药匙1把 滴管胶头5只 称量纸适量
（三）应制备的培养基
培养基

总量
所用容器
500ml三角瓶 18×180mm试管（稀释样品） 10ml/ 9支 18×180mm试管(装杜氏小管 ) 250ml三角瓶（每 组配一瓶）

蒸馏水 225ml 蒸馏水 9ml/ 3支 27ml 乳糖胆盐发酵管（单料）： 100ml EMB琼脂： 1瓶 150ml
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB平板典型大肠杆 菌菌落特征：
中心黑色或紫红色，有 或无绿色金属光泽
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB是一种弱选择性培养基，一些球
菌也可在该培养基上生长； 高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养 基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动 培养基可以恢复原有的正常紫色，倾 注平板前应先摇匀； 大肠杆菌在该培养基上并不一定总是 呈现绿色的金属光泽； 该培养基受可见光易使其中的成分氧 化，储存及培养细菌时都应在避光条 件。 弗氏志贺氏菌 鼠伤寒沙门氏菌 无色 无色 大肠埃希氏菌 紫黑色，有绿色 金属光泽
一、实验目的 1、学习饮料中大肠菌群检测程序、方法； 2、掌握饮料中大肠菌群检测结果的报告方式。 二、实验材料 1、设备和材料 温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、 平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针 2、培养基及试剂 乳糖 —胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、靛基质试剂、 麦康凯、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液
大肠杆菌的生物学特性
培养特性：
大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培 养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能 生长，生长温度范围15-46 ℃。

在普通营养琼脂上有3种菌落形态：
1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；
产气量与倒管：
在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小）， 有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量， 多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产 气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有 气体产生，而应作进一步试验。
蛋白胨提供细菌生长发育所需的氮源、维生素和氨基酸，乳糖提供发酵 所需的碳源，磷酸氢二钾维持缓冲体系，伊红Y和美蓝抑制绝大部分革兰 氏阳性菌的生长。琼脂是凝固剂。 大肠杆菌在EMB上发酵乳糖，形成黑色菌落，大部分有金属光泽。沙门 氏菌形成无色菌落。金黄色葡萄球菌基本上不生长。
质控： 此培养基呈紫色，可有细微沉淀。质 控菌株接种后，35℃培养18～24小时， 观察结果应如下表所示：
说明： （1）伊红又称署红或四溴荧光素，为酸性染料。美蓝又称亚甲蓝，为碱 性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时，细菌带正电荷，染上红色，再与美蓝 结合而形成紫黑色菌落，并有绿色金属光泽。二者除了作为指示剂外，还有 抑制格兰氏阳性菌的作用。 （2）在碱性环境中，不分解乳糖产酸的细菌不着色。伊红、美蓝不能结 合，故沙门氏菌和志贺氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。 （3）此培养基用于鉴别大肠杆菌及产气杆菌，并可快速鉴定白色念珠菌 及鉴定凝固酶阳性葡萄球菌。美国公共卫生协会和美国细菌协会推荐，用于 增殖或鉴别大肠杆菌的检查。但某些沙门氏菌、志贺氏菌可被抑制。培养基 保存应注意避光防止氧化。
大肠杆菌测定——生化鉴定
Test Indole positive negative biotype1 红色环 不变色 + biotype2 reagent Kovacs’
MR
红色
不变色
+
+
甲基红
V-P
玫瑰红 色环 生长
不变色
-
-
V-P甲、 乙液 -
Citrate
不生长
-
-
实验二 饮料中大肠菌群的测定
大肠杆菌测定——革兰氏染色
基本步骤：
将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液， 染1min，水洗；
滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；
滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色 液被洗掉，不要过分脱色，水洗；
滴加番红复染液，复染1min，水洗、待 干、镜检。 结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴 性菌呈红色。
菌名
菌落形态
肺炎克雷伯氏菌
阴沟肠杆菌
粉色，中心色深
粉色，中心色深
ห้องสมุดไป่ตู้粪链球菌
无色
大肠杆菌测定——革兰氏染色
基本原理：
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。 1884年由丹麦医师Gram创立。此法可将细菌分为革兰氏阴性菌 和革兰氏阳性菌两大类。
革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构 的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖 的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增加了 细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结 果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性 菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙 醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞 仍保留初染时的颜色。
查MPN表报告结果
（大肠菌群）
大肠菌群测定——MPN法检验几点说明
MPN检索表： MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释， 加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近 似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增 加10倍。 初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培 养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。 LST中提供了磷酸盐缓冲 体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖 肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slow lactose fermentations）”来促进菌体产气。BGLB中胆盐和 煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数 据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检 测工作中，证实试验是必需的。
35 ± ℃ ，48 ± 2h
有产气管
接种EC肉汤
24 ± 2h ~48 ± 2h
44.5 ±0.5 ℃ （水浴培养） 产气管接种EMB平板（35℃、18~24h） 从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜 面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接 种LST复检产气 查MPN表报告结果（大肠杆菌）
③根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三 个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。 10， 100, 1000 倍稀释（-1，-2，-3）
2. 乳糖初发酵试验 即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发 酵乳糖产生气体的细菌。 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上 者，用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及1ml以下者，用单料乳糖 发酵管。每一个稀释度接种 3管，置（ 36± 1） 0C温箱内，培 养（24±2 ）h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告 为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行