举例说明诱变育种

微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以培育优质、高产的微生物菌株十分必要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为途径之一的诱变育种一直被广泛应用。

诱变育种的主要步骤：

出发菌株留档资料

↑

原种（出发菌株）→分离纯化、筛选→斜面→同步培养→离心洗涤→玻璃珠震荡打散→过滤→单细胞或孢子悬浮液→诱变处理→后培养→平板分离→斜面→初筛→复筛→分离、筛选→保藏及扩大试验。

例如，抗霉素生产菌的诱变育种

抗霉素产生菌Streptomyces sp．FIM一041 14，经紫外-氯化锂复合处理，筛选得到一株高产菌No．1-095，其抗霉素摇瓶发酵效价为170mg ／L，且遗传稳定性良好。经发酵过程工艺优化，菌株No．1—095摇瓶发酵效价i盘220mg／L，较出发菌株FIM-04114提高T63．O％。在50L自动发酵罐上发酵，抗霉素效价蔓J206mg／L。

A mutant strain No.1—095 with higher potency(170mg／L)and better hereditary stability was obtained by combination treatment of UV and LiCl from antimycin producing strain

FIM-04114．After the fermentation conditions of strain No．1

—095 in shake flask were optimized，the antimycin yield of the strain was 220mg／L，which was 63.0％higher than the original strain FIM-04114．The potency ofstrain No.1—095 was 206mg／L in a 50L bioreactor．

抗霉素(antimycin)是一族多组分混合物，具有相同的九元环双内酯母核，但侧链结构不同，A3是最主要的组分。可以从土壤、无定形海绵、药用植物及马铃薯表皮破损处分离到抗霉素产生菌。自20世纪40年代作为抗真菌活性物质被发现以来，抗霉素越来越引起人们的重视。由于还具有抗癌、心脏保护、抑制线粒体呼吸等作用，抗霉素已成为生命科学研究的重要工具。

为了提高抗霉素发酵水平，采用紫外线和氯化锂复合诱变处理，筛选到1株既高产，又稳定的突变株No.1-095，并对该菌株进行发酵工艺优化，使效价进一步提高。

l材料和方法

1.1 出发菌株：抗霉素产生菌Streptomyces sp.FIM一04114，福建省微生物研究所保存。

1.2 培养基：

斜面培养基和分离培养基(％)：可溶性淀粉2.0，L一天冬素0.05，KN0 30.1，K2HP04·3H20 0.05，NaClO.05，MgS04·7H20 0.05，琼脂1.8，CaC03 O.05，pH7.4-7.5。

种子培养基(％)：豆粕粉4.0，葡萄糖2.0，(NH4)2S04 0.3，CaC03 0.15，pH 7.0。

发酵培养基(％)：豆粕粉1.5，可溶性淀粉4.0，葡萄糖1.5，硫酸

铵0．5，碳酸钙1.0，pH 7.0。

1.3 诱变方法

1.3.1 孢子悬液的制备：用无菌生理盐水将茄形瓶中的抗霉素产生菌FIM．04114孢子洗下，置于装有玻璃珠的三角瓶中，振荡30min，使孢子分散。用已灭菌的装有脱脂棉的漏斗过滤除去菌丝，无菌生理盐水稀释，制成孢子悬液，孢子(个数)浓度控制在105／mL。

1.3.2 氯化锂化学诱变：吸取制备好的孢子悬液0.1mL，涂布于含不同浓度氯化锂分离平板上，28℃培养5d。

1.3.3 紫外线与氯化锂复合诱变：取5mL上述孢子悬液加入平皿，在30W紫外灯下(距离30cm)照射5，10，15，20和25s，各吸取0.1mL涂布于含0．30％的氯化锂分离平板上，28℃培养5d。

1.4 筛选分离：从各分离平板上挑取白色丰满的单菌落转接于斜面，28℃培养7d，通过摇瓶发酵确定高产菌株。

1.5 摇瓶培养

1.5.1 种子培养：将菌株孢子接种于种子培养基(60mL／500mL三角瓶装量)，26℃，250r／min振荡培养24h。

1.5.2 发酵培养：种子培养基1.8mL移入发酵培养基(60mL／500mL 三角瓶装量)，28℃，250r／min振荡培养120h，进行效价测定。

1.6 遗传稳定性试验：将菌株在斜面上连续传五代，通过摇瓶发酵测定各代菌株的产量，以确定遗传稳定性。

1.7抗霉素的检测

1.7.1 发酵液提取：吸取2mL发酵液，10000r／min离心1 0min，弃去上清液。菌丝沉淀物用2mL甲醇振摇抽提20min后，于10000r／min

离心10min，取上清液置5mL试管中。菌丝沉淀物再用2mL甲醇抽提一次，合并2次抽提液进行效价测定(HPLC法)。

1.7.2 HPLC检测：仪器：LC一2010A高压液相色谱仪(日本岛津公)；色谱柱：Nucleosil C18 (4．6mm× 250mm,5μm)；流动相：甲醇：水(80：20)；流速：lmL／min；检测波长：227nm；柱温：40℃。

1.8 50L自动发酵罐发酵验证：斜面孢子接入种子培养基，于26℃、250r／min振荡培养24h后，以1．2％接种量接入发酵培养基(装量30L／50L），28℃发酵120h后，检测抗霉素效价(HPLC)。发酵前期通气量为l：1VVM，搅拌转速为250r／min。发酵中后期通气量调至1．5：1VVM，搅拌速度为300r／min。

2 结果与分析

2.1氯化锂诱变剂量的选择：对抗霉素产生菌FIM．04114进行氯化锂诱变处理，考察不同诱变剂量的致死率，结果见图l，氯化锂含量为0．25％、0．30％和0．35％时，对应的致死率为30％、49％和98％。为了与紫外线照射复合处理，选取氯化锂作用的致死率为49％的剂量(0．30％)进行处理。

2.2 紫外线与氯化锂复合诱变：经不同时间紫外处理的孢子悬液涂布于含0．30％氯化锂平板上，28"C培养5d，计算致死率。结果见图2。从图2可见，致死率与紫外诱变剂量成正相关。本试验采用致死率为84％的剂量进行紫外一氯化锂复合诱变。

2.3 突变株的筛选：通过上述诱变处理得到菌株200多株，经摇瓶发酵，测定效价，获得17株效价较高的菌株。对这17株菌株进行复筛(每株3瓶，取平均值)，其中4株效价比出发菌株FIM．04114高20％以上。以