蛋白乳化活性与分子结构的关系

蛋白乳化活性与分子结构的关系齐军茹　彭志英(华南理工大学食品与生物工程学院,　广州510640)摘要:本文从蛋白分子二硫键以及非共价作用两方面综述了蛋白分子的柔韧性与蛋白乳化活性的关系。

讨论了设计新的蛋白乳化剂的研究方向。

关键词:蛋白,乳化活性,柔韧性,变性Relationship Between the Emulsifying Activity ofProtein and I t’s Molecular StructureQ i Junru,Peng Zhiying(F ood and Biological Engineering C ollege,S outh China University of T echnology,G uangzhou510640)Abstract:The relationship between flexibility and emulsifying activity was investigated by disrupting disulfide bonds and nonco2 valent interactions of the protein,and direction of research for the design of novel protein emulsifiers are discussed.K ey w ords:Protein,Emulsifying activity,Flexibility,Denaturation 蛋白质的柔韧性是影响其乳化性质的重要方面。

在溶液中,蛋白质的疏水端通常包裹在分子内部。

为了形成乳化,蛋白质的疏水端应该定位在油相界面中。

因此,如何使蛋白质构象展开(即变性)来暴露其疏水端是影响其乳化效果的关键。

蛋白质的三维空间结构由其共价和非共价作用来维系,共价作用主要是二硫键,包括分子外和分子内部的二硫键。

改变二硫键可以改善蛋白的乳化性质,一般有几种途径。

例如,化学法还原大豆球蛋白的二硫键可升高其乳化性和起泡性[1,2],进一步的研究表明自由的硫羟基团被烷基化后可以防止二硫键重新形成,该功能改善可能引起构象变化,且导入的烷基基团也会影响其升高的疏水性质。

另外,利用重组DNA技术来消除半胱氨酸残基也是一种改善的方法。

溶菌酶分子结构中去除半胱氨酸残基提高了乳化活性和乳化稳定性[3]。

但是,用其它的氨基酸来代替大豆球蛋白中的半胱氨酸残基(去除一个或两个)以便去除二硫键,结果并没有使大豆蛋白的乳化性升高,这可能是由于剩余的半胱氨酸残基仍参与了分子间二硫键的形成。

蛋白质的柔韧性同时也受到非共价相互作用的影响,诸如氢键、范德华力、静电引力以及疏水作用。

首先热变性可以破坏非共价作用,所以蛋白经过加热能够改善其乳化性质,但是其溶解性质有所降低,因为包埋在蛋白分子内部的疏水基团暴露在外[4];另外,化学变性,诸如脲,一直被用来研究变性蛋白在静态界面的作用[5]。

这些研究对于探讨蛋白质吸收现象是非常有价值的,但是值得注意的是将其影响效果外推至基于食品的乳化液中是存在疑问的[6]。

大家都知道,食品工业中乳化液的形成需要均质,此时赋予了体系大量的机械能。

因此,乳状液中蛋白在油水界面吸咐作用并非属于扩散控制,而对于蛋白与界面相互作用的最初阶段的分析属于静态研究[7]。

25本文从破坏二硫键和非共价相互作用两个方面来表述蛋白在稳定水包油乳状液的能力。

尽管一些化学试剂并不能作为食品添加剂,但是它们提供了一种途径来阐明蛋白柔韧性对于蛋白质乳化活性的重要,并提出蛋白结构与功能的关系。

1　影响蛋白质作为乳化剂的因素在没有变性剂存在时,蛋白的乳化活性差别很大。

例如,天然的溶菌酶乳化活性很差(其可以稳定液滴大小为51.5μm),而脱辅基红蛋白效果相对较好(稳定液滴大小为7.6μm)。

另外,研究表明,β-酪蛋白具有高度的表面活性[8]。

这说明蛋白结构与乳化性能的关系与蛋白分子的柔韧性、分子大小、表面疏水性、净电荷以及氨基酸组成有关[9]。

1.1还原二硫键对蛋白乳化活性的影响分子中没有存在二硫键的蛋白(如脱辅基红蛋白、β-酪蛋白和大部分的α-酪蛋白)其乳化活性不受二硫苏糖醇(DTT)的影响,蛋白分子中含有二硫键时,通过DTT还原后,其乳化活性通过改变蛋白构象暴露内部的疏水基团而得到改善。

在这里溶菌酶非常典型,它属于分子较小的球蛋白,分子中含有四个二硫键。

在有DTT存在时,其乳化活性显著提高。

所以二硫键可能是提高该蛋白乳化活性的重要因素。

溶菌酶分子中两个二硫键的形成跨过129个碳链长,氨基酸残基6与127以及氨基酸残基30与115,因此,这两组二硫键可能在维持折叠的、三维结构的溶菌酶中起了很重要的作用。

这种假设可以通过以下实验得到证实,即用基因工程方法将溶菌酶分子中的75与94位形成的二硫键去除,并没有明显提高蛋白的乳化活性[3]。

但去除6与127位和30与115位形成的二硫键其蛋白乳化性将会发生显著的变化。

有些蛋白如牛血清清蛋白(BS A)、β-乳球蛋白和κ-酪蛋白并没有像溶菌酶一样的特性,这种反常的行为可能是由于这些蛋白中具有特殊的性质。

BS A是小分子蛋白具有17组二硫键,通过庚烷/水缓冲液界面测其动界面张力,表明天然的BS A具有高的表面活性[5]。

DTT的存在只能稍微改善天然BS A的乳化活性。

这说明天然BS A的构象本身有益于乳化作用,即有益于BS A与脂肪连接并且可在体内传递蛋白[10]。

另外一种可能是BS A中的二硫键不易接近DTT,因为有研究证实, BS A中二硫键不易接近巯基乙酸(另一种还原剂)[11]。

另外,DTT对于β-乳球蛋白的乳化活性具有负面效应。

β-乳球蛋白有两组二硫键,而DTT的加入反而增大了液滴体积,从30μm升高到40μm。

天然的β-乳球蛋白结构包含有一个非极性配位键的结合部位,这种结合部位是由含有疏水性氨基酸侧链组成的孔穴(袋)。

它可以鳌合小的非极性的分子,比如来自外部水相系统中的视黄醇(维生素)[12],β-乳球蛋白疏水孔穴中包括两个半胱氨酸残基,其中一个参与形成二硫键(119或121位),该二硫键的断裂会导致疏水孔穴的塌陷,因此DTT 的存在会产生强烈的分子内作用力以及一系列的负面影响从而导致乳化活性降低。

κ-酪蛋白具有稳定酪蛋白胶束形成和防止钙沉淀的生理作用,其分子中两个半胱氨酸残基参与形成分子间二硫键,导致从单体结构向多体结构变化[13]。

DTT对于乳化活性的破坏作用在于破坏了蛋白的多体结构,而这种结构对于乳化活性非常重要。

天然的单体几乎没有疏水区域使其有效的指向油/水界面,仅在多个κ-酪蛋白分子结合后出现明显的疏水区域时才表现出优越的乳化活性。

这与以前的研究报道相一致,Rasmussen指出,κ-酪蛋白的多体结构更有效的覆盖酪蛋白形成的胶束表面,因此稳定了胶束结构。

总之,二硫键的还原并没有使所有蛋白的乳化活性提高,蛋白的生理作用、通过二硫键的形成导致肽链长度的扩展;以及它们的可接近程度都影响到还原二硫键对乳化活性变化的效果。

1.2　破坏非共价相互作用对蛋白乳化活性的影响除了BS A,对于其它蛋白质,脲可以通过破坏蛋白分子的非共价作用来提高蛋白质的柔韧性。

对于一些蛋白来说(如脱辅基血红蛋白,溶菌酶和κ-酪蛋白)加入脲来提高蛋白的乳化活性可能是通过破坏分子内的非共价键(诸如二级结构和三级结构);对于其它蛋白如α-酪蛋白、β-酪蛋白和β-乳球蛋白来说可能是通过破坏分子间的非共价键(四级结构)。

以上研究结果说明蛋白的二级、三级和四级结构对于维持天然蛋白结构是非常重要的。

比如说,加入脲可以提高κ-酪蛋白的乳化活性,这正说明35了非共价作用对于维持蛋白三级结构的重要性。

在这种情况下,κ-酪蛋白的多体结构几乎不受影响,但是可以改变分子中的疏水区域使其有更好的自由去指向油滴。

值得提出的是,脲的存在对于溶菌酶乳化活性的改善不如DTT效果明显。

因此,从这一方面来说,与非共价作用相比,二硫键对于维持溶菌酶白三维结构起了更重要的作用。

由于脲的存在破坏了自缔合作用使α-酪蛋白和β-酪蛋白乳化活性得到改善[14].这样使疏水区域吸附油滴而不是指向其它酪蛋白分子。

并且,脲通过破坏β-酪蛋白的自缔合作用可以使单体吸附在油相,减少桥连聚沉。

对于β-乳球蛋白来说,非共价作用稳定了三级结构并且促使形成了非共价连接体。

通过脲对非共价键的作用导致蛋白乳化活性的改善。

脲对脱辅基血红蛋白的作用只能稍微改善它的乳化活性,这可能是由于天然的蛋白与变了性的蛋白表面疏水能力相似。

有报道说变了性的脱辅基血红蛋白吸附油相时的构象与天然蛋白几乎相同[15]。

脲的作用可以改善一些蛋白的乳化活性,但对于BS A却恰恰相反,反而降低了乳化活性,即脲变性了的BS A比天然的BS A乳化活性有所降低[16]。

这可能是由于天然的BS A具有更多的三级结构使其可以形成稳固的、高粘合度的界面膜。

同样溶菌酶也具有相似的效应。

溶菌酶溶液中没有脲存在时,最初升高表面压力的速度要比有6M或9M脲存在的蛋白溶液要快[5]。

因此,就BS A来说,脲的加入降低了疏水基团吸附油相的推动力。

另外,脲还能通过破坏非共价三级折叠结构,而对于天然BS A来说,这种结构恰恰可以形成脂结合位点[10]。

2　还原与变性剂共同作用对蛋白乳化活性的影响DTT对二硫键的还原以及脲对非共价键的破坏作用共同作用于蛋白时会导致蛋白缺乏稳定的结构。

理论上说,脲的存在会使所有的二硫键容易接近于DTT,这使得蛋白乳化活性比只有DTT对蛋白作用时得到改善。

即使在蛋白分子中的二硫键全部被还原以及脲使蛋白分子完全变性的情况下,不同蛋白的乳化活性依然有所不同,这说明蛋白的柔韧性并非是影响蛋白乳化活性的唯一因素。

在这种情况下,不同的液滴体积可能是由于蛋白分子中氨基酸组成及序列不同,由于疏水氨基酸可以使分子指向油相,所以氨基酸的平均疏水程度也可能是影响乳化活性的重要因素,然而,关于液滴体积与平均氨基酸疏水度并没有检测到有相关性。

因此,可以得出,蛋白质分子中氨基酸的分配对蛋白乳化活性起了决定作用。

3　改善蛋白乳化活性的途径考虑到蛋白质四级结构对其乳化活性的影响,疏水作用产生的蛋白自缔合作用是限制α-和β-酪蛋白的乳化活性的一个因素。

这些蛋白分子中因为具有相对较大的疏水区域易导致单体蛋白分子间相互作用。

由于该区域的疏水度对于乳化活性的改善非常有效,所以在没有影响乳化活性的前提下降低可以使分子间相互作用趋势减少的疏水程度是可能的。

另外减少疏水区域的大小(如利用基因工程、酶或者化学水解作用)也可以达到同样的效果。

因此,应该在尽量减少自缔合作用同时维持使蛋白具有高效乳化活性的疏水度之间的平衡。

这种平衡在低分子量的表面活性剂型的乳化剂中广泛存在,我们可通过亲水亲油平衡值(H LB)来选择合适的乳化剂[17]。