韩国蜘蛛酶应用方案-付文友2012.4

Relative activity 相对活性(%)
100 63 42 41 41 40
The concentration of TCA-soluble protein released to the supernatant were measured using Bradford method, with bovine serum albumin as the standard. 以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford方法测定释放到上清液中的TCA溶解蛋白质的浓度。
蜘蛛酶（Arazyme）专利：
Acquisition of the KT mark 韩国杰出技术认证
Host Institution : Ministry of Science and Technology 主持单位：韩国科技部 Technology 技术 : High active protease produced by the microbe isolated from the Korean spider 从韩国蜘蛛中分离出的微生物产生的高活性蛋白酶——蜘蛛酶 Date of acquisition : 2002. 3
0 0
Cu2+ 5 10 15 20
Metal concentration (mM) 金属离子浓度
Metal ions：Mn2+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Co2+, and Cu2+ 金属离子：锰、钙、镁、铁、锌 、钴和铜
疑问4解答：金属离子可以激活蜘蛛酶
蜘蛛酶（Arazyme®） 属于金属蛋白酶，是 以Zn2+和氨基酸残基 为活性中心的蛋白酶。 由于含有金属离子活 性位点，金属蛋白酶 活性可以被大多数金 属离子所激活。
蜘蛛酶（原酶，未经过包被处理）
蜘蛛酶热稳定性试验（湿热，模拟制粒）
酶 Test 1 试验1 条件
蜘蛛酶Arazyme (non-coating原酶，未包被) Room temperature（室温）, 80℃, 121℃ Autoclave used 高压灭菌器 (时间：5分钟，压强100KPa) 蜘蛛酶Arazyme(coating，包被) Room temperature（室温）, 80℃, 121℃ Autoclave used高压灭菌器(时间：5分钟，压强 100KPa) Braun & Schmitz Method
Note 相对酶活
100.4% 66.8%
蜘蛛酶Arazyme (Coating，包被)
80℃ 121℃
100.3% 85.3%
客户疑问4：
有些酶制剂受饲料中矿物质所抑制， 蜘蛛酶活性是否会被其所抑制？
金属离子对蜘蛛酶相对活性的影响
Relative activity (%) 相对活性
500 Zn2+ 400 300 200 100
企业简介：
目前，专门研究昆虫源活性物质、处于世界领先水平的国家主 要有法国、日本和韩国（ Insect Biotech 有限公司）。
企业发展历程：
2000年4月： Insect生物技术有限公司成立。
2000年12月：高效蛋白分解酶（蜘蛛酶-Arazyme）的生产技术获得政府资助项目 2001年5月： 企业下设的研究所被韩国产业技术协会认证 2001年8月： 开始建设厂房和研究中心 2001年12月： 获得韩国-巴西合作项目 （微生物杀虫剂的开发） 2002年5月： 蜘蛛酶（Arazyme）获得韩国国家杰出技术认证（科技部） 2002年6月： 批量生产的产房和研究所的建造 ，发酵，纯化系统和BGMP设备 2003年3月： 获BGMP标准认证（韩国食品和药品管理局） 2003年8月： 与德国ATG-biosynthesis 公司就Arazyme在欧盟的销售签定战略协作协议 2003年10月： 与法国HAN Europe 公司就B.A.L在欧盟的销售签定战略协作协议 2003年11月： 与巴西Goldlink do Brasil 公司就饲料添加剂的销售签定战略协作协议 2004年8月16日： 在中国成立分公司。
Meat meal 肉粉 Chile fish meal 智利鱼粉 Korea fish meal 韩国鱼粉 Poultry meal 禽肉粉
养殖中的烦恼？
请用蜘蛛酶（Arazyme®）帮您解决！ 傅文友 博士 18931430111 fuwenyou@163.com
北京中科金澜生物技术研究所 韩 国 英 赛 得 科 技 有 限 公 司
主讲人的工作经历
• 付文友,黑龙江人,东北农业大学毕业。1997年在农业 部饲料工业协会工作,任科教司技术专员。 • 2002年，任美国康地（北京）公司技术经理，负责 猪产品教槽料、预混料、浓缩料、全价料技术配方 工作。 • 2004年应邀加盟正大集团，任华北区技术副总裁， 负责华北区六家公司技术配方和市场服务工作。 • 2008年,任湖北武汉饲料添加剂集团技术总监，开展 对酶制剂应用工作,对饲料酶的应用有独到的技术理 论和观点。 • 2010年,是北京中科金澜生物技术研究所首席饲料配 方师，专注为农牧饲料企业服务。
1-1-1、蜘蛛酶对鸡羽毛中角蛋白的降解
A A : Control （对照组,纯水）
B
B : Treatment of Arazyme（蜘蛛酶处理组）pH 8, 37 ℃, 处理2周
1-1-2 Test method of Industrial scale（工业测试）
韩国 R&D Center, Insect Biotech
Surface of Feather meal by electron microscope (SEM) 水解羽毛粉表面（电子显微镜，SEM）
1-1、相同酶解工艺下蜘蛛蛋白酶解液与木瓜蛋白 酶酶解液中的肽键含量的比较
12
肽键含量（mmol/g）
10.365
10 8 6 4 2 0 Arazyme蛋白酶 酶种类 木瓜蛋白酶
酶 Test 2 试验2 条件
测试方法
蜘蛛酶热稳定性试验结果：
Enzyme 酶 蜘蛛酶Arazyme (non-Coating 原酶，未包被)
Temperature 温度 Control对照组 80℃ 121℃ Control对照组
Activity 酶活 79,666.4 u/g 80,010.3 u/g 53,217.2 u/g 718.5 u/g 720.4 u/g 612.8 u/g
Diets 日粮 Arazyme 含量 (w/v) 0 0.1 0 0.1 0 0.1 0 0.1 Degree of hydrolysis (mmol/g-protein) of various reaction time (h) 各时间点的水解程度 0.5 0.12 0.19 0.17 0.23 0.09 0.15 0.17 0.23 6 0.12 0.38 0.21 0.42 0.14 0.35 0.21 0.44 12 0.12 0.38 0.21 0.42 0.14 0.35 0.21 0.44 24 0.35 0.52 0.32 0.68 0.14 0.70 0.32 0.54 48 0.35 0.52 0.54 0.84 0.28 0.70 0.34 0.54
1-1、蜘蛛酶对不同底物水解性能的研究：
Degradation of various protein substrate 蜘蛛酶对不同底物水解性能的比较
Substrate 底物
鸡蛋清白蛋白Albumin (egg) 酪蛋白Casein 血色素Hemoglobin 弹性蛋白Elastin 角蛋白Keratin 凝胶Gelatin
酶解液清除羟自由基(·OH)活性比较
酶解液清除超氧阴离子自由基(O2·-)活性比较
（1）最佳酶解工艺是指：酶解时间5h， 酶解温度37℃， 加酶量500U/g， 料水比1：20， 摇床 转速150rpm； 底物为地鳖虫； （2）清除羟自由基测定方法采用采用邻二氮菲法；清除超氧阴离子自由基测定方法采用采用邻 苯三酚法。
5.213
（1）相同酶解工艺是指：相同的酶解时间（5h）、相同的加酶量（500U/g）、相同的 摇床转速（150rpm），底物为地鳖虫（满足各自酶所要求的pH、温度条件）； （2）肽键含量测定方法采用TNBS方法（用被分解的肽键毫摩尔数来表示）；
1-1、最佳酶解工艺下蜘蛛蛋白酶解液与木瓜蛋白 酶酶解液清除自由基的比较
1-2、蜘蛛酶对饲料原料——豆粕的降解
蜘蛛酶 对豆粕的处理
1-2、蜘蛛酶对豆粕的水解（电泳图）
对照组 0 12 24 3 蜘蛛酶 6 12 h
分 子 量 减 小
1-2、蜘蛛酶对鱼粉的水解（电泳图）
对照组 0 12 24 蜘蛛酶处理组 3 6 12 h
分 子 量 减 小
1-2、蜘蛛酶处理后动物性蛋白的水解程度Alder-Nissen方法(1979) （以单位原料蛋白质中含有的α-氨基基团的mmol数来表示水解程度）
蜘蛛酶的功效：
强大的蛋白分解能力，改善动物消化
有效抑制大肠杆菌等有害菌，减少腹泻
有效消除乳房炎、改善病弱动物生长
1、蛋白酶的作用
1 对底物专一性的研究 2 对饲料原料分解程度的研究 3 对养殖动物消化、生长性能的影响 4 减少氨氮排放，减少对环境的污染
1-1、蜘蛛酶对底物专一性的研究：
酶的专一性：如胰蛋白酶作 用在精氨酸或赖氨酸羧基 端； 蜘蛛酶对底物有着广泛的专 一性，它主要水解19种氨基 酸羧基端形成的肽键，并优 先水解甘氨酸、精氨酸、组 氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、酪 氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸羧 基端形成的肽键。
0h 352.4 -
2h 607.5 72.4 1.72
4h 762.7 25.5 2.16
6h 935.8 22.7 2.65
12h 1075.5 14.9 3.05
18h 1258.9 17.0 3.52
24h 1410.1 12.0 4.00
采用Bradford assay方法对水解羽毛粉中可溶性蛋白进行测定， 标准蛋白采用牛血清白蛋白（BSA）
认证日期：2002.3
Only One in Korea Feed Industry
韩国饲料领域唯一获得KT认证的产品
蜘蛛酶（Arazyme）的发现：
蜘蛛Spider
Symbiotic Microorganism from Spider
蜘蛛体内的共生微生物 A B C
A：巫婆蜘蛛（ Nephila clavata ）显示了强大的消化力。 B：在巫婆蜘蛛肠道内分离出共生微生物HY-3（鞭毛菌） C：共生细菌HY-3 在2%的脱脂乳琼脂平板上的 蛋白分解圈
疑问2解答：原酶在pH5-12保持80%以上
100
Relative activity (%)
80
相对活性
60 40 20 0 2 4 6 8 10 12Leabharlann Baidu
pH
蜘蛛酶（原酶，未经过包被处理）
产品采用韩国首尔大学专利 包被物质进行包被
客户疑问3：
低温环境？饲料厂制粒温度？对酶活的影响
疑问3解答：蜘蛛酶原酶具有较好的温度耐受性
客户疑问1：
如何获得蜘蛛酶？
哪里有那么多蜘蛛？
疑问1解答：我们不培养蜘蛛，而是通过菌株发酵生产蜘蛛酶
选用美国FDA、中国农业部批准 的菌株，液体发酵
2层膜滤（2m和10kDa）
DEAE-纤维素离子交换柱层析
Sephadex G-75凝胶过滤柱层析
纯化的蜘蛛酶（Arazyme）
客户疑问2：
蜘蛛酶是否适合养殖动物消化道pH环境？
康畜宝70产品介绍：
康畜宝70是由世界领先的研发昆虫活性 源物质的韩国生命工学研究院（KRIBB） 所开发研制的，由源自蜘蛛的共生微生 物HY-3所分泌的蜘蛛蛋白酶 （Arazyme®）为主要成分的产品。 进口登记证号：（2009）外饲准字 195号 Arazyme® (spider+enzyme) 아라자임 거미(蜘蛛)+효소(酶) 韩国“巫婆蜘蛛”
2011. 08. 22 ~ 09. 06
0.2%蜘蛛酶（酶活400,000IU/kg）
温度35°C；搅拌速度500rpm；料水比
3:7
测试装置：1L发酵罐 (B.E Marubishi Co., Ltd.生产) 本发酵装置与工业化生产设备相类似
反应时间 蛋白浓度 ug/mL 提高率 % 提高倍数