韩国蜘蛛酶应用方案-付文友2012.4
高效蜘蛛毒素提取纯化及其应用前景
高效蜘蛛毒素提取纯化及其应用前景近年来，随着科技不断发展和进步，人们在各个领域中也得到了更多的技术和装备的支持。
其中，生命科学领域不仅仅是传统的研究、诊断、治疗和预防生命体系疾病的工作，更是涉及到了许多的前沿科技和先进技术的应用。
其中，高效蜘蛛毒素的提取和纯化技术的应用，成为了当下研究生命科学不可忽视的一大重点。
一、高效蜘蛛毒素的提取技术蜘蛛毒素是一种可有可无的化学成分，它能够在蜘蛛身上发挥重要的功能。
蜘蛛毒素有多种表现形式，其中包括低毒素、中毒素和高毒素等。
而这些不同的毒素类型，又能够被分解成更为精细的分类，这具体取决于不同的研究目的。
在使用高效蜘蛛毒素进行分析、研究、治疗和预防等方面，要求毒素的提取方法高效、简便。
目前，主要的蜘蛛毒素提取方法有常温浸提法、冻融法、超音波法、离子交换法、反渗透纯化法等。
尽管不同的方法都有其独特的优劣之处，而顶级的高效提取技术，主要既包括常温浸提法和反渗透纯化法。
常温浸提法主要将蜘蛛放置于含有烷基苯、醇或氯仿等溶液的离心管中，让毒素自行浸泡，然后用离心机将毒素沉淀下来即可；反渗透纯化法则是通过半导膜过滤，将蜘蛛体内的毒素分离出来，再进行表征。
二、高效蜘蛛毒素的纯化技术高效蜘蛛毒素的纯化，是蜘蛛毒素应用的重要环节。
在某些情况下，毒素已经被分离出来，但它的质量和纯度都不尽如人意，需要进行组分分离、提纯、纯化和确定化，以得到高纯度的毒素样品并保证后续应用的安全和稳定性。
常见的蜘蛛毒素纯化方法有：上样电泳法、高效液相色谱法、纸层析法、凝胶过滤技术等。
上样电泳法是将毒素按分子大小进行组分分离；高效液相色谱法是通过高效液相色谱来分离毒素。
最后，采用不同的检测方法以判定毒素纯度。
三、高效蜘蛛毒素的应用前景高效蜘蛛毒素具有多种生物学和药理学特性，在医疗、科学和农业等领域都有广泛的应用前景。
在医疗领域，蜘蛛毒素可以作为镇痛剂、中枢神经系统调节剂、抗肿瘤、抗炎和残留药物等多种药剂的前驱物，尤其是作为治疗癌症和中枢神经系统疾病的重要药物，已经获得了不少的关注和重视。
韩国农作物病虫害防治及生物防治应用技术研究
韩国农作物病虫害防治及生物防治应用技术研究韩国农作物病虫害防治及生物防治应用技术研究与推广考察报告根据中华人民共和国和大韩民国水产合作委员会第一次会议纪要精神，应韩国农林部邀请，由全国农业技术推广服务中心、湖北省植保总站和广东省植保总站组团，于1997年9月25日至10月8日赴韩国进行了农作物病虫害防治及生物防治应用技术研究与推广考察。
在韩期间，我们访问了韩国农林部国际农业局、农业政策室，韩国农村振兴厅技术协力局、技术指导局、农业科学技术院、作物试验场，以及京几道、全罗南道和忠清南道扶馀郡等道、郡的农村振兴院和指导所。
另外，还访问了汉城大学农学院、韩国农药工业协会和庆农(农药)株式会社等涉农单位和部门。
参观了农林部农业技术课、农村振兴厅作物保护课等部门的气象卫星收视系统和病虫信息可视网络咨询服务系统，参观了农业科学技术院及有关道农村振兴院、郡农村指导所有关的研究室、试验场圃，参观了有关道、郡农村振兴院(所)的田间病虫预测圃和观测圃。
访问过程中我们得到了韩国农林部、韩国农村振兴厅的热情接持，尤其是农村振兴厅国际协力局金永相局长、技术指导局崔正坤局长对这次活动非常重视，给我们安排了很正规的接见与座谈，双方在十分友好的气氛中介绍和交流了各自在农业生产及作物保护方面的工作现状和进展，并就今后双方在相关领域开展合作研究达成了初步意见。
考察团全体成员怀着对韩国农业和病虫害管理工作发展的浓厚兴趣和学习借鉴先进经验发展我国农技推广和病虫防治事业的强烈责任感，边看、边问、边讨论，基本摸清了韩国农业生产和病虫防治的情况，圆满地完成了考察任务。
一、韩国农业生产和病虫害发生概况韩国地处北纬33°-43°之间，国土面积993．9万公顷，耕地面积203．3万公顷，占20．45％。
全国人口4454．3万，农户数155．8万家，农业人口516．7万，占全国总人口的10．9％，户均3．3人，耕地1．3公顷。
大米是韩国人的传统食粮，在有限的土地上，政府鼓励优先安排大米生产。
一种提取蜘蛛基因组dna的有效方法
动物学杂志 2007,42(6):64~68一种提取蜘蛛基因组DNA 的有效方法陈国亮 邵爱云 孟 清∗(东华大学生物科学与技术研究所 上海 201620)摘要:介绍了用尿素法提取蜘蛛基因组DNA 。
通过与其他DNA 提取方法相比较,证明尿素法具有可在室温条件下进行、DNA 得率高、完整性好、简单快速等优点。
以提取的DNA 为模板进行PCR 扩增,获得预期大小的、高重复、高GC 含量的编码蜘蛛牵引丝蛋白基因的DNA 片段。
关键词:蜘蛛;基因组DNA ;DNA 提取;PCR 扩增中图分类号:Q 81 文献标识码:A 文章编号:0250⁃3263(2007)06⁃64⁃05A E fficien t M ethod for Extraction of Sp i ders ’G eno m ic DNACHEN Guo⁃L iang SHAO A i⁃Yun MENG Q ing ∗(,, 201620,)A b stract :The presen t paper deals w ith the urea lyses m ethod for isolating sp iders’genom ic DNA s .C om pared to othert w o known m ethods ,th is m ethod produced sp ider genom ic DNA s w ith h igher yields and h igher in tegrity .It is also si m p ler and less ti m e⁃consum ing ,involving on ly room tem perature m an ipu lations .H igh quality genom ic DNA s wereisolated from sp ider by th is m ethod .Certain sp ider dragline gene fragm ents ,wh ich con tain h igh ly repetitive sequences of h igh GC con ten ts ,were successfu lly PCR ⁃am p lified .K ey w ord s :Sp ider ;G enom ic DNA ;DNA extraction ;PCR am p lification基金项目 国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(N o .2006AA 03Z0451);∗通讯作者,E ⁃m ail :m engq ing @dhu .edu .cn ;第一作者介绍 陈国亮,男,硕士研究生;研究方向:生物化学与分子生物学;E ⁃m ail :chenguoliang @m ail .dhu .edu .cn 。
蜘蛛酶对僵猪、弱仔猪生长性能的影响
试 验采 用 单 因子 随 机 区组 试 验 设计 ， 据 窝 重 、 根 每窝 仔猪 数 、 猪整 齐相近 的原则 ． 仔 选用 同一天 断奶 且 同一天转 入保 育舍 的健 康 断奶 仔猪 （ ８日龄 断奶 ） ２ 为正 常 对照 组 ． 挑
成 两 个 组 ： 仔 猪 、 猪 加 酶组 和 弱仔 猪 、 猪 对 照 组 。 弱 僵 僵 另
的畜 禽用 饲料 添 加剂 ， 主要 成分 为高 效 蛋 白酶 蜘蛛 酶 其 是蜘 蛛 消化 道 内 的共 生微 生物 （ 一 ） 分泌 的一 种 高活 ＨＹ ３ 所
性 金 属 蛋 白 酶 ． 与 目前 市 场 上 常 用 的 蛋 白酶 相 比 除 具 有 其 更 强 大 的 蛋 白分 解 能 力 外 ． 具 有 耐 受 高 温 的 特 点 ． 且 还 而 动 物 日粮 中 的 大 部 分 二 价 金 属 离 子 （ Ｆ ｚ、ｎ＋Ｃ “、 如 ｅ．Ｚ ２、ｏ
葡 萄 球 菌 等 ） 有 一定 的抑 菌活 性 ； 具 对各 类 炎 症 （ 炎 、 肺 支
气 管 炎 、 肤 感 染 、 炎 等 ） 明 显 的 消 炎 作 用 。在 炎 症 部 皮 窦 有 位 ． 蛛 酶 通 过 减 弱 血 浆 激 肽 酶 释 放 酶 系 统 抑 制 缓 激 肽 的 蜘
预 防和缓 解 多种 呼吸 道疾 病 和大肠 杆菌 引起 的腹 泻
蜘 蛛 酶 是 绿 色 环 保 添 加 剂 ． 断 奶 仔 猪 上 应 用 可 以 改 在
善 因 内源蛋 白酶 分泌 不足 而 引起 的消化 不 良的缺陷 、 提高 对蛋 白质等 营养 物质 的利 用率 、 高 体增 重 、 低料 肉 比 、 提 降
中 图 分 类 号 ：８ ６ ￥ １
蜘蛛酶对母猪及仔猪生产性能的影响
摘要：蜘蛛酶（Arazyme®）是由韩国巫婆蜘蛛消化道内共生微生物HY-3所分泌的高活性蛋白酶。
本试验旨在研究其对母猪繁殖性能等方面的影响。
对照组为基础日粮，试验组于基础日粮中添加0.01%蜘蛛酶。
由结果表明，分娩前30天在妊娠母猪日粮中蜘蛛酶，可以提高仔猪出生重，即从对照组的1.35kg增加到试验组的1.74kg；试验组的哺乳仔猪平均断奶重比对照组提高10.28%，从对照组的6.42Kg增加到试验组的7.08Kg（P＜0.01）；试验组的仔猪日增重组比对照组提高6.1%；仔猪腹泻率降低了70.90%（P＜0.01）。
关键词：蜘蛛酶，蛋白酶，母猪，仔猪，生产性能蜘蛛酶是从韩国Insect Biotech公司进口的利用现代生物技术研究开发的畜禽用饲料添加剂，其主要成分为高效蛋白酶。
蜘蛛酶是蜘蛛（Nephila Clavata）消化道内的共生微生物（HY-3）所分泌的一种高活性金属蛋白酶，与目前市场上常用的蛋白酶相比除具有更强大的蛋白分解能力外，还具有耐受高温、较宽的pH值的特点，而且动物日粮中大部分二价金属离子（如Fe2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+和Mg2+）还可以使酶的活性提高2～4倍。
另外，蜘蛛酶对许多致病菌（如大肠杆菌、分枝杆菌、金黄色葡萄球菌等）具有一定的抑菌活性；对各类炎症（肺炎、支气管炎、皮肤感染、窦炎等）有明显的消炎作用。
在炎症部位，蜘蛛酶通过减弱血浆激肽酶释放酶系统抑制缓激肽的产生，减少凝结级联反应中间体抑制纤维蛋白形成，有效抑制疼痛和水肿，同时增强损伤部位的血液循环。
因此可预防和缓解多种呼吸道疾病和大肠杆菌引起的腹泻，这也是与目前市面上的其它蛋白酶的主要区别。
蜘蛛酶是绿色环保添加剂，在妊娠和哺乳母猪日粮中添加蜘蛛酶可以预防母猪乳房炎，提高母猪泌乳量，改善母乳品质，减少乳猪的黄白痢，从而提高仔猪的成活率和断奶窝重。
本试验旨在研究其对母猪及所产仔猪的断奶窝重、腹泻率等方面影响，从而为生产上提高母猪生产性能寻求更有效途径。
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2011. 08. 22 ~ 09. 06
0.2%蜘蛛酶（酶活400,000IU/kg）
温度35°C；搅拌速度500rpm；料水比
3:7
测试装置：1L发酵罐 (B.E Marubishi Co., Ltd.生产) 本发酵装置与工业化生产设备相类似
反应时间 蛋白浓度 ug/mL 提高率 % 提高倍数
蜘蛛酶（原酶，未经过包被处理）
蜘蛛酶热稳定性试验（湿热，模拟制粒）
酶 Test 1 试验1 条件
蜘蛛酶Arazyme (non-coating原酶，未包被) Room temperature（室温）, 80℃, 121℃ Autoclave used 高压灭菌器 (时间：5分钟，压强100KPa) 蜘蛛酶Arazyme(coating，包被) Room temperature（室温）, 80℃, 121℃ Autoclave used高压灭菌器(时间：5分钟，压强 100KPa) Braun & Schmitz Method
0 0
Cu2+ 5 10 15 20
Metal concentration (mM) 金属离子浓度
Metal ions：Mn2+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Co2+, and Cu2+ 金属离子：锰、钙、镁、铁、锌 、钴和铜
疑问4解答：金属离子可以激活蜘蛛酶
蜘蛛酶（Arazyme®） 属于金属蛋白酶，是 以Zn2+和氨基酸残基 为活性中心的蛋白酶。 由于含有金属离子活 性位点，金属蛋白酶 活性可以被大多数金 属离子所激活。
1-1-1、蜘蛛酶对鸡羽毛中角蛋白的降解
A A : Control （对照组,纯水）
B
B : Treatment of Arazyme（蜘蛛酶处理组）pH 8, 37 ℃, 处理2周
1-1-2 Test method of Industrial scale（工业测试）
韩国 R&D Center, Insect Biotech
蜘蛛酶的功效：
强大的蛋白分解能力，改善动物消化
有效抑制大肠杆菌等有害菌，减少腹泻
有效消除乳房炎、改善病弱动物生长
1、蛋白酶的作用
1 对底物专一性的研究 2 对饲料原料分解程度的研究 3 对养殖动物消化、生长性能的影响 4 减少氨氮排放，减少对环境的污染
1-1、蜘蛛酶对底物专一性的研究：
酶的专一性：如胰蛋白酶作 用在精氨酸或赖氨酸羧基 端； 蜘蛛酶对底物有着广泛的专 一性，它主要水解19种氨基 酸羧基端形成的肽键，并优 先水解甘氨酸、精氨酸、组 氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、酪 氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸羧 基端形成的肽键。
1-2、蜘蛛酶对饲料原料——豆粕的降解
蜘蛛酶 对豆粕的处理
1-2、蜘蛛酶对豆粕的水解（电泳图）
对照组 0 12 24 3 蜘蛛酶 6 12 h
分 子 量 减 小
1-2、蜘蛛酶对鱼粉的水解（电泳图）
对照组 0 12 24 蜘蛛酶处理组 3 6 12 h
分 子 量 减 小
1-2、蜘蛛酶处理后动物性蛋白的水解程度Alder-Nissen方法(1979) （以单位原料蛋白质中含有的α-氨基基团的mmol数来表示水解程度）
0h 352.4 -
2h 607.5 72.4 1.72
4h 762.7 25.5 2.16
6h 935.8 22.7 2.65
12h 1075.5 14.9 3.05
18h 1258.9 17.0 3.52
24h 1410.1 12.0 4.00
采用Bradford assay方法对水解羽毛粉中可溶性蛋白进行测定， 标准蛋白采用牛血清白蛋白（BSA）
1-1、蜘蛛酶对不同底物水解性能的研究：
Degradation of various protein substrate 蜘蛛酶对不同底物水解性能的比较
Substrate 底物
鸡蛋清白蛋白Albumin (egg) 酪蛋白Casein 血色素Hemoglobin 弹性蛋白Elastin 角蛋白Keratin 凝胶Gelatin
企业简介：
目前，专门研究昆虫源活性物质、处于世界领先水平的国家主 要有法国、日本和韩国（ Insect Biotech 有限公司）。
企业发展历程：
2000年4月： Insect生物技术有限公司成立。
2000年12月：高效蛋白分解酶（蜘蛛酶-Arazyme）的生产技术获得政府资助项目 2001年5月： 企业下设的研究所被韩国产业技术协会认证 2001年8月： 开始建设厂房和研究中心 2001年12月： 获得韩国-巴西合作项目 （微生物杀虫剂的开发） 2002年5月： 蜘蛛酶（Arazyme）获得韩国国家杰出技术认证（科技部） 2002年6月： 批量生产的产房和研究所的建造 ，发酵，纯化系统和BGMP设备 2003年3月： 获BGMP标准认证（韩国食品和药品管理局） 2003年8月： 与德国ATG-biosynthesis 公司就Arazyme在欧盟的销售签定战略协作协议 2003年10月： 与法国HAN Europe 公司就B.A.L在欧盟的销售签定战略协作协议 2003年11月： 与巴西Goldlink do Brasil 公司就饲料添加剂的销售签定战略协作协议 2004年8月16日： 在中国成立分公司。
5.213
（1）相同酶解工艺是指：相同的酶解时间（5h）、相同的加酶量（500U/g）、相同的 摇床转速（150rpm），底物为地鳖虫（满足各自酶所要求的pH、温度条件）； （2）肽键含量测定方法采用TNBS方法（用被分解的肽键毫摩尔数来表示）；
1-1、最佳酶解工艺下蜘蛛蛋白酶解液与木瓜蛋白 酶酶解液清除自由基的比较
Note 相对酶活
100.4% 66.8%
蜘蛛酶Arazyme (Coating，包被)
80℃ 121℃
100.3% 85.3%
客户疑问4：
有些酶制剂受饲料中矿物质所抑制， 蜘蛛酶活性是否会被其所抑制？
金属离子对蜘蛛酶相对活性的影响
Relative activity (%) 相对活性
500 Zn2+ 400 300 200 100
疑问2解答：原酶在pH5-12保持80%以上
100
Relative activity (%)
80
相对活性
60 40 20 0 2 4 6 8 10 12
pH
蜘蛛酶（原酶，未经过包被处理）
产品采用韩国首尔大学专利 包被物质进行包被
客户疑问3：
低温环境？饲料厂制粒温度？对酶活的影响
疑问3解答：蜘蛛酶原酶具有较好的温度耐受性
酶解液清除羟自由基(·OH)活性比较
酶解液清除超氧阴离子自由基(O2·-)活性比较
（1）最佳酶解工艺是指：酶解时间5h， 酶解温度37℃， 加酶量500U/g， 料水比1：20， 摇床 转速150rpm； 底物为地鳖虫； （2）清除羟自由基测定方法采用采用邻二氮菲法；清除超氧阴离子自由基测定方法采用采用邻 苯三酚法。
养殖中的烦恼？
请用蜘蛛酶（Arazyme®）帮您解决！ 傅文友 博士 18931430111 fuwenyou@
北京中科金澜生物技术研究所 韩 国 英 赛 得 科 技 有 限 公 司
主讲人的工作经历
• 付文友,黑龙江人,东北农业大学毕业。1997年在农业 部饲料工业协会工作,任科教司技术专员。 • 2002年，任美国康地（北京）公司技术经理，负责 猪产品教槽料、预混料、浓缩料、全价料技术配方 工作。 • 2004年应邀加盟正大集团，任华北区技术副总裁， 负责华北区六家公司技术配方和市场服务工作。 • 2008年,任湖北武汉饲料添加剂集团技术总监，开展 对酶制剂应用工作,对饲料酶的应用有独到的技术理 论和观点。 • 2010年,是北京中科金澜生物技术研究所首席饲料配 方师，专注为农牧饲料企业服务。
康畜宝70产品介绍：
康畜宝70是由世界领先的研发昆虫活性 源物质的韩国生命工学研究院（KRIBB） 所开发研制的，由源自蜘蛛的共生微生 物HY-3所分泌的蜘蛛蛋白酶 （Arazyme®）为主要成分的产品。 进口登记证号：（2009）外饲准字 195号 Arazyme® (spider+enzyme) 아라자임 거미(蜘蛛)+효소(酶) 韩国“巫婆蜘蛛”
Surface of Feather meal by electron microscope (SEM) 水解羽毛粉表面（电子显微镜，SEM）
1-1、相同酶解工艺下蜘蛛蛋白酶解液与木瓜蛋白 酶酶解液中的肽键含量的比较
12
肽键含量（mmol/g）
10.365
10 8 6 4 2 0 Arazyme蛋白酶 酶种类 木瓜蛋白酶
Meat meal 肉粉 Chile fish meal 智利鱼粉 Korea fish meal 韩国鱼粉 Poultry meal 禽肉粉
蜘蛛酶（Arazyme）专利：
Acquisition of the KT mark 韩国杰出技术认证
Host Institution : Ministry of Science and Technology 主持单位：韩国科技部 Technology 技术 : High active protease produced by the microbe isolated from the Korean spider 从韩国蜘蛛中分离出的微生物产生的高活性蛋白酶——蜘蛛酶 Date of acquisition : 2002. 3
客户疑问1：
如何获得蜘蛛酶？
哪里有那么多蜘蛛？
疑问1解答：我们不培养蜘蛛，而是通过菌株发酵生产蜘蛛酶
选用美国FDA、中国农业部批准 的菌株，液体发酵
2层膜滤（2m和10kDa）