高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种

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紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力

紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力

紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力张君胜;张力;张尧【摘要】为筛选产纤维素酶酶活力高的菌株应用于秸秆饲料发酵,利用紫外线诱变对1株产纤维素酶绿色木霉菌进行了试验研究.结果表明:筛选出1株纤维素酶产酶量高且性状稳定的高产菌株ZJUV18,其发酵72h纤维素酶滤纸酶活达68.07 U/g,较原始菌株提高4.45倍.%A Trichoderma viride strain was treated with ultraviolet to screen out a high cellulase-producing strain and apply in straw feed fermentation. The results showed that a high cellulase-producing strain with high cellulose yield and stable characteristics, which was named ZJUV18, was screened out. The FPA could be up to 68. 07 U/g after fermented for 72 hours, which was 4. 45 times the activity of the original strain.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2011(039)010【总页数】3页(P125-127)【关键词】纤维素酶;诱变;紫外线;酶活力【作者】张君胜;张力;张尧【作者单位】江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300【正文语种】中文【中图分类】S182粮食短缺、能源危机是目前全球所面临的危机。

而我国由于受人口多、耕地少的双重制约,粮食供应形势尤为严峻。

因此,我国畜牧业要稳定持久发展,就必须减少对粮食的依赖[1]。

产纤维素酶菌种的筛选与优化

产纤维素酶菌种的筛选与优化

产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。

常用的菌种筛选方法有以下几种:1.传统菌种筛选:分离环境中的纤维素降解菌株,通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株,再通过多次温育和活性测定,逐步筛选出高活性的菌株。

2.显性菌种筛选:利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物,在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段,使用这些基因片段进行克隆构建,然后在宿主中进行表达,通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。

3.基因工程菌种筛选:利用已知纤维素酶的基因进行基因工程,通过载体导入宿主细胞中,通过外源表达基因,从而获得产纤维素酶菌种。

二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件,提高纤维素酶产量和活力。

常用的菌种优化方法有以下几种:1.自然进化优化:通过长期培养,逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。

2.诱变优化:利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变,通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。

3.基因工程优化:利用已知纤维素酶的基因进行基因编程,通过基因工程技术对菌株基因组进行改造,以提高纤维素酶的产量和活力。

三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新:应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法,发展新的高效、快速的菌种筛选方法。

2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性:要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌,提高纤维素酶的产量和活力。

3.开发新型纤维素酶菌株:从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株,进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。

4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究:将纤维素酶应用于废弃物转化过程,提高纤维素酶产量和转化率。

综上所述,产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。

通过不断改进筛选和优化方法,进一步开发新的菌种,提高纤维素酶的产量和活力,将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。

纤维素酶产酶菌株的选育与固态发酵

纤维素酶产酶菌株的选育与固态发酵
手段 , 提高产纤维素酶菌株的酶活 , 再从 酶活较高 的诱 变菌株 出发 , 寻找 出优化 的培养基配方。
1 材料与方法
1 . 1 标准葡萄糖溶液( .m / ) .1 3. 02 g mL
1 材料 与试剂 . 1 绿色木霉 ( r h dr a id ) 一 纤维素酶高产 Ti o e r e D 2 c m vi
发 酵中研 究了不 同麸皮稻草比例 、 培养基含水量、 氮源种类 、 无机 盐、 面活性 剂、 表 起始p 因素对 茵株产酶活 力的 H等
影响 。 以上单 因素试验和正 交试验, 通过 得到优化 的培养基配方为: 麸皮3 , 稻草5 ,N s . , - .m 。 g (H X o 0 4 /1 8 L g 2 g 52
关键词 : 色木霉 ; 绿 诱变育种; 固态发 酵; 纤维素酶
S r i n a i n n S ld t t r e t to fCel a e t a n M t to a d o i -sa e Fe m n a i n O l uls CHEN Ta o,XU n Ya
超净 台 : 苏净集 团安泰公 司 ; 电子分 析天平 : 梅特
勒一 托利多仪器 ( 海) 上 有限公 司 ; 冰箱 : 青岛海尔集 团 ; P S2T H 一S 数显 酸度计 :上海天 达仪器 设备有 限公 司 ; 72 2型分 光光度计 : 上海精 密科 学仪器有 限公 司 ; 自动 蒸汽消毒锅 : 无锡市启蒙生 物技 术研究所 ;K 8 型电 D 一D
oe rd c g uat Z 2 a t n drmaa o t y t i(r h dr a id - )ho g uaeei vr ou i t - sba e o l r o r nTi o em r e 2 t uh t n s p n m n WL w o i f b a r sa c vi D r m g s omi o ae n V T e c vyocl ls w snrae o 0 x 0 a g cl l e s r eim)o f c w v d .h t i l ae a cesd m2 7 1 kt (ac a da d m du t r a U a it feu i r f / u t y

纤维素酶的筛选

纤维素酶的筛选

纤维素酶高产菌株的分离筛选基地一班王木兰 201630123017一、研究意义21世纪,人类面临的最主要的挑战就是资源与环境问题,生物资源是可再生性资源,地球上每年光合作用产物达1.5x1011 ~2.0x1011t,是人类赖以生存的基本物质来源,其中纤维素是地球上最丰富的物质之一,然而这部分资源尚未得到充分开发利用,目前主要用于燃料、畜牧饲料与积肥,利用率低,对环境污染严重。

纤维素酶的研究为纤维素更有效利用开辟了一条新途径,纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称,根据其作用方式可分为外切β-1,4-葡聚糖苷酶、内切β-1,4-葡聚糖苷酶和β-1,4-葡萄糖苷酶3类,在这三种酶协同下,纤维素最终被完全降解为葡萄糖。

研究表明纤维素酶在食品、饲料、医药、纺织和造纸等领域有广阔的应用前景。

利用纤维素酶降解天然纤维素,对于解决世界环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。

但目前纤维素酶的生产存在着酶活力低,生产周期长等问题,还未能真正应用于大规模工业生产,因此选育具有高酶活的纤维素分解菌株成为关键之一。

二、国内外研究动态目前获得纤维素酶高产菌株主要是通过自然界选育、诱变育种以及利用基因工程技术改造菌株。

其中,研究较多的是通过对已知纤维素产生菌进行诱变,以增加产酶微生物菌种,提高酶活力。

迄今为止,产纤维素酶能力最强的是里氏木霉,它是产纤维素酶和半纤维素酶最主要的工业生产菌种,国内外已有很多这方面的报道,1971年,Mandels等通过绿色木霉QW60获得了产酶活力提高一倍的QW9123;上海植生所纤维素酶组采用野生木霉As3.3002和拟康氏木霉,经物理、化学诱变,获得了高活力的菌株Ea3-967和N2-78。

纤维素酶基因克隆的研究始于20世纪70年代末,自1982年Whittle等人首次报道Cellulomonas fimi的纤维素酶基因被克隆以来,人们不断从细菌和真菌中发现分离纤维素酶系,迄今为止,据报道已经有近100多纤维素酶及木聚糖酶基因都可在大肠杆菌中克隆表达。

纤维素酶高产菌株的选育

纤维素酶高产菌株的选育

纤维素酶高产菌株的选育
纤维素酶是一种能够分解纤维素的酶,对生物质的利用具有重要意义。

选育纤维素酶高产菌株是提高纤维素酶生产效率的关键。

以下是一些选育纤维素酶高产菌株的常用策略和方法:
1. 采用自然筛选法:从自然环境中采集植物残渣、堆肥等具有高纤维素含量的样品,通过培养和筛选获取纤维素酶高产菌株。

这种方法的优势是能够发现具有适应性强、高纤维素酶产量的菌株。

2. 遗传工程法:通过对已知具有高纤维素酶产量的菌株进行基因工程改造,引入其他有利于纤维素酶产量提高的基因或突变体。

3. 诱变法:通过化学物质(如EMS、亚硝酸钠等)或辐射(如紫外光、X射线等)处理菌株,诱发基因突变,筛选出纤维素酶高产突变菌株。

4. 基因筛选法:通过分析纤维素酶基因的表达水平和调控机制,筛选具有高纤维素酶基因表达水平和调控机制的菌株。

5. 代谢工程法:通过改造代谢途径,优化产生纤维素酶所需的底物和能量供应等因素,提高纤维素酶产量。

以上方法可根据实验室条件和研究目的选择合适的方法进行选育纤维素酶高产菌株。

纤维素酶高产菌株的选育

纤维素酶高产菌株的选育
制 。木霉 ,特别 是里 氏木霉 被 认 为整 p 5 0~ p 6 0 H . H . ,然 后 经 0. 1 a 0 n高压 灭 菌后 备 用 。 ,2mi 1 13 培养 方 法 .. 保 藏菌 种 接 种 到 P A 斜 面 进 行 活 化 培 养 ,经 表 D 面皿 稀 释 或划 线分 离 纯化 。并经 三 角 瓶摇 瓶筛 选 ,选 育 出具 有较 高 活力 的菌株 作 为 出发 菌株 。其 培 养 温度 2 ℃ ,初始 p 5 0 H ., 固 体 表 面 培 养 时 间 7 8 H . ~p 60
(U/ )来 表 示 。 I mE 1 3 抗 分 解代谢 阻遏 的 突 变株 的选 育过 程 . 1 3 1 诱 变处 理 过程 ..
纤 维 素物 质 的酶 促水 解 具 有 良好 的应 用 前景 。但
是 ,目前所存在的主要问题是酶解效率不高。为提高 纤维素酶解 的效率 ,多采用选育高产纤维素酶菌种和 改变纤维材料的结构 ,提高对酶的敏感性的方法 。选 育优 良菌种是提高纤 维素酶活力的关键 。通常,从 自 然界 分 离筛 选 的野 生 型菌 株 其产 酶 能力 比较 低 。为提 高纤维素酶 活力 ,诱 变育 种是一 种有效 的方法 。 目
基础。
天~1 天 ,液体培养 6 ~8 。 0 天 天
1 2 分析 方 法 .
还 原糖 测 定 :取 上清 液 ,按 照 Mie 方 法 ,使 用 lr l DiS试 剂 测定 还 原 糖 的含 量 。 以葡 萄糖作 为标 准 。 N 纤 维素 酶 活力 测定 :采 用 Ma dl方 法来 测 定 滤 ne s 纸 酶 活 ( ie ae t i ,简 称 为 F A)和 C FlrPpr i t t Ac v y P MC 酶 活 ( IC’e) 其 酶 活 力 单 位 用 国 际 单 位 CV a 。 I s

从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤

从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤

从土壤中分离产几丁质酶的真菌作者:王春学号:11101680摘要:几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.1 材料与方法1.1 培养基1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15~20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂1.2 菌株的分离1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养.1.3 菌种的鉴定1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r・min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用.1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’.1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水12.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol・L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol・L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol・L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU・L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min.1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果.1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到pMD182T上,送北京奥科生物公司进行测序.然后,将测序结果通过GeneBank进行BLAST序列比对,得出结果参考文献[1] BROGLIEKE.Chitinaseandplantprotection[J].RevPlantPathol,1993,2:4112421.[2] 李力,黄胜元,关雄.产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究[J].中国病毒学,2000,15(51):94297.[3] CHANGYu2cheng,YANGChiyea,LIChin,etal.IdentificationofBacillussp,Escherichiacoli,Salmonellasp,StaphylococcusspandVibriospwith16SribosomalDNA2basedoligonucleotidearrayhybridization[J].Internation2 alJournalofFoodMicrobiology,2006,107:1312137.[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:1112116.[5] MOOREER,KRUGERAS,HAUBENL,etal.16SrRNAgenesequenceanalysesandinter2andintragenericre2lationshipsofXanthomonasspeciesandStenotrophomonasmaltophilia[J].FEMSMicrobiolLett,1997,151(2):1452 153.[6] MIYAJIT,OTTAY,SHIBATAT,etal.PurificationandcharacterizationofextracellularalkalineserineproteasefromStenotrophomonasmaltophiliastrainS21[J].LettApplMicrobiol,2005,41(3):2532257.[7] MADHA VAPNK,BAIJUTV,SANDHYAC,etal.ProcessoptimizationforantifungalchitinaseproductionbyTrichodermaharzianum[J].ProcessBiochem,2004,39:158321590.[8] NAWANINN,KAPADNISBP.Optimizationofchitinaseproductionusingstatisticsbasedexperimentaldesigns[J].ProcessBiochem,2005,40:6512660。

紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案

紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案

紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案诱变方案:纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.实验目的:对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变,诱变出高产纤维素酶的菌种。

实验原理:紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm,最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。

DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后,DNA分子形成嘧啶二聚体,即两个相邻的嘧啶共价连接,二聚体出现会减弱双键间氢键的作用,并引起双链结构扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对,从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成,会妨碍双链的解开,因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失,即是所谓的诱变。

材料和器皿:(1)菌种:木霉单孢子(2)培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(液体和固体),生理盐水。

(3)器皿:无菌培养皿,无菌试管,无菌移液管(5ml,1ml),150ml三角瓶(内装有玻璃珠),无菌离心管等。

(4)仪器:紫外灯(装在无菌操作箱内),磁力搅拌器等。

实验步骤:紫外线诱变育种单孢子悬液制备:用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散30min,4 层无菌擦镜纸过滤,制备单孢子悬液。

稀释对照菌液(未照射菌液)将未经照射的菌液稀释成10-1~10-6,然后从10-5,10-6两管中各吸取0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上(每个稀释度做三个皿),用无菌涂布棒土布均匀后,倒置于32度条件下培养过夜,第二天取出,计算菌落数,将记得的结果记录于表格中。

UV 诱变:取单孢子悬液5mL 于直径9cm 的培养皿内,同时放入无菌搅拌子,在磁力搅拌器.....的搅拌下置于15W 紫外线灭菌灯下30cm 处分别处理0s.30s、1min、2min、3min、5min、7min、9min、11min。

在红灯下稀释适当倍数,0.1mL 涂PDA 平板,30℃避光培养过夜。

诱变致死率检测:分别取等量的不同诱变时间的菌液和未诱变菌液涂布于PDA 平板,30℃培养72h。

纤维素酶产生菌的分离和筛选专业大实验

纤维素酶产生菌的分离和筛选专业大实验

纤维素酶产生菌的分离和筛选方案目标:从自然界采用选择性分离的方法,获得纤维素酶的高产菌株。

意义:把含纤维的自然资源及纤维废料加以充分利用,转化成糖类作为食品工业和发酵工业的原料或制成优质饲料,具有深远的现实意义。

1.材料与方法1.1材料与仪器1.1.1原辅料土壤品来自南阳理工学院以下各处离地表3-8cm深处泥土装入塑料瓶中,带回实验室处理。

(1)新校区竹林腐叶下的土壤(2)校门口东边的松树林腐叶子下的土壤(3)青年公寓外小树林(4)2号教学楼后面花园的土壤1.1.2试剂羧甲基纤维素CMC、NaCl、MgS04·7H20、KH2P04、酵母浸粉、蛋白胨、蒸馏水、琼脂、Na2HP04、酵母膏、刚果红试剂。

1.1.3仪器小铁铲和无菌纸或袋(可省)、小烧杯、100ml量筒、滤纸、漏斗、棕色试剂瓶、1000ml三角烧瓶1个、500ml三角烧瓶1个、试管24个、高压蒸汽灭菌锅、培养皿24个、36支1mm无菌吸管、无菌玻璃涂棒12支、显微镜、无菌水。

1.2培养基及试剂的配制1.2.1培养基配制初筛培养基A:羧甲基纤维素CMC 20g、NaCl 5.0g、MgS04·7H20 0.2g、KH2P041.0g、酵母浸粉 5.0g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、琼脂20g,pH自然,121℃湿热灭菌20min。

复筛培养基B:CMC 10g、Na2HP04 1.25g、KH2P040.75g、MgSO4·7H2O 0.1g、蛋白胨1.25g、酵母膏O.25g、蒸馏水500mL、琼脂10g,pH自然,121℃灭菌20min。

2.2.2试剂配制1%刚果红试剂:称取刚果红试剂1g于干净的小烧杯中,用量筒量取蒸馏水100ml使之溶解,过滤,贮于棕色试剂瓶中。

2.3方法2.3.1初筛的方法步骤(1)配初筛培养基A,灭菌,倒平板。

(2)用稀释涂平板的方法分离纤维素分解菌。

稀释涂布平板法步骤:A.倒平板将配好的琼脂培养基溶化,待冷至55—600C时,用右手持盛培养基的三角烧瓶,置火焰旁边,左手拿平皿并松动瓶盖,用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出,瓶口在火焰上灭菌,然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝,迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿,使培养基均匀分布,平置于桌面上,待冷凝后即成平板。

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

本科开放项目题目:产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名:指导教师:学院:专业班级:2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物,是高等植物细胞壁的主要成分,是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。

据估计,纤维素生成量每年高达1000亿吨。

我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右,仅农业生产中形成的农作物残渣(如稻草、玉米秸、麦秸等),每年就有5亿吨之多。

纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。

但由于纤维素的结构特点,对纤维素的利用仍然非常有限。

目前仅有20%的纤维素物质被开发利用,大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃,不仅造成资源浪费,而且污染环境。

随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高,能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重,寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。

采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。

因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。

关键词:纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质,同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物,小到细菌、放线菌、真菌,大到一些食草类昆虫与动物。

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究研究目标本研究旨在筛选高产纤维素酶的菌株,并优化其产酶条件,以提高纤维素降解效率和产酶量。

方法1. 菌种收集与筛选1.收集土壤、水源等环境样品,分离出潜在的纤维素酶产生菌株。

2.通过平板培养和传代培养,筛选出具有纤维素酶活性的菌株。

2. 纤维素酶活性测定1.利用Congo Red染色法测定菌株的纤维素酶活性。

2.选择具有较高纤维素酶活性的菌株作为后续研究对象。

3. 优化产酶条件1.确定最适pH:在不同初始pH值下培养菌株,测定产酶量和纤维素酶活性。

2.确定最适温度:在不同培养温度下培养菌株,测定产酶量和纤维素酶活性。

3.确定最适碳源:使用不同碳源(如纤维素、木质素等)培养菌株,测定产酶量和纤维素酶活性。

4.确定最适氮源:使用不同氮源(如蛋白质、尿素等)培养菌株,测定产酶量和纤维素酶活性。

4. 鉴定菌株1.利用生化和分子生物学方法对优选出的菌株进行鉴定,确定其属于哪个科、属、种。

2.利用16S rRNA基因序列分析确定菌株的系统发育关系。

5. 产酶机制研究1.利用电镜观察菌株在不同培养条件下的形态结构变化。

2.利用基因组学方法分析纤维素酶基因在不同条件下的表达情况。

发现1.从环境样品中筛选出了多个具有纤维素酶活性的菌株,其中某一菌株表现出较高的纤维素酶活性。

2.最适pH为7.0,最适温度为50℃,最适碳源为纤维素,最适氮源为蛋白质。

3.经鉴定,该菌株属于纤维素酶产生菌属,并命名为XX菌株。

4.电镜观察发现,在最适产酶条件下,XX菌株的纤维素酶形态结构清晰可见。

5.通过基因组学方法分析,发现XX菌株在最适产酶条件下纤维素酶基因的表达水平较高。

结论1.通过本研究筛选出了一株高产纤维素酶的菌株XX。

2.最适产酶条件为pH 7.0、温度50℃、碳源为纤维素、氮源为蛋白质。

3.该菌株具有潜力应用于纤维素降解和生物质转化领域。

4.通过深入研究其产酶机制,可以进一步优化该菌株的产酶性能和应用前景。

紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案

紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案

紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案诱变方案: 纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.实验目的:对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变,对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变,诱诱变出高产纤维素酶的菌种。

变出高产纤维素酶的菌种。

实验原理:紫外线诱变处理的有效波长为200~300×200~300×10nm10nm ,最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。

DNA 和RNA 的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后,DNA 分子形成嘧啶二聚体,即两个相邻的嘧啶共价连接,二聚体出现会减弱双键间氢键的作用,并引起双链结构扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对,从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成,会妨碍双链的解开,因而影响DNA 的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失,即是所谓的诱变。

材料和器皿:(1) 菌种:木霉单孢子 (2) 培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(液体和固体),生理盐水。

(3) 器皿:无菌培养皿,无菌试管,无菌移液管(5ml,1ml ),150ml 三角瓶(内装有玻璃珠),无菌离心管等。

(4) 仪器:紫外灯(装在无菌操作箱内),磁力搅拌器等。

实验步骤:紫外线诱变育种单孢子悬液制备:单孢子悬液制备: 用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散摇床上震荡分散30min 30min 30min,,4 4 层无菌擦镜纸过滤,制备单孢子悬液。

层无菌擦镜纸过滤,制备单孢子悬液。

层无菌擦镜纸过滤,制备单孢子悬液。

稀释对照菌液(未照射菌液)稀释对照菌液(未照射菌液)将未经照射的菌液稀释成将未经照射的菌液稀释成将未经照射的菌液稀释成10-1~10-610-1~10-610-1~10-6,,然后从然后从10-5,10-610-5,10-6两管中各吸取两管中各吸取0.1ml 0.1ml 0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上(每个稀释度做三个菌液于牛肉膏蛋白胨平板上(每个稀释度做三个皿),用无菌涂布棒土布均匀后,倒置于3232度条件下培养过夜,度条件下培养过夜,度条件下培养过夜,第二第二天取出,计算菌落数,将记得的结果记录于表格中。

纤维素酶的生产工艺

纤维素酶的生产工艺

纤维素酶的生产工艺纤维素酶是一种能够分解纤维素的酶类,具有重要的工业应用价值。

纤维素酶的生产工艺包括菌种选育、发酵及提取纯化等关键步骤,下面将详细介绍纤维素酶的生产工艺。

首先,菌种选育是纤维素酶生产的第一步。

通过筛选和优化培养基,选择出高纤维素酶产量的菌株。

常用的纤维素酶产生菌株有波形菌、木霉菌和酿酒酵母等。

菌种选育的关键是选用适合产酶的菌株,并通过优化培养条件提高其产酶能力。

其次,发酵是纤维素酶生产的核心环节。

在发酵过程中,需要使用适当的培养基和优化的培养条件来促进菌株产酶。

一般来说,纤维素酶的发酵培养基由碳源、氮源、矿盐和调节因子等组成。

常用的碳源有纤维素、纤维素水解物和木质素等。

氮源可以选用蛋白质类物质,如小麦麸、大豆粉等。

矿盐和调节因子的添加能够提供微量元素和调节酵素活性。

发酵过程中,温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等因素对纤维素酶产率和品质都有一定的影响。

一般来说,合适的发酵温度可以提高纤维素酶活性,一般控制在30-37摄氏度之间。

pH值的调节能够影响酵素的稳定性和活性,一般来说,纤维素酶的产酶pH值为4.5-6.0。

氧气供应和搅拌速度的调节能够改善酵素产量和分布均匀性。

最后,提取纯化是纤维素酶生产的最后一步。

通过离心、超滤和柱层析等技术,将发酵液中的纤维素酶分离纯化。

离心可以去除菌体和固体颗粒等杂质,超滤可以去除大分子物质和溶液中的杂质。

柱层析则是根据酶的特性和亲和性选择性吸附和洗脱,以获得高纯度的酶制剂。

综上所述,纤维素酶的生产工艺包括菌种选育、发酵及提取纯化三个关键步骤。

这些工艺的优化和提高可以提高纤维素酶的产量和品质,进一步推动纤维素酶的工业应用。

纤维素酶在生物质转化、饲料添加剂和纺织等领域具有广阔的市场前景。

产纤维素酶菌种的筛选与优化

产纤维素酶菌种的筛选与优化

产纤维素酶菌种的筛选与优化目记录实验1分离和初筛实验2复筛和保存实验3酶活测定和继代保存实验实验4紫外诱变育种实验5产纤维素酶菌株产酶条件优化实验6产酶条件优化结果实验1了解产纤维素酶微生物分离的基本原理;2.掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法2,实验原理自然界中有大量的纤维素物质,同时也有许多能分解纤维素物质的生物,从细菌、放线菌、真菌到一些食草昆虫和动物。

这些生物和绿色植物一起构成了世界的碳循环。

在发酵堆肥中,有大量耐高温纤维素分解菌,但大多数是混合分解菌。

菌株需要1。

内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-d-葡聚糖酶,简称EC 3.3.1.4,EBG),也称为Cx酶,CMC酶,例如这种酶作用于纤维素分子内的非晶区,随机识别并水解β-1,4-糖苷键,截短长链纤维素分子,并产生大量末端不还原的纤维素小分子。

2.胞外-1,4-β-D-葡聚糖酶(酶代码3.2.1.91),也称为C1酶、微晶纤维素酶和纤维二糖水解酶(CBH),它从纤维素长链的非还原端水解β-1,4-糖苷键,一次切割纤维二糖分子;3β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷酶,EC3.2.21,缩写为BG),也称为纤维二糖酶,可水解纤维二糖酶糖和短链纤维低聚糖生成葡萄糖,并快速水解纤维二糖和纤维三糖。

随着葡萄糖聚合酶的增加和水解率的降低,这种酶的特异性相对较差。

只有三种酶协同作用,才能很好地分解纤维素。

就单个菌落而言,木霉、曲霉和青霉等霉菌具有较高的总体酶活和较大的产量,因此用于畜牧业和饲料工业的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

在本实验中,以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基。

只有能将纤维素水解成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长。

从筛选培养基中分离产生纤维素酶的微生物。

使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为唯一碳源,并使用CMC-Na通过微生物分解来分离能够产生纤维素酶的菌株。

刚果红是一种酸性染料,可与纤维素反应形成红色络合物。

纤维素酶产生菌的筛选分离

纤维素酶产生菌的筛选分离

纤维素酶产生菌的筛选分离一、实验目的:1.掌握无菌操作的技术2.掌握选择培养基的设计和配制3.掌握特定菌种筛选方法4.掌握菌种鉴定方法5.测定菌种生长曲线和纤维素酶的活性二、实验原理:该研究设计性实验是利用纤维素酶产生菌可以分解纤维素酶,故而在含有羧甲基纤维素的平板(pH9.0)上可形成透明圈的原理和筛选纤维素酶产生菌。

三、实验内容:(1)培养基①选择培养基的配制同体培养基:250mL三角瓶、1.8g营养肉汤、100mL水、pH9.0、2g CNC-Na、2g琼脂、搅拌均匀包扎灭菌液体培养基:250mL三角瓶、1.8g营养肉汤、100mL水、pH9.0、2g CNC-Na、2g琼脂、搅拌均匀包扎灭菌(配制2份备用)②摇瓶发酵培养基的配制蛋白胨1.0%、酵母粉1.0%、CMC-Na1.0%、NaCL0.5%、KH2PO4 0.1%,另配10% NaCO3,分开灭菌后与上述培养基成分按1:9的比例混合均匀,使培养基的初始PH为9.5-10(2)配制筛选平板和斜面培养基在超净台中将上述培养基倒入平板和试管,试管倾斜放置,待培养基凝固后,低温保存,待用。

(3)菌种筛选①称取土样10g,用无菌水稀释定容至100mL,将土壤液稀释至移取150mL土壤悬液到筛选平板A,均匀涂布后于30。

C恒温培养箱培养12h.②待平板A长出单菌落后,用接种环挑取每个单菌落的一半到另一筛选平板C上,作染色鉴定,原来平板B保存于4。

C的冰箱中,保藏备用③将用于染色鉴定的筛选平板C于30。

C恒温培养1-2d,向培养皿中加入适量1mg/mLa的刚果红溶液,并染色1h;弃去染液,加入适量1mol/L的NaCla溶液,洗涤1h,若细菌产生纤维素酶,则在菌落的周围会出现清晰的透明圈,依据透明圈的直径大小选择产生酶菌株。

④将纯化的产纤维素酶菌株接种到斜面培养,待用。

(4)生长曲线的测定流程种子液→标记→接种→培养→测定①种子液制备取大肠杆菌斜面菌种1支,以无菌操作挑取1环菌苔,接入肉膏蛋白胨培养液中,静止培养12h作种子培养液②标记编码取盛有50mL无菌肉膏蛋白胨培养液250mL三角瓶11个,分别标号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14 、16、20h ③接种培养用2mL无菌吸管分别准确吸取2mL种子液加入已编号的11个三角瓶中,于37。

高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种

高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种

14
1.1.3 试剂 1mg/mL 葡萄糖标准液: 葡萄糖置于 110℃烘箱
中烘 2h 至恒重,称取 0.1g 烘好的葡萄糖,溶解并定 容至 100mL。
0.01M 乙酸-乙酸钠缓冲溶液 (pH4.8):A 液:冰 醋酸 6mL,蒸馏水定容至 1000mL,配制成 0.1M 醋酸 溶 液 ;B 液 : 称 取 8.2g 醋 酸 钠 , 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL,配制成 0.1M 醋酸钠溶液;以 A:B=4:6 的比 例混合,低温冷藏备用。
5g 固 体 曲 湿 料 加 50mL 去 离 子 水 ,30℃ 浸 提 6min,纱 布 过 滤 ,3000r/min 15min,上 清 液 即 为 用 于 测定的固体曲酶液。 1.2.4.2 DNS 法测定波长的确定
取 0.5mL 葡萄糖标准液及 0.5mL 蒸馏水分别置 于 25mL 试 管 中 ,再 各 加 2mL DNS 试 剂 ,沸 水 浴 加 热 5min,流水冷却,蒸馏水定容至 25mL。 将 DNS 试 剂-水(空白)、葡萄糖显色液-DNS 试剂(空白)分别在 波长 400nm~600nm 范围内进行扫描。 1.2.4.3 葡萄糖标准曲线的绘制
第 46 卷(总第 155 期)
Food and Fermentation Technology
第 46 卷(第 1 期) Vol.46,No.1
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
方尚玲,杨丹丹,钱志伟,李小强,陈茂彬*
(发酵工程省部共建教育部重点实验室,湖北工业大学生物工程学院,湖北武汉 430068)
取 8 支洗净烘干的 25mL 比色管,编号后按表 1 加入标准葡萄糖溶液和蒸馏水, 配制成一系列不同 浓度的葡萄糖溶液。 充分摇匀后, 向各试管中加入 2mLDNS 溶液,沸水浴 5min,取出冷却后用蒸馏水定 容至 25mL,充分混匀。 在选定波长下,以 1 号试管溶 液作为空白对照, 测定其它各管溶液的 OD 值并记 录结果。 以葡萄糖含量(mg)为横坐标,以对应的 OD 值为纵坐标,绘制出葡萄糖标准曲线。 1.2.4.4 内切纤维素酶活[8](Cx,CMC 酶活)

产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究的开题报告

产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究的开题报告

产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究的开题报告
一、研究背景
纤维素是一种常见的多聚糖,存在于大部分植物细胞壁中,因此广泛存在于土壤和水体中。

由于其难以降解的特点,造成了许多环境问题。

而纤维素酶是一种针对纤维素的特殊酶类,可以将纤维素降解为低分子糖类,具有重要的应用价值。

目前,纤维素酶的产生主要是通过微生物发酵。

因此,对于纤维素酶的酶学特性的研究是非常重要的,并且对于优选高产纤维素酶的微生物菌株也是极为重要的。

二、研究内容与目的
本研究旨在筛选出高效纤维素酶产生菌株,并研究其生长条件和酶学特性,以提高纤维素酶的产量和酶效力。

具体研究内容如下:
1. 筛选能够高效产生纤维素酶的细菌菌株,并对其进行酶学特性的分析。

2. 探究生长条件对纤维素酶活性的影响,优化最适生长条件。

3. 研究纤维素酶酶学特性,包括温度、pH值、抑制剂等对其酶活性的影响。

4. 探讨纤维素酶的应用前景。

三、研究方法
1. 微生物筛选:从环境中采集样品,进行微生物分离和纯化,通过生化和分子生物学方法进行细菌分类并筛选高效纤维素酶产生菌株。

2. 菌株的生长和纤维素酶酶学特性测定:对筛选出的微生物菌株,采用罗斯曼培养基进行培养并测定其生长曲线和纤维素酶活性的变化情况;同时,对纤维素酶进行酶学特性研究。

3. 数据处理与分析:利用统计学方法对实验结果进行数据处理和分析。

四、预期结果
本研究将筛选到优良的纤维素酶产生菌株,并探究其生长条件和酶学特性,从而为产纤维素酶菌株的优选和酶效力的提高提供理论和实践依据。

同时,本研究还将为纤维素酶的高效应用和产业化提供思路和技术支持。

纤维素酶产生菌的筛选、分离

纤维素酶产生菌的筛选、分离

纤维素酶产生菌的筛选、分离一、实验原理由于刚果红可以跟大分子多糖牢固结合,产生红色复合物,而纤维素是大分子多糖,因此跟刚果红可以牢固地结合;纤维素酶产生酶可以分泌的纤维素酶,可以使平板中的纤维素降解成小分子糖,那么刚果红就无法与小分子糖结合,就被洗脱下来,呈现透明圈,由此来判别是否有纤维素产生菌,并对其筛选,纯化,分离,保存。

二、仪器与试剂1、仪器:烧杯、称量纸、药勺、锥形瓶、玻璃棒、电光分析天平、酒精灯、培养皿、恒温箱、高压蒸汽灭菌锅、1ml和10ml移液管、吸耳球、试管、ph试纸或PH计、纱布、棉花、绳子、标签、涂布棒、摇床培养箱、报纸。

2、试剂:无菌水、0.9%生理盐水、氢氧化钠溶液、盐酸溶液、CMC-Na筛选培养基:(CMC-Na 0.5g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g 、七水硫酸镁0.05g、酵母粉0.05g、琼脂1.5g、水100ml、PH调节为7.0),滤纸条培养基:(滤纸条 0.5g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g 、七水硫酸镁0.05g、酵母粉0.05g、琼脂1.5g、水100ml、PH调节为7.0)CMC-Na刚果红鉴定培养基:(CMC-Na2.0g/l 、硫酸铵2 g/l 、七水硫酸镁0.5、磷酸氢二钾1 g/l、氯化钠0.5 g/l、刚果红0.2 g/l、琼脂0.2 g、PH7.0)。

三、实验步骤1、土样的采集为获得纤维素酶产生菌,土样的采集要在富含纤维素的环境中进行,这是因为在纤维素含量丰富的环境中,通常会聚集较多的分解纤维素的微生物,应采集学校树木下用于堆肥的树叶腐烂泥样及表层泥土为样品,因此样品含纤维素酶产生菌,取样时,由于细菌绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层,要先除去表层土,再用瓶子对土壤进行采样,土壤保存时间不宜超过12小时。

2、培养基的配制、分装灭菌及其他材料的准备CMC-Na分离培养基和滤纸条培养基的配制:根据培养基配方,准确称取各组分于烧杯中,加入适量蒸馏水,并对其加热、搅拌、溶解,最后加蒸馏水至100ml刻度线,调节ph至7.0;分装、制作斜面培养基:将制备好的两种培养基分装到试管中(1/5),每种培养基装两个试管,加上棉花塞,包扎,灭菌,摆斜面;贴上标签(组别,姓名,培养基名称);将剩余的培养基分别装到两个三角瓶中,包扎,灭菌:3、土壤菌悬液的配制、移取及培养称取5g土壤样品,按无菌操作,将样品放入装有45ml无菌生理盐水的烧杯中,振荡10min左右,制成的土壤菌悬液;并将菌悬液用无菌移液管各移取5ml至CMC-Na和滤纸条培养基中,于28度摇床培养一周。

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丢糟 ,是在 固态 发 酵法 酿造 白酒 时 入窖 回糟 蒸 酒后 的酒醅 。 由于 丢糟含 有难 于消 化 的稻壳 , 粗纤 维
素 的酶解 是 一个 复 杂 的过 程 ,其 真正 的酶解 机 制还 不 完全 清楚团 。 从 自然 中分 离 出 的纤 维 素 酶生产 菌纤维 素 酶活 力 一直 不 高 , 了最 大 限度 的利 用丢 糟 中的 纤维 素 , 为
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霉 为 出发 茵 , 紫 外 线 及 原 生 质体 紫 外 线复 合 诱 变育 种 , 得 一 株 纤 维 素 酶 活 力 较 高 生 产性 能 稳 定 的茵 株 , C C 经 获 其 M
酶 活 达 到 1 3 . U/ 3 29 0 g干 曲 , 队 酶 活 达 到 3 1 1 g干 曲 , 别 是原 始 茵株 的 21 F 0 . U/ 6 分 . 9倍 , . 22 5倍 。
111 菌种来 源 ..
组分 酶 系 降解 纤 维 素生 成 葡 萄糖 的一 组 酶 的 总称 。
主要 由 的 3种 成 分 组 成 : 内切 葡 萄 糖 酶 ( MC酶 ) C ;
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wh c r .9 t sa d 2 2 me ih r h e rw tan r s e t ey ih wee 2 1 me n .5 t sh g e a t a sri e p c v l. i i tn h i
Ke wo d : e l l e p oo l t r h d r y r s e l a ; r tp a ;T / o e ma us s c
关 键 词 : 维 素 酶 ; 生 质 体 ; 霉 纤 原 木
中 圈 分 类号 : S 0 . T 2 1 T 21 S6. 3 1 文 献标 识 码 : A 文 章 编 号 :1 7 - 0 X( 0 0 0 - 0 3 0 0 6 4 5 6 2 1 ) 10 1- 0 5 -
( 酵 工 程 省部 共 建 教 育 部 重 点 实 验 室 , 北 工 业 大 学 生 物 工 程 学 院 , 北 武 汉 4 0 6 ) 发 湖 湖 30 8
摘 要 : 研 究 分 离筛 选 出 1 产 纤维 素 酶 的 木 霉 ( MC 酶 活 6 95U/ 本 株 C 0. 1 g干 曲 、队 酶 活 138U/ F 3. 5 g干 曲 ) 以该 木 ,
T cn l y Wu a 3 0 8 Hue) eh o g, h n4 0 6 , b i o
A s at UeteT c oem C ny eat i a O . u sdym du F Ae zmeat i a 3 . ugdy bt c: s r hdr a(MCezm c v yW S695 / r e im、P ny cvt w s138 / r r h i it 1 i y 5
食 品 与 发 酵 科 技
F o a d F r nt ̄o e h olg o d n e me a n T c n o y
第4 6卷 ( 1期 ) V 1 6 N . 第 o. , o1 4
高产 纤维素酶生产 茵的筛选及诱 变育种
方 尚玲 , 丹 丹 , 志 伟 , 小 强 , 杨 钱 李 陈茂 彬 ’
充 分利 用丢糟 中纤 维 素资 源 已经成 为 各酒 厂普 遍 效 、 污染 的优 点 , 而 无 因
利用 纤维 素酶 的水解 作 用 降解纤 维 素是 比较 理 想 的
“ 色” 绿 途径 。 维 素酶 (e uae 是 起 协 同作 用 的多 纤 cU l ) s
本 研究 对分 离得 到 菌种进 行 诱变 育种 ,以期 获得 一 株纤 维 素酶 活较 高菌 株 。
1 材料 与方 法
11 材 料 .
含量 高【 2%左 右 )利 用 价 值 低 , 0 ( , 因而 数 百 年 来 曲
酒 丢糟 一直 未得 到合 理有效 的利 用 。 怎样 变废 为 宝 ,
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