植物原生质体培养
植物原生质体培养(PPT)
杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部， 使其成一薄层，封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物；
材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻 轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组 织块和细胞团。
苜蓿叶片原 生质体的纯 化
完整的原生质体
5. 收集原生质体：
完整的原生质体
四、原生质体活力的测定
原生质体活力的高低对后来的原生质 体培养和融合影响极大。原生质体分离 过程中的任何一个步骤都会影响到原生 质体的活力，因此，必须十分小心。测 定原生质体活力的方法常用荧光素双醋 酸酯（FDA）染色法。
2. 离 心 ： 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进 行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子
植物原生质体培养
第六章：植物原生质体培养请问同学们你知道哪些植物育种的方法？（杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种、基因工程育种、植物组织培养、植物体细胞杂交、动物细胞核移植等。
）自1999年11月20日中国的神舟飞船首飞获得成功后，2012年6月16日18时许中国的载人航天飞船“神舟九号”发射成功，6月29日10时许，神九载人飞船返回舱在内蒙古主着陆场安全着陆，这次发射验证了空间交会对接技术，首次实现地面向在轨飞行器进行人员和物资的往返运输与补给，我国的载人航天工程的“空间实验室”工程有望实现。
2002年12月30日凌晨“神舟”四号发射升天，一起带入太空的还有一批特殊的乘客——100粒牡丹花种子。
有着“牡丹城”之称的洛阳，将牡丹种子送上太空进行育种，是洛阳城“牡丹战略”的一个重要组成部分。
经过太空环境的各种重粒子、强辐射等作用，相当一部分种子的性状会发生较大的变异，也许牡丹花开的会更大更鲜艳。
“神舟四号”共搭载了几百种的植物种子、组织胚胎试管苗、生物菌种等。
此外，太空环境还是一个微重力环境。
中科院（上海生命科学研究院植物生理生态研究所和中科院上海生物化学细胞生物学研究所）的科研人员，分别将精心培育了10年的不同品系的烟草细胞，小白鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞也带入太空，进行了太空细胞电融合实验（由于重力沉降现象消失，不同的细胞更容易融合，提高融合率和细胞存活力），以期获得新品种。
这就是这则新闻提到的动植物细胞举行的“太空婚礼”。
自然条件下，植物间遗传物质的交换可以通过有性生殖来实现，保持物种稳定性的同时，也推动了物种的进化。
但物种间存在的生殖隔离，制约了物种间的遗传信息的交换和整合，也限制了通过杂交进行的作物遗传改良。
因此，人们就想方设法，从其它的途径寻找突破口。
细胞融合技术为克服这一障碍提供了一条新的途径。
而植物细胞是有细胞壁包裹的，实现细胞融合，首先要突破细胞壁的障碍。
6.1 原生质体的概念和研究进展6.1.1原生质体的概念原生质体(protoplast)：我们把除去细胞壁、裸露的、有生活力的原生质团或是说一个被质膜所包围的裸露细胞，称为原生质体。
植物生物技术：第6章 原生质体培养
微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。
第2节、原生质体分离及纯化
四、影响原生质体分离的因素
➢ 从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质 体
➢ 但对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、 最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响
➢ 多数情况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及扩散 入原生质体的速度很慢的缘故，来保证一个稳定的渗透压
第2节、原生质体分离及纯化
➢ 叶肉细胞是常用的材料, 叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展 开的幼嫩叶片
➢ 愈伤组织或悬浮细胞，避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控 制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒
A
B
C
第2节、原生质体分离及纯化
2、酶液及酶解方法
➢ 用来分离植物原生质体的酶制剂 ➢ 纤维素酶、半纤维素酶：降解构成细胞壁的纤维素 ➢ 果胶酶：降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细 胞分开 ➢ 酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶 ➢ 离析酶（果胶酶）
➢ 纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶在0.1%-1%，但也有例外
第2节、原生质体分离及纯化
3.分离培养基
➢ 常用的配制分3 离渗原透生压质：体原酶生液质的体溶操 液作 以需 及要 洗涤在原一生定质渗体透的压溶存液在为下进行，
CPW液
分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原生质体的溶液为 盐成分为：
➢ CPW盐成分为
（3）分离原生质体
方法有二：
两步分离法
一步分离法
第2节、原生质体分离及纯化
植物原生质体培养条件
植物原生质体培养条件
1. 植物原生质体培养条件很关键啊！就像宝宝需要合适的环境才能茁壮成长一样，原生质体也得有它的“温馨小窝”呀！比如说，合适的培养基不就是它的“营养大餐”嘛！
2. 你知道吗，温度对植物原生质体培养超重要！这就好比我们人在太冷或太热的环境里会不舒服，原生质体也一样啊！想想看，要是温度不合适，那会怎样呢？
3. 光照也是个大问题呀！植物原生质体需要恰到好处的光照呢，这就像是我们需要阳光带来的温暖和能量一样，没有合适的光照，它能长得好吗？
4. 植物原生质体培养的湿度条件可不能忽视！这就跟我们需要适宜的空气湿度一样，太干或太湿都不行呀，这多重要啊！
5. 激素在植物原生质体培养中可是起着大作用呢！就如同我们身体里的某些物质能调节我们的生长发育，激素对原生质体也是如此啊，你说神奇不神奇？
6. 氧气对植物原生质体培养也是必不可少的呀！我们人没了氧气不行，原生质体也需要氧气来“呼吸”呀，这不是很明显的道理嘛！
7. 无菌环境简直太重要啦！这就像我们要生活在干净卫生的地方，原生质体也需要一个无菌的“家”，不然会怎样呢，想想都知道后果很严重啊！
8. 培养器皿的选择也有讲究呢！就好像我们要找一个舒服的房子住，原生质体也得有个合适的“容器房子”呀，这多关键呀！
9. 培养时间也得把握好呀！不能太短也不能太长，这就像做饭要掌握好火候一样，太着急或太磨蹭都不行，是不是这个理儿？
10. 操作技术也是很重要的一环呢！熟练的操作就像是给原生质体培养上了一道保险，要是操作不当，那可就前功尽弃啦，这可不是开玩笑的呀！
我的观点结论：植物原生质体培养条件真的是每一项都不容忽视，都得认真对待，只有这样才能培养出健康的原生质体呀！。
植物原生质体培养
3 提取方法
①机械分离法（Machanical isolation） ②酶法分离（Enzymatic isolation）
①机械法
早在1892年，克莱若克（Klercker）就已采用机 械法分离原生质体。 方法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织， 在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞 壁，从而释放出完整的原生质体。 缺点：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织 和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能 用此法。
f cell colonies derived from protoplast,
g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose,
h green shoot formation,
i fertile green plant
Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye.
优点：可获得大量的原生质体，几乎适用 于所有植物的器官、组织和细胞。
缺点：酶制剂由于含有核酸酶、蛋白酶、 酚类等物质，影响原生质体的活力。
注意事项： ⑴酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 浓度范围450～800mmol/L
⑵酶处理： 酶浓度 酶解时间
界面法
①离心沉淀法
• 原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质 体沉于底部。
• 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500～1000rpm,离心5～6min）。 第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心 沉淀。如此2～3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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植物原生质体培养名词解释
植物原生质体培养名词解释嘿，朋友们！今天咱来唠唠植物原生质体培养这档子事儿。
你说这植物原生质体培养啊，就好比是给植物来一场特别的“变身之旅”。
植物细胞大家都知道吧，就像一个小小的城堡，外面有厚厚的城墙，那就是细胞壁啦。
而原生质体呢，就是去掉了这层城墙之后的精华部分。
想象一下，植物就像是一个有好多宝贝的大箱子，细胞壁就是那箱子的外壳。
咱们把外壳去掉，不就能更直接地接触到里面的宝贝啦？原生质体培养就是这么个道理呀。
这原生质体培养有啥用呢？用处可大啦！它能让我们更好地了解植物的秘密呀。
比如说，我们可以通过培养原生质体，看看植物是怎么生长发育的，就像看着一个小娃娃一点点长大一样。
而且啊，这还能帮我们培育出更好的品种呢！就好像是给植物来个大改造，让它们变得更厉害、更优秀。
培养原生质体可不是一件容易的事儿啊，就跟照顾小婴儿似的，得小心翼翼的。
首先得把细胞壁去掉吧，这可得有专门的技术和方法，可不是随随便便就能做到的。
然后呢，还得给它们提供合适的环境，就像给小婴儿准备温暖的小床和充足的食物一样。
培养的过程中还可能会遇到各种各样的问题呢。
哎呀，有时候就像小孩子会生病一样，原生质体也可能会出点小状况。
这时候就得靠我们这些“植物医生”啦，得赶紧想办法解决问题，让它们能健康成长。
你说这植物原生质体培养难不难？当然难啦！但这也是它有趣的地方呀。
就好像爬山，虽然过程很辛苦，但当你爬到山顶，看到那美丽的风景时，一切都值啦！咱们研究植物原生质体培养，不就是为了让植物世界变得更美好嘛。
让那些花儿开得更艳，那些树长得更高更壮。
这多有意思呀！所以啊，朋友们，可别小瞧了这植物原生质体培养。
它就像是一把神奇的钥匙，能打开植物世界的大门，让我们看到更多的奇妙和美好。
让我们一起加油，去探索这个充满神秘和惊喜的植物原生质体培养的世界吧！怎么样，是不是很有意思呢？。
第八章第九章植物原生质体培养与体细胞杂交ppt课件
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
第二节 植物原生质体培养的发展与意义
原生质体的培养技术，近年来也有很大改进，特别 值得指出的是单个原生质体培养再生植株的成功 （Spangenberg等，1986）。
利用这一技术，可以在单细胞水平上研究不同类型原 生质体的生理特性，相互之间的作用以及单个原生质体 的遗传操作。对不同亲本单个原生质体进行融合的研究 也是有利的（Schweigo等，1987）。
饲养层培养法可大大提高水稻（Kyozu等，1987）、 玉米（Rhodes等，1988）等作物原生质体的植板率。 已有不少报道说明，琼脂糖能促进原生质体的分裂 （Shillto等，1983），并有利于对原生质体生长过程 的观察。
第一节
植物原生质体的定义及特点
（5）能摄取外来物质，可作遗传转化工具。
外来物质如核酸、蛋白质等高分子物质乃至病毒、 叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的 理想工具。
（6）变异为单细胞，变异性状易纯。
原生质体在培养中会发生变异，由于其是纯粹单 细胞，因此变异原生质体再生植株的变异性状会更 纯。
第三节 植物原生质体培养方法
2、酶法分离原生质体： 即用细胞壁降解酶，脱除植物细胞壁，获得原生
质体的方法（Cocking,1960）。目前多用此法。 常用的细胞壁降解酶种类有：纤维素酶、半纤维
素酶、果胶酶、R-10（日本纤维素酶）、蜗牛酶 胼胝质酶、EA3-867酶等。 国内常用EA3-867酶是一种复合酶，其成分含 纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（上海植物生化研 究所产）。
特别是一直认为难以培养的禾谷类作物，例如，水 稻（Fujimura等，1985）、玉米（蔡起贵等，1987； Rhodes等，1988）、小麦（Harris等，1988；王海 波等，1989）、谷子（夏镇澳等，1989），以及高粱 的原生质体培养都已相继成功。
植物原生质体培养方法
植物原生质体培养方法原生质体培养办法主要有固体培养法、液体培养法和固一液结合培养法。
另外对于低细胞密度的原生质体培养，还可以采纳饲养层培养法、共培养法和微滴培养法等。
而在原生质体应用于生物转化中时，常常采纳固定化原生质体培养技术举行固定培养。
一、固体平板培养法原生质体的培养办法和对培养条件的要求常与单细胞培养相像。
故原生质体的培养也可根据单细胞的平板办法举行。
首先把原生质体悬浮在液体培养基中(密度为104个／mL左右)，与高压灭菌后冷却至42～45℃的培养基(2倍固化剂浓度)用大口刻度吸管快速等量混匀，并快速转移到培养皿中，旋转培养皿，眨眼便凝固，用石蜡膜带密封，暗培养。
培养基层不宜过厚，普通2～3mm。
培养5～7d原生质体开头分裂，3周左右观看细胞植板率。
待形成大细胞团后，转移到去除渗透压调整剂的新奇固体培养基中继代培养。
近年来发觉，用琼脂糖代替琼脂粉可以提高植板率。
特殊是对于那些在琼脂培养基上不易发生分裂的原生质体，用法琼脂糖可能会取得比较好的效果。
低熔点琼脂糖可在30℃左右溶化，与原生质体混合不影响原生质体的活力。
该办法的优点：原生质体分布匀称，有利于分裂；简单获得单细胞株系；可定位观看单个原生质体的生长发育状况。
缺点：原生质体易受热损害；易破裂；原生质体始终处在高渗透压胁迫下，生长发育缓慢，植板率低。
二、液体浅层培养法尽管固体培养有上述优点，但无数讨论者还是喜爱用法液体培养基，这是由于，当用法液体培养基的时候，经过几天培养之后，可用有效的办法把培养基中的渗透压降低；另外，假如原生质体群体中的蜕变组分产生了某些能杀死健康细胞的有毒物质，可以随时更换培养基；再有，经过几天高密度培养之后，可把细胞密度降低，或把目标细胞分别出来。
本办法是用液体培养基举行原生质体培养。
把纯化后的原生质体用液体培养基调节好密度，用吸管转移到培养皿中，石蜡膜带密封，在培养室暗培养。
培养基层厚2～3mm。
培养5～10d细胞开头分裂，此时开头降低培养基中的渗透压。
植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经 计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密 封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生：
1.愈伤组织的诱导： (1)取水稻种子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2 分钟，再用2．5％次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入 附加2mg／L 2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取 物的Ms固体培养基中，25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移 到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖．
•植物细胞培养及原生质体培养
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程
内容:
植物原生质体培养是一种重要的植物组织培养技术,主要用于快速培养和大量繁殖目的植物的原生质体。
其技术流程主要包括以下几个步骤:
1. 选择培养原料。
选择健康、无病害的植株作为原生质体的供体,常选择嫩茎、嫩叶等组织。
2. 消毒和预处理。
使用烧瓶或培养皿,在无菌操作台进行表面消毒,然后剪切或撕取原生质体,进行预培养。
3. 建立原生质体悬浮培养系统。
将预培养的原生质体转移到含有培养基的烧瓶或培养皿中,保持液面悬浮状态培养。
4. 原生质体增殖。
在光照培养箱中培养,原生质体进行分裂增殖。
适时传代培养。
5. 原生质体发育。
当原生质体增殖到一定数量后,改变培养基成分,促进原生质体发育为细胞组织块体。
6. 组织块体生长。
继续培养,组织块体继续生长,并通过组织分化形成完整植株。
7. 移栽和驯化。
将组织块体或小植株移植到培养基中生根定植,然后
逐渐转移到土壤中,进行环境驯化,最后完全转入盆栽或野外栽培。
通过上述技术流程,可以实现大量快速培养目标植物的原生质体,并最终获得完整的植株,实现规模化种植。
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备：解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。
常用的解离液包含酶类，如纤维素酶和果胶酶，它们能够分解植物细胞壁。
根据不同植物材料的特性，调整酶液的浓度和pH值，确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。
原生质体的分离与纯化：解离后，将混合液通过筛网过滤，以去除未解离的细胞碎片。
然后，将过滤后的液体转移到离心管中，以低速离心收集原生质体。
使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体，去除细胞碎片和其他杂质。
二、原生质体的培养培养基的选择与准备：原生质体的培养需要合适的培养基，通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。
培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。
培养基在使用前需要经过高压灭菌，以确保无菌条件。
原生质体的接种：将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。
对于固体培养基，可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。
对于液体培养基，则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。
接种后，培养基应保持无菌环境，并在适宜的温度和光照条件下进行培养。
培养环境的控制：原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。
一般情况下，原生质体的培养温度为2528℃，光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。
保持适宜的环境条件，有助于原生质体的生长和分化。
三、原生质体的再生诱导再生：在适宜的培养条件下，原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。
根据不同植物的需求，可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂，如细胞分裂素、赤霉素等，以促进愈伤组织或芽的形成。
转化与选择：对于转基因实验，可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。
转化后的原生质体应在选择培养基上培养，以筛选出成功转化的细胞。
选择培养基通常含有抗生素，以筛选含有抗性基因的细胞。
分化与生根：成功转化的细胞在培养基中继续生长，并开始分化为完整的植物组织。
此阶段通常需要切换到生根培养基，以促使愈伤组织或芽生根。
植物原生质体培养
植物原生质体培养一、目的要求掌握用培养皿进行原生质体的液体浅层培养。
二、基本原理原生质体就是具有细胞质膜而没有细胞壁的植物细胞，具有全能性。
原生质体经过培养后再生出细胞壁就可进行正常的分裂生长与分化。
三、材料、试剂与主要仪器1．仪器与设备培养皿(6cm、9cm)、封口膜、温箱、培养箱、1mL定量移液器、枪头、滴管(近滴头端加入少许脱脂棉)、三角瓶、血球细胞计数器、移液管、洗耳球、无菌滤纸、漏斗、滤器、滤膜、针管(30mL)，光学显微镜、酸度计或pH试纸、电子天平等。
2．试剂（1）原生质体液体培养基MS+2,4-D1mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+葡萄糖0.4mol/L，pH 5.8,灭菌。
（2）酚红（0.1%）：称酚红2g，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解，再加进该5.6% NaHCO3溶液使最终体积为100mL，瓶装保存，备用。
3．材料制备好的菠菜原生质体。
四、实验步骤1．原生质体纯化将菠菜原生质体沉淀重新悬浮于10mL原生质体纯化液中，500rpm 下离心10min，原生质体会在蔗糖溶液的顶部形成一条绿带，用无菌吸管或移液管将原生质体转入另一离心管中。
2．原生质体清洗用原生质体洗涤液（CPW液）重新悬浮原生质体沉淀，1000rpm下离心5min，使原生质体沉淀在试管底，重复清洗一次。
之后加适量原生质体液体培养基悬浮原生质体。
3．活力检查凡具活力的原生质体均呈圆球形，在显微镜下可以观察到明显的胞质环流运动。
在叶肉原生质体中由于叶绿体的阻挡，看不清胞质环流运动。
可取一滴原生质体悬浮液放在载玻片上，加一滴0.1%的酚红染液，凡有活力的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即染成红色。
4．密度调整用血球计数板于显微镜下计数，用液体培养基调整使原生质体浓度至105～106个/mL。
5．分装培养将调整密度后的原生质体悬浮液分装到直径6cm的培养皿中，每皿4mL，于28℃下培养，第1d是暗培养，第2～3d光照度为300Lx，以后移至光照度1500～2000Lx 条件下培养。
植物原生质体培养的关键技术
植物原生质体培养的关键技术植物原生质体培养是一种重要的植物组织培养技术，它可以用于植物的无性繁殖、基因工程以及育种等研究领域。
下面介绍一些关键的技术步骤和要点。
原生质体的分离和培养1. 原生质体分离：首先从植物中取得组织样本，如叶片、茎段或花器官等，并在无菌条件下进行处理。
通过切细组织样本，加入酶解液，进行酶解反应，最终获得原生质体。
2. 培养基准备：制备培养基，包括基础培养基和添加物质。
基础培养基提供必要的营养物质和能量，而添加物质则供给原生质体特殊的生长因子和激素。
培养基应在无菌条件下配制，用于培养原生质体。
3. 原生质体培养：将分离得到的原生质体放置在培养基上，以适当的温度和光照条件下培养。
培养过程中要定期观察和检查原生质体的生长状态，以及调整培养基的成分和浓度。
原生质体培养的关键因素1. 无菌技术：无菌条件下进行原生质体培养是确保培养过程成功的关键。
在分离、培养和观察过程中，都要保持严格的无菌操作，避免细菌或真菌的污染。
2. 营养物质和激素：培养基中必须提供适当的营养物质和激素，以满足原生质体的生长需求。
营养物质包括碳源、氮源、矿质盐等，而激素会促进细胞分裂和分化。
3. 光照和温度：适当的光照和温度条件对原生质体的生长和发育至关重要。
光照可以提供足够的能量，而温度则影响酶活性和代谢速率。
原生质体培养的应用1. 无性繁殖：通过原生质体培养，可以实现无性繁殖，快速繁殖大量相同的植株。
这对于育种和植物繁殖的研究非常有用。
2. 基因工程：原生质体培养可用于植物的基因工程研究，如基因表达、基因转导和功能验证等。
这为研究植物基因功能和遗传改良提供了有力手段。
3. 药物及次生代谢产物生产：某些植物的次生代谢产物对药物研发具有重要意义。
通过原生质体培养，可以大规模生产这些药物及代谢产物。
结论植物原生质体培养是一项技术复杂但应用广泛的植物组织培养技术。
通过合理控制培养条件和关注关键步骤，可以成功地进行原生质体培养，并应用于植物研究、育种和基因工程等领域。
原生质体培养-课件
目的与要求
掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质 分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植 物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、 产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生 质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植 株的鉴定方法。
具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质 体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。
一般起始密度为5000-10000个/ml，看护培养可降 低培养密度。 3、渗透压稳定剂
在原生质体培养中除用2-3%蔗糖作为稳定剂外， 还使用0.3-0.5mol/l的甘露醇。有的用葡萄糖完全或 部分取代甘露醇，效果也很高。
五、影响原生质体培养的因素
4、培养基成分 1）基本培养基：MS,B5，Nitsch、N6、KM-8P 2）碳源：葡萄糖（大多数用） 3）无机盐浓度和氮形态：无机盐浓度不宜过高，尤 其铵态氮浓度不宜过高。 4）植物生长调节剂的浓度配比：
（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100
（二）测定原生质体的密度 原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）
×104×稀释倍数
四、影响原生质体培养的因素
1、原生质体活力 选择生长健康植株上的外植体，或分裂旺盛的愈
伤组织或悬浮细胞，在酶解处理时酶制剂浓度不要过 高。 2、原生质体起始密度
四、杂种植株的鉴定 1、形态学鉴定 2、细胞学观察 3、DNA内切图谱分析法 4、同工酶分析法
思考题： 1、说明机械分离法和酶分离法的特 点 2、原生质体纯化方法有哪些？原生 质体活力的测定方法有哪些？ 3、简述原生质体五种培养方法及特 点 4、原生质体融合有哪几种方法？
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原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。
在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。
营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。
通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。
原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。
1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。
他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。
然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。
并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。
此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。
（二）分离方法1.机械分离法1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体.2.酶法分离(1)酶的种类及特点构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。
②半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。
③果胶酶类：一般占细胞壁的5％。
分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
④崩溃酶：一种粗制酶⑤蜗牛酶：主要用于分离小孢子的原生质体。
纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C1，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶Cx，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。
果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。
半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。
此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞和四分体细胞。
ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶(包括C1、Cx、B-葡萄糖苷酶等)，果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。
这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。
日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。
即二步法降解。
(2)酶液的配制①酶的配比及浓度(见表7-1)。
②渗透稳定剂及pH。
植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。
去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。
因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。
因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。
常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40～0.80mol／L。
本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。
其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。
近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。
这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。
酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。
用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5.0时，原生质体产生得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。
当pH 值提高到6.0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5.0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。
原始pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。
(3)分离原生质体①两步分离法②一步分离法分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。
采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。
酶处理目前常用的多是"一步法"，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。
植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。
每克材料用酶液10～30ml不等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。
例如，游离小麦悬浮细胞的原生质体的酶液中须加入0.55mol／L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加0.4～0.45mol／L的甘露醇，两者差别较大。
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。
去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。
如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。
对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。
对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。
酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。
但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。
酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。
对于这几种酶来说，最佳处理温度在40～50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃左右进行酶解。
若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0.53％次氯酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。
把4g叶组织置于含有200ml不加蔗糖和琼脂的培养基500ml三角瓶中。
在4℃黑暗条件下培养16～24h，以后叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5.6，通常在酶液中使用的等渗剂为0.55～0.6mol甘露醇。
然后，酶液真空渗入叶片组织。
在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。
若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。
取悬浮细胞放人10ml的酶液中(3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5.0～6.0)，在25～33℃条件下酶解24h。
原生质体-酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。
在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。
糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。
盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。
但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细胞是分散的。
二、原生质体的纯化和活力测定（一）原生质体的纯化1.离心沉淀法在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。
这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。
此外，还需去掉酶溶液。
以净化原生质体。
原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：（1)将原生质体混合液经筛孔大小为40-100／tm的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。
（2)将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。
用吸管谨慎地吸去上清液。
（3)将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中(除不含酶外，其他成分和酶液相同)，再次离心，去上清液，如此重复三次。
（4)用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。
一般原生质体的培养密度为104-106／ml。
2.漂浮法应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。
3.界面法选用两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体密度，一种溶液的密度小于原生质体密度。
（二）原生质提活力的测定1.形态识别形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。
2.染色识别在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。
测定原生质体活性有多种方法，如观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯(FDA)染色等。
这些方法各有特点，但现在一般用的是FDA染色法。
FDA本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质体膜。
一旦进入原生质体后，由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质体膜，因此有活力的细胞便产生荧光，而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生。
FDA染色测活性的方法如下：取洗涤过的原生质体悬浮液0.5ml，置于10×100mm的小试管中，加入FDA溶液使其最终浓度为0.01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。
激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。
发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荧光的为无活力的。
由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。