凝固酶阴性葡萄球菌

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2、主要试剂
材料和方法
培养基： 哥伦比亚琼脂培养基、 刚果红琼脂 培养基、 LB肉汤增菌液。
引物： SodA引物
（ 5‘-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3’ 及 5‘-ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC-3’）； icaD引物
（5‘-AGGCAATA TCCAACGGTAA-3’及 5‘-GTCACGACCTTTCTTATATT-3’）； 16S rDNA 引物
目前区分致病性与非致病性凝固酶阴性葡 萄球菌的基因标志仍是串联存在的ica D基 因片段，其可被认为是获得性医院感染相 关性CoNS特异的基因型或基因标志物。
28
29
47
41.2
20
溶血葡萄球菌
43
37.7
8
人葡萄球菌
11
9.65
2
PCR实验 各菌种阳性
率（％）
42.6
18.6
18.2
木糖葡萄球菌
3
2.63
0
－
沃氏葡萄球菌
2
1.75
0
－
头状葡萄球菌
3
2.6
2
66.7
中间葡萄球菌
1
0.86
1
100
山羊葡萄球菌
2
1.75
0
－
缓慢葡萄球菌
2
1.75
0
合计
114
100
33
其中CoNS产生的多糖胞间黏附素（polysacchatide intercellular adhesion，PIA）是细菌生物膜形成聚集阶 段所必需的物质，在感染过程中起重要的作用，是鉴定 其致病性的物质基础。
Heilmann 等发现 ica 操纵子对合成 PIA 以及在细菌形 成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。
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研究背景和意义
2、实验目的
获得CoNS特异的致病性分子标志物； 确立敏感、准确、快速的医院感染相关性
CoNS特异基因诊断方法； 能够准确鉴定致病性与非致病性CoNS。
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研究背景和意义
3、临床意义
研究CoNS的生物标志物对该菌在医院获 得性感染中的临床微生物学诊断与鉴定，追 踪传染源，探索其在医院感染中的确切作用 和地位、传播与感染规律，从而对控制传播 途径、建立准确有效的防治措施具有重要实 际意义和经济价值。
凝固酶阴性葡萄球菌 致病性分子标志物的建立与应用
姜美娟 中国人民解放军第401医院
1
第一部分 研究背景和意义
1、立题依据
凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）广泛存在于人体皮肤、 黏膜等组织表面，常在血液、痰液、尿液、深静脉置 管等各种标本中检出。 文献报道，2019-2019年美国48个医学中心2596份 血标本中， CoNS的分离率达32.2%。 尽管血液等无菌体液培养出CoNS临床意义较大， 但据报道单次血培养CoNS污染的可能性仍高达85%。
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4、实验设计及方法
材料和方法
标本采集 阴、阳性对照
菌种鉴定
PIA检测
PCR扩增
icaD基因 sodA基因 16SrDNA序列
生物膜形成实验
DNA测序、 生物信息学分析
确定特征片段
比较分析
临床验证
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第三部分 结果和讨论
1、刚果红试验
4
13
图2.1： 部分样品刚果红试验结果
结果和讨论
表2.1: 114例CoNS的菌种组成及刚果红试验结果100ຫໍສະໝຸດ (bp)22结果和讨论
a
b
c
d
e
图2.6： 部分样品的sodA 片段PCR 扩增结果
2000 1000 500 250 (bp)
23
结果和讨论
图7： 部分样品sodA PCR扩增产物的测序图谱
24
结果和讨论
37例CoNS样品进行了16S rDNA基因及sodA基因片段 的PCR扩增，电泳检测结果显示全部样品均能准确地 扩增出相应的片段，其片段大小分别为16S rDNA 926bp及sodA 482bp，且均为单一条带；
实验分类
实验例数 黏附实验 阳性
黏附实验 阴性
ica D PCR（＋）， 刚果红（＋）
6
6
ica D PCR（＋）， 刚果红（—）
3
2
合计
9
8
0
1
1
20
结果和讨论
通过体外半定量黏附实验测得88.9%（8/9） icaD（ + ）菌株是粘附株。
可见以半定量黏附试验结果作为生物膜形成能 力的判定标准，ica 操纵子的存在与CoNS粘附 及其生物膜形成密切相关。
采用 PCR 技术对 ica 操纵子结构基因片段进行扩增，可 以准确、快速地鉴定CoNS中致病性与非致病性的葡萄球 菌，从而对临床凝固酶阴性葡萄球菌的正确诊断和合理 治疗提供实验室依据，有重要的临床意义。
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3、体外黏附性实验
结果和讨论
图2.3 : 部分样品的定性黏附性实验结果
19
结果和讨论
表2.4 : 9例icaD（ + ）菌株半定量黏附性实验结果
（5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’及 5‘-CCGTCAATTCCATTTRAG TTT-3’）。
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3、主要仪器设备
材料和方法
PCR仪：PTC100 PCR仪，美国MJ Research Inc.；
恒压恒流电泳仪、电泳槽：DF-C型，北京东方特力科贸 中心；
凝胶成像系统：GDS8000 ，美国UVP Inc.；
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第二部分 材料和方法
1、研究对象
阴性对照：表皮葡萄球菌ATCC12228，购自中国 药品鉴定所，经基因组测序证明其ica操纵子缺失 ；
阳性对照：表皮葡萄球菌1-97-337，瑞金医院倪语 星教授惠赠，含有完整ica操纵子；
待测样本：自2019年1月至2019年9月，收集我院 临床各科室共114例疑是感染性标本。
序列测定表明所有样品16S rDNA 及sod A PCR产物 序列均相同，未发现与感染相关的特异性分子序列。
25
第四部分
结论
ica操纵子可出现在多种CoNS中，临床实验室 建立并常规进行CoNS致病性分子标志物的检 测方法是有意义、有必要的；
通过本实验我们确立了的敏感、准确、快速的 医院感染相关性CoNS基因诊断新方法，即ica D基因扩增方法；
26
结论
本研究首次报道了除表皮葡萄球菌以外的其 他种的凝固酶阴性葡萄球菌产生多糖胞间粘 附因子的情况；
表皮葡萄球菌在临床CoNS中检出最多，是携 带icaD操纵子的主要菌种，其致病性应引起 足够重视；
27
结论
16S rDNA以及sod A基因可作为鉴定CoNS 的基因标记，但不能用来作为致病性与非 致病性凝固酶阴性葡萄球菌的鉴别依据。
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研究背景和意义
ica 基因结构
ica 基因座定位于细菌染色体，全长 3.4 kb，包括 icaR 调节 基因及串联存在的 icaA、icaD、icaB 和 icaC 结构基因。 其中，icaADBC 4 个基因构成一个操纵子，可以通过检测 icaADBC 基因来反映ica 操纵子的存在。 icaB 不直接参与胞间黏附素的合成,因为重组icaADC 就能 使细胞积聚； icaA 单独呈现低的N-乙酰葡糖胺转移酶活性； icaC涉及到把不断合成的多糖物质转运至细胞表面； 生物膜的形成要求icaD编码的产物具有最佳活性。 因此,我们选择了icaD 作为本试验的目的基因片段。
核酸/蛋白定量仪：DU640，美国Beckman；
酶标仪：美国雷杜，深圳组装；
ATB Expression：法国bioMérieux Inc；
生物安全柜：BSC-1500Ⅱ B2，济南鑫贝西生物技术有限 公司；
全自动快速微生物培养检测系统：BacT/ALERT 3D 60，
法国bioMérieux Inc；
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研究背景和意义
近年来由于介入性诊疗操作、免疫抑制剂及广谱抗生素 的广泛使用，CoNS已成为院内感染的重要病原菌，而 且耐药菌株比金黄色葡萄球菌更为多见。 叶联华等报道人工瓣膜术后心内膜炎中，约有40%50%由凝固酶阴性葡萄球菌引起； 2009年中国CHINET细菌耐药监测结果MRCoNS检 出率平均为71.7%,大于MRSA的52.7%。
菌种
例数
所占比例（％）
刚果红试验 阳性
表皮葡萄球菌
47
41.2
18
溶血葡萄球菌
43
37.7
3
人葡萄球菌
11
9.65
1
刚果红试验 各菌种阳性
率（％）
38.3
6.98
9.09
木糖葡萄球菌
3
2.63
0
－
沃氏葡萄球菌
2
1.75
0
－
头状葡萄球菌
3
2.63
1
33.3
中间葡萄球菌
1
0.86
1
100
山羊葡萄球菌
2
1.75
0
－
缓慢葡萄球菌
2
1.75
0
－
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合计
114
100
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结果和讨论
刚果红试验通过培养48h后菌落的颜色变化来反映 CoNS 表达多糖胞间黏附素的情况，进而间接地反映其 致病性。
114例样品中刚果红试验阳性率21.1%，由于CoNS分泌 的PIA在培养过程中可以丢失，使阳性结果偏低；另外， 其方法学本身易于受多种因素影响，比如：蔗糖的浓 度、氯化钠和琼脂的浓度、气体条件等，干扰了实验 结果的正确性，不能满足临床要求。
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结果和讨论