植物利用光能的生理基础(2012级)

综合实验2 植物利用光能的生理基础
三、实验基本原理
（三）理化性质
3.荧光现象
叶绿素吸收光量子转变成激发态的叶绿素分子， 很不稳定，当其回到基态时可发出荧光。
色素分子的激发与退激
激发
处于基态的色素分子，吸收光量子后， 其中的电子由基态跃迁到激发态。
电子跃迁的能级 状态由所吸收的 能量决定：
蓝光——第二单线态 红光——第一单线态
综合实验2 植物利用光能的生理基础
一、实验教学目的
学习叶绿体色素的提取和定量测定的方法，并掌 握分光光度计的使用方法。 了解叶绿体色素在植物光合作用中的光能吸收、 传递和转换中的重要作用。
掌握叶绿体色素提取、分离方法，并了解它们的 一些重要理化性质。
综合实验2 植物利用光能的生理基础
二、实验意义
综合实验2 植物利用光能的生理基础
三、实验基本原理
(一）提取和分离
2.分离
纸层析法分离叶绿体色素是一种最简便的方法， 其原理是当溶剂不断地从纸上流过时，由于混 合物中各成分在两相(流动相和固定相)具有不同 的分配系数，其移动速率不同，经过一定时间 后，可以将样品中不同色素分开。
综合实验2 植物利用光能的生理基础
综合实验2 植物利用光能的生理基础
三、实验基本原理
（二）定量分析
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用 分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度， 即可计算出提取液中各种色素的含量。
综合实验2 植物利用光能的生理基础
三、实验基本原理
（三）理化性质 1.皂化反应
叶绿素是一种双羧酸(叶绿酸)与甲醇和叶绿醇形 成的复杂酯。在碱的作用下，发生皂化作用， 生成醇(甲醇与叶绿醇)和叶绿素的盐(皂化叶绿 素)。生成的盐能溶于水，故可将叶绿素与类 胡萝卜素分开。
八、结果与分析
（一）叶绿体色素的提取及定量测定
按下式计算样品中各叶绿体色素的浓度(mg· L-1) ： Ca=13.95A665－6.88 A649 Cb=24.96A649－7.32 A665 Cx.c==(1000A470－2.05Ca－114.8Cb)/245
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如果仅在652 nm波长下比色，则用
植物体内叶绿素与光合作用及氮素营养有密切 关系，在科学施肥、育种及植物逆境生理等 研究上常需对其进行测定。
综合实验2 植物利用光能的生理基础
三、实验基本原理
(一）提取和分离 1.提取
高等植物叶绿体内的色素包括叶绿素(叶绿素a和 叶绿素b)和类胡萝卜素(叶黄素和胡萝卜素)两 大类，它们不溶于水，但溶于有机溶剂，故常 用丙酮或酒精等有机溶剂来提取。
（３）光对叶绿素的破坏作用
将前面实验纸层析所得的色谱图纸，对半剪开，一半夹入 书中，另一半放在强光下，0.5～1 h后，观察四种色素 的颜色有何变化？
（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察
2.叶绿体色素的理化性质
（4）取代反应
取3mL叶绿体色素提取液放入试管内 加入30%醋酸摇匀至变色 倾出一半于另一试管，加少许醋酸铜粉末 水浴加热1～2min 再次变色
(1)96% 乙醇
(4) 30%醋酸
(2) 15% KOH甲醇溶液
(5) 苯
(3) 蒸馏水
(6) 醋酸铜粉末
综合实验1 矿质元素对植物的作用
五、实验材料
1、小麦、玉米、棉花、蓖麻、烟草、向日葵等农作物叶 片或叶柄；
2、黄瓜、茄子、辣椒、豆角、大白菜、萝卜等蔬菜绿叶、 心叶、菜心、菜帮等； 3、八仙花、红叶石楠、木芙蓉、紫荆、珊瑚树等园林植 物叶片或叶柄； 4、枫香、木荷、梧桐、泡桐等林木叶片或叶柄。
实验结束要求
各组用品洗刷干净，玻璃仪器及药品摆放整齐、 齐全之后报告老师或班长（同时实验报告上 交学习委员），经检查同意可离去。
值日生请负责：
维护分光光度计、比色皿 擦洗台面 扫地、拖地
综合实验1 矿质元素对植物的作用
六、实验设计
测定叶绿体色素(叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素) 含量，比较不同植物的光合特性： 1、C3、C4和CAM植物； 2、草本和木本植物； 3、不同颜色植物； 4、同一种植物在不同环境； 5、同一种植物不同处理； 6、同一种植物不同生长时期等。
七、实验步骤
（一）叶绿体色素的提取及定量测定
综合实验3 植物对逆境的生理响应
实验设计
要求学生自带玉米、烟草、羊蹄等植物材料利 用实验室条件人为设置逆境与正常条件形成 对照（如高温与常温，低温与常温，干旱与 保湿等），分析逆境对植物生长的影响：
（一）植物体内游离脯氨酸含量的测定
（二）蒽酮法测定植物组织中可溶性糖的含量
（三）电导率仪测定离体植物叶片的抗逆性
电子自旋 方向相反
三线态——电子自旋方向相同。
综合实验1 矿质元素对植物的作用
四、仪器试剂
玻璃仪器： (1)大试管5根、中试管2根 (2)烧杯和漓管 (3)25ml容 量瓶4个 (4)量筒2个 (5) 指型管2根 (6) 毛细管2根 (7)康维皿1个 (8) 移液管5根 (9) 吸液球2个 试剂：
叶绿素及其结构特点
叶绿素分子含有一个卟 啉环的“头部”和一个叶绿 醇(植醇)“尾巴”。卟啉环由 四个吡咯环以四个甲烯基(CH=)连接而成。 吡咯环的中央结合着一 个镁离子。镁离子带正电荷, 而与其相连的氮原子则带负 电荷,因而具有极性,是亲水 的。 卟啉环上的共轭双键和中 央镁离子易被光激发而引起 电子得失 , 使叶绿素具有特殊 的光化学性质。
2.叶绿体色素的理化性质 （１）皂化反应
取3mL叶绿体色素提取液放入试管内 加入1ml 20％ KOH甲醇溶液，摇匀 先后加入3ml苯、1ml蒸馏水，摇匀 静置 分层
（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察
2.叶绿体色素的理化性质
（２）叶绿素的荧光现象
将浓的叶绿体色素提取液放入试管内，在直射光下观察色 素溶液在透射光下及反射光下的颜色有何不同？
叶绿素及其结构特点
叶绿素是双羧酸酯,其中一个羧基被甲醇所酯化,另一个被叶醇 所酯化 。
综合实验2 植物利用光能的生理基础
三、实验基本原理
（三）理化性质 2.取代反应
在弱酸作用下，叶绿素分子中的镁为H+所取代， 生成褐色的去镁叶绿素，后者遇乙酸铜则形成 蓝绿色的铜代叶绿素。铜代叶绿素很稳定，在 光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植 物的浸渍标本。
称取剪细、混匀植物材料，每份0.1～0.3g
放入试管，加96%乙醇15ml 60～70℃水浴中提取，直至叶片成黄白色 提取液转移至25ml容量瓶中，将试管中的叶绿体色素全部 洗入容量瓶中，直至洗液中无绿色为止 用96％乙醇定容至25ml，摇匀
分别在波长665 nm、649 nm、470 nm及652nm比色
（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察
1.叶绿体色素的分离
取一张长滤纸条(1 cm×2 cm)
用毛细吸管吸取浓的叶绿体色素提取液涂抹滤纸条一侧长边 重复20～30次，风干后卷成纸捻 插入圆形滤纸中央小孔中 将滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中 迅速将一培养皿盖在康维皿上
（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察
CT(mg· L-1)=( A652×1000)/34.5计算叶绿素总浓度
八、结果与分析
（一）叶绿体色素的提取及定量测定
按下式计算样品中各色素的含量：
各种叶绿体色素的含量(mg· g-1) = (C×V)/W
其中:
C为上述各种叶绿体色素的浓度(mg· L-1) ； V为提取液总量(ml，若比色前进行了稀释，则应乘以 稀释倍数)； W为样品鲜重(g) 。