结核病分子诊断

3、耐药基因检测
多重耐药结核杆菌、广泛耐药结核杆菌的流行， 是结核病防治中的重大问题
耐药的主要原因是药物主要靶点的基因发生了 突变
检测这些耐药基因相关突变，可为临床治疗提 供依据：例如异烟肼耐药菌存在KatG基因突变 或缺失，突变模式为S315T。利福平耐药菌发生 发生了点突变、插入或缺失，突变形式为S531L、 H526Y等。
尿液 清晨第一次全部尿量或24小时尿沉渣
胸腹腔积液 尽快送检、离心
谢谢聆听！
结果判读
试验分四组：空白对照组、抗原组(ESAT-6和CFP10)、阳性对照组(植物血凝素PHA)。
通常正常结果：空白对照孔没有或有很少的斑点而 PHA对照孔斑点数超过20个。 空白对照孔斑点数超 过10个时结果被认为是“不确定”。当PHA对照孔 斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确定”。
如果抗原A和/或抗原B有应答，检测结果为“有反 应性”，参照以下标准：
空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔 的斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6；
空白对照孔斑点数为6-10个时且（抗原A或抗原B 孔的斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数）；
检测结果为“无反应性”：不符合上述标准且 PHA对照孔正常。
还是死菌，也不能对疗效进行评价。
临床意义：
TB-DNA阳性主要见于：传统培养或涂 片阳性的患者，菌量多，有活力；涂片或培 养阴性的患者，患者菌量少，涂片或培养阳 性率低；经治疗后带有死菌或低活力菌的患 者；体内结核杆菌已死亡，但DNA尚未分 解。
TB-DNA阴性主要见于：非结核分枝 杆菌感染。非结核病患者；不排菌患者。
凡临床怀疑肺结核的患者，在送检痰涂片 和痰培养的同时，送检痰TB-DNA检查。
进行纤支镜检查时，进行支气管肺泡灌洗， 收集肺泡灌洗液送检。
结核病分子诊断使用范围
临床诊断未明确的胸腔积液、腹腔积液、心 包积液，抽取后在送检生化、常规、涂片、 培养的同时，应该常规送检TB-DNA。
怀疑结核性脑膜炎时，抽取脑脊液后应该送 检TB-DNA。
方法：对特定耐药基因进行扩增，对突变位 点进行检测
局限性：耐药基因检测只能证明病灶菌群中 有耐药菌株存在，并不全是耐药菌。
临床意义：可在短时间内得到检测结果，帮 助医生及时了解患者情况。减少因耐药导致 的治疗延误。
结核病分子诊断使用范围
若有实验室条件，对临床怀疑结核病的患 者均应进行外周血T-spot检测。
诊断活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点 形成细胞中位数为442SFCs/10^6 PBMC 。
排除活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点 形成细胞中位数为124SFCs/10^6 PBMC。
以72SFCs/10^6 PBMC为界值时,诊断活动性结 核病的敏感性为71.9%,特异性76.4%ห้องสมุดไป่ตู้ROC曲线 下面积为0.810。
2、结核分枝杆菌DNA定量检测
结核分枝杆菌DNA定量（TB-DNA） 检测，在结核病诊断中优势明显，其一度 被用作结核病诊断的标准。
方法：
目前临床上最广泛的检测方法是实时荧 光定量PCR法
主要是利用结核分枝杆菌特异性引物和 分支杆菌特异性荧光探针、DNA聚合酶 （Taq酶）、4种脱氧核苷三磷酸、Mg2+等 成分，用体外扩增的方法检测结核分枝杆 菌基因。
优点
敏感性及特异性高：不受卡介苗接种及环境分枝 杆菌影响，不受机体免疫状态影响。
应用广泛：在活动性肺结核、肺外结核、结核性 浆膜炎、潜伏性结核感染及免疫抑制的结核患者 均能检测。
诊断快速：24小时可报告结果。 可进行疗效评估：治疗有效则T-SPOT.TB斑点数
减少甚至阴性。
局限性： 不能根据斑点数量的多少来判断受试者是活
结果判读：
结果表达方式用X×10n copies/ml（拷贝/ 毫升），或XE+00n copies/ml（拷贝/毫升， 用科学计数法表示）。
检测参考值为阴性或小于1000 copies/ml。 如果检查结果大于参考值，表明患者TBDNA为阳性，反之为阴性。
局限性： 该检测无法区分结核分枝杆菌是活菌
每一个斑点代表一个分泌细胞因子的T细胞， 记数斑点数量可以获得外周血中结核致敏的T 细胞数量。
方法：
用培养滤过蛋白10（CFP-10）和早期 分泌靶向抗原蛋白6（ESAT-6）两种TB特 异性抗原，刺激外周血单个核细胞 （PBMCs），检测PBMCs经特异性抗原刺 激后是否释放IFN-γ，以抗体捕获IFN-γ， 经酶联斑点显色后，通过T-spot分析系统对 斑点进行计数。
以652SFCs/10^6PBMC为界值时,诊断活动性结 核病的特异性达95%。
研究证明：T.SPOT.TB的斑点数越多，发生 活动性结核的可能性越大，而且短期内有过 结核接触史的患者T—SPOT.TB的斑点数较 多时更有意义。
有学者提出：抗原A或B斑点数全20者，对 临床诊断活动性结核感染的意义更大 。
T-spot.TB 的原理
结核分枝杆菌感染机体后被巨噬细胞吞噬，但 不能完全将其清除，巨噬细胞凋亡后释放出大 量特异性抗原，并递呈给特异性的CD4、CD8T 细胞，使其激活并释放大量γ-干扰素。
大量研究表明，结核抗原特异性分泌γ-干扰素 的T 细胞可作为结核分枝杆菌感染的一种可靠 标志物。
外周血T-Spot即利用酶联免疫斑点技术 （ELISPOT）通过检测结核分枝杆菌特异性抗 原刺激后外周血单个核细胞释放的γ-干扰素， 来检测抗原特异性Ｔ淋巴细胞的应答反应，从 而判断结核感染状态。
当空白对照孔斑点数为0-5个，并且抗原A或抗原B斑 点数减去空白对照孔斑点数等于5-7时，此结果被认 为是“灰区”，应当利用所有可利用相关的的临床 信息进行判断。必要时可进行复查。
T-SPOT.TB的实验结果也有用每10^6 PBMCs中斑点 形成细胞(SFCs)的数目来描述，即SFCs／106PBMCs。
正确采集标本 是确保检验结果准确的前提
标本
采集方法及处理
痰标本
取清晨第一口痰，口咽部清洁后，鼓励用力咳出深 部痰液，即刻送检
采外周全血，T-spot检测首选肝素抗凝（不推荐乙 血标本 二胺四乙酸盐抗凝）室温（15-25℃）保存与运输；
TB-DNA和耐药基因检测首选枸橼酸钠抗凝，不推 荐肝素抗凝
肺泡灌洗液 镜检异常处灌洗，收集5-10ml送检
其原因可能有：
(1)潜伏性结核感染者的免疫功能良好，少量 的抗原刺激就激发出活跃的保护性免疫；
(2)活动性结核患者免疫功能低下，大量的抗 原刺激也不足以激起有效的细胞免疫。
临床意义：
可用于结核病的辅助诊断与鉴别诊断及 疗效评价。
如“菌阴”结核病患者的辅助诊断； 肺外结核的鉴别诊断； 结核潜伏感染者的筛查指标——区别结 核感染者与卡介苗接种者。
国外文献报道应用ELISPOT方法检测活动 性肺结核的敏感性可达到 78 ~100%, 特异性 可达到80~100%。
国内学者研究应用ELISPOT方法检测活动 性肺结核的敏感性为83~98.8%，特异性 65~100%，阴性预测值81.8~91.6%，阳性预 测值45.3~67.9%。
有学者指出
当PHA对照孔结果为“不确定”且抗原A和抗原B 孔结果都为“无反应性”时，该实验结果被认为 是“并不确定”，应当复查。
“有反应性”结果表明样本中存在针对结核杆 菌特异的效应T细胞；结果阳性，高度怀疑 结核感染。
“无反应性”结果表明样本中可能不存在针对 结核杆菌特异的效应T细胞 ；结果阴性，排 除结核感染，帮助临床鉴别诊断。
经抗结核治疗后，临床症状及影像学无明显 改变者，应送检耐药基因检测和非结核分枝 杆菌检测。
结核病分子诊断使用范围
从临床医生角度看，不能仅仅从一次阳性送 检报告，就确诊为结核，必须结合临床诊断， 不符合临床特征的检验结果，建议反复多次 送检。
分子诊断最多用于临床结核病辅助诊断，临 床医生应该结合病史、症状、体征、PPD、 ESR、影像资料、微生物检查综合判断。
分子诊断在结核病诊治中 的应用（要点）
结核病是严重威胁人类健康的重大传 染性疾病。近年来结核病“死灰复燃”及 临床耐药显著增多，加之非结核分支杆菌 （NTM）感染率不断增加，使得结核病的 诊断更加困难。
目前，诊断结核分支杆菌（MTB）的金标准 仍然是结核杆菌培养，尤其是药敏试验结果在指 导临床用药及耐药性监测等方面具有重要作用。
结核病分子诊断使用范围
1、体外γ干扰素释放试验 体外γ干扰素（IFN）释放试验又称T细
胞斑点检测试验（T-spot），是近年来发展 起来的检测抗原特异性T细胞技术，为目前 最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一。
通过检测结核感染后，T淋巴细胞分泌的 特异性细胞因子IFN-γ，来检测是否存在结核 感染。
动性结核患者？还是潜伏期感染者？ 不能提示临床患者的感染部位； 对于儿童结核的辅助诊断需要结核更多的临
床资料。 对标本要求高：室温保存和运输血液样本
（18-25℃），不能冷冻或冷藏；血液样本 从采集到检测不超过8小时。
潜伏性结核感染的斑点数有可能高于活动性 结核，因此T-spot.TB难以区分活动性结核 和潜伏性结核感染。
但是，结核杆菌培养阳性率低费时费力，难 以满足临床要求。
分子诊断因具有快速、特异、灵敏度高的优 点，从而使快速诊断结核病成为可能，尤其是对 结核分枝杆菌耐药基因的监测，为结核病的治疗 提供了重要指导意义。
提要
结核病分子诊断项目及临床意义 1、体外γ干扰素释放试验 2、结核分枝杆菌DNA定量检测 3、耐药基因检测