分子诊断技术在结核病诊治中的应用(1)
肺结核的分子诊断方法研究
肺结核的分子诊断方法研究肺结核是一种由结核菌引起的慢性感染疾病，其传染性强且易复发。
目前，传统的肺结核诊断方法常常受限于样本采集、检测时间和结果准确性等方面的问题。
因此，研究人员开展了许多研究来寻找更加快速、准确和便捷的肺结核分子诊断方法。
一、核酸检测方法的发展1. PCR技术的应用PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用的分子生物学技术，可以扩增微量的目标DNA序列。
在肺结核的分子诊断中，PCR技术被广泛应用于寻找结核菌的特征基因。
2. LAMP技术的突破LAMP（核酸等温扩增）技术是一种新型的DNA扩增技术，具有高度敏感性和特异性。
该技术可以通过特异性引物和DNA聚合酶，在等温条件下迅速扩增目标序列，并可通过肉眼观察结果。
二、蛋白质检测方法的发展1. 免疫学技术的应用免疫学技术在肺结核的分子诊断中发挥着重要作用。
例如，ELISA （酶联免疫吸附测定法）可以检测特定肺结核相关蛋白质的存在，并且具有较高的灵敏性和特异性。
2. 质谱技术的突破质谱技术在肺结核蛋白质检测中具有独特优势。
通过质谱分析，可以检测肺结核相关蛋白质的质量和结构，并获得高度准确的结果。
三、近年来的研究进展1. 基于核酸检测的新方法近年来，研究人员提出了一种新型的核酸检测方法，称为数字PCR。
它通过将DNA样本分成大量微小的反应区域，使得PCR扩增反应变得更加精确和稳定。
这一方法在肺结核的分子诊断中显示出了良好的应用前景。
2. 基于蛋白质检测的新方法除了传统的免疫学技术和质谱技术外，研究人员还提出了一种新型的蛋白质检测方法，称为光纤免疫传感技术。
该技术利用基于光纤的传感器检测血液中蛋白质的浓度，并且可以实时监测肺结核相关蛋白质的变化。
综上所述，随着科学技术的不断进步，肺结核的分子诊断方法得到了巨大的发展。
核酸检测方法和蛋白质检测方法的应用为肺结核的早期诊断和治疗提供了更好的手段。
未来，我们可以期待更多创新的肺结核分子诊断方法的出现，进一步提高肺结核的诊断效率和精确性，为肺结核的防治工作做出更大贡献。
(仅供参考)结核病的分子诊断技术进展
国际上较为成熟的IGRAs有两种
结核感染T细胞免疫检测
全血检测
ELISA对全血中致敏T细胞再次 受到结核特异性抗原刺激后所释 放的IFN-γ水平进行检测。
均为结核菌 RD1区基因 编码的抗原
多肽，主要 包括ESAT-6 和CFP-10
结核感染T细胞检测
细胞检测
ELISPOT在结核菌特异性抗原刺 激下, 测定外周血单个核细胞中 能够释放IFN-γ的效应T细胞数量。
三、诊断技术发展的多元化
诊断技术便捷化 检测样本多样化 技术产品本土化 测序技术和数据平台
诊断技术便捷化
GeneXpert Omni
全自动分子诊断POCT系统，为患者提供真正的即时床旁检测 轻便易携带（高23cm,重1kg）,方便在全球范围内推广 采用电池供电，需联网使用，涉及数据所有权 单盒式测试，一次只能检测一个样本 2015年AACC会议上亮相，预计2017年第3季度正式发布
DNA作为分子诊断靶标的技术
2.环介导恒温扩增 LAMP 技术
原理
针对靶基因的6个区域设计4 条特异引物，利用链 置 换 DNA 聚 合 酶 在 等 温 条 件 (63-65℃) 下 30-60 min，即可完成核酸扩增
特点
不需双链DNA先变性成单链 扩增反应在等温下可持续进行 扩增效率高，15min-1h内实现109-1010倍的扩增 对 DNA 的扩增不需要热循环仪器。 当模板为RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样扩增
Sanger 测序
① PCR扩增待测耐药基因，对产物纯化之后测序，与其标准株的 同一
片段比较异同 ② 作为耐药突变分子生物学检测技术的金标准，能确定突变碱基的位置、 类型性质 ③ 操作繁琐，费用昂贵，多用于评价其他检测方法
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析摘要：目的对分子生物学技术在结核病诊断中的应用实施分析。
方法本次研究中共计选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，371例患者均为痰涂片阴性病例，对其全部开展DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测技术和改良罗氏培养进行诊断。
结果所有参与本次研究的371例初诊为肺结核疑似病例或临床病例，通过DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测技术进行诊断之后，最终有63例患者确诊为分子生物学阳性病例、47例为培养阳性病例。
DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测阳性率比涂片镜检和改良罗氏培养更高。
结论在对肺结核疑似病例或临床病例实施诊断期间，对患者采取实时DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测具有比较高的诊断效果，值得推广。
关键词:分子生物学技术；结核病；诊断；价值结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,是全球最具威胁的传染病之一。
据世界卫生组织统计,我国患结核病人数居世界第2位,是全世界22个结核病流行严重的国家之一[1]。
结核病实验室检查是结核病诊断、治疗方案制定和治疗效果评估的重要依据。
目前我国大多数实验室广泛采用细菌学检查方法,包括抗酸杆菌痰涂片镜检和分枝杆菌分离培养。
涂片检查简便、易行,但阳性检查率较低[2];分离培养法是目前结核病诊断的金标准,具有很高的灵敏度,但至少需要3~8周的时间,但耗时较长,不能满足结核病早期诊断的要求。
随着分子生物学的发展,近年来涌现出很多方法用于结核分枝杆菌的快速诊断及鉴定[3]。
本文正是基于此，选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，对分子生物学技术在结核病诊断中的应用进行分析，具体的研究情况报道如下。
1资料与方法1.1一般资料本次研究中共计选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，对所有患者共计742份痰标本进行诊断。
应斌武教授-结核病的分子诊断技术进展
结核感染T细胞检测 细胞检测
ELISA对全血中致敏T细胞再次 受到结核特异性抗原刺激后所释 放的IFN-γ水平进行检测。
IGRA
ELISPOT在结核菌特异性抗原刺 激下, 测定外周血单个核细胞中 能够释放IFN-γ的效应T细胞数量。
T-SPOT.TB
IFN-γ是参与结核病发病的一个细胞因子。效应T细胞被近期 暴露的抗原在体外再次刺激后会释放γ干扰素。
四、华西医院结核病诊断的临床应用及研究进展
我院的结核及耐药实验室检测流程
患者临床标本
直接检测 核酸
Ziehl-Neelsen 染色 显微镜检查
MGIT960 液体培养
IGRA
核酸提取 及纯化
AFB阴性
AFB阳性
培养阳性
培养阴性
阴性有排除结 核病的价值 阳性提示结核 感染或结核病
实时荧光 PCR 阴性 阳性
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术
1. Line probe assays线性探针测定法 Hain（LPA GenoType® MTBDRplus/Rsl）技术
2h
0.5 h
2.5-3 h
WHO建议使用Hain来检测 MDR-TB
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术 2. Xpert MTB/RIF
Xpert XDR
可以检测异烟肼，氟喹诺酮类药物和二线注射剂的耐药 测定正在开发中，尚未被WHO评估。 初步敏感性和特异性(与测序相比，尚未经同行评议): 异烟肼98.1%，100% 氟喹诺酮95.8%，100% 卡那霉素92.7%，100% 阿米卡星96.8%，100% 预计2018年面世
DNA作为分子诊断靶标的技术
2.环介导恒温扩增 LAMP 技术
分子生物学诊断肺结核的基本原理
分子生物学诊断肺结核的基本原理肺结核是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的一种慢性传染病，其传染性和危害性较大。
在现代医学中，分子生物学技术得到了广泛应用，其基本原理为通过分子生物学方法来检测病原体的DNA或RNA序列，从而达到诊断肺结核的目的。
分子生物学诊断肺结核的方法包括多种，其中最常见的是聚合酶链式反应（PCR）技术。
PCR技术的基本原理是在反应管中模拟DNA复制过程，通过循环反应扩增目标DNA片段。
PCR技术的扩增速度非常快，可以在短时间内扩增出目标DNA的数量，并且可以从微量样品中检测出目标DNA。
其主要原理是将靶DNA序列的两端加上一对引物，引物与靶DNA序列特异性互补，用酶解使双链DNA分离成两个单链模板，接着在一定条件下，引物向外扩展与模板互补合成一条新链，重复上述步骤多次，即可扩增出数百万份相同的DNA片段。
PCR 技术对检测病原体的敏感性高，可以在肺结核病人的血液或痰样品中检测到微小数量的结核分枝杆菌。
除了PCR技术之外，核酸杂交技术也是一种常见的分子生物技术，用于检测肺结核病原体的DNA或RNA序列。
其基本原理是将已知的DNA/RNA探针标记上荧光物质，投放到未知样品中，通过探针与未知样品中互补的目标DNA/RNA序列结合，然后通过荧光显微镜等手段检测探针标记的荧光信号大小以及位置。
核酸杂交技术也可以用于检测多种肺结核病原体的基因序列，并且可以实现对不同病原体的鉴别诊断。
另外，DNA测序技术也可以用于肺结核的诊断，其基本原理是将肺结核病原体的DNA序列解析出来，通过比较其DNA序列与已知肺结核病原体的DNA序列进行比对，从而快速准确地诊断出所含的结核分枝杆菌种类。
综上所述，分子生物学技术作为现代医学检测技术的一种，已经在肺结核病的诊断中得到广泛应用。
可以提高病原体的检测效率，同时也可以提高病原体的检测准确性和灵敏度。
在未来，随着分子生物学技术的不断完善和进步，肺结核的诊断将会更加准确和有效。
分子生物学检测指导肺结核早期诊断的意义
８４．７２％ 、７３．９１和 ６８． ９７％ ，特异度分别为 １００． ００％ 、８６． ８４％ 、
９６．８３％ 、９６．９７％ 和 ９９．０６％ ，提示 ＮＧＳ 技术检测利福平、异烟
·９８·
肼及氧氟沙星等耐药效果较好，能够满足临床结核病诊断需
ＴＯＦ－ＭＳ 对液体培养分枝杆菌菌种鉴定的能力，结果显示
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ 鉴定 ＭＴＢ 和非结核分枝杆菌准确率分别
为 ９５．６５％ 和 ８８．４６％ ，表明该方法是一种快速、简便准确的鉴
定方法，在临床应用中具有重要价值。 一项纳入 １１ 篇文献
的 ＭＥＴＡ 分析显示，ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ －ＭＳ 鉴定分枝杆菌正确率
ｑＰＣＲ） 最早由 Ｈｉｇｕｃｈｉ 等提出，随后美国 ＰＥ（ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
公司研发出了 ＴａｑＭａｎ 荧光探针定量技术，真正做到了“ 实
时检测” 。 与传统的 ＰＣＲ 技术相比，具有特异度高、重复性
好、操作简单以及无常规 ＰＣＲ 扩增后开管操作等优点。 实
时荧光 ＰＣＲ 技术目前在临床应用较为广泛，常规实时荧光
测 ＭＴＢ 特异性的基因片段，判定标本中是否存在 ＭＴＢ，为结
核病早 期 快 速 诊 断 提 供 了 新 的 途 径。 ２０１７ 年， 我 国 已 将
ＭＴＢ 核酸检测阳性作为肺结核诊断标准之一，这将会提升我
国结核病诊疗的整体水平。
２． 实时荧光定量 ＰＣＲ（ ｒｅａｌ － ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ＲＴ －
动性肺结核患病率为 ４５９ ／ １０ 万，其中痰涂片阳性率为 ６６ ／ １０
万。 ＷＨＯ 全球结核病报告显示，２０１９ 年全球新发结核病患
带你了解结核病精确诊断的新方法
带你了解结核病精确诊断的新方法结核病是一种由结核分枝杆菌引起的传染病，其主要侵犯人体中的肺部，而对人体中的其他器官组织也有着一定的影响。
结核病的诊断一直以来都是医学领域当中的难题之一，传统的诊断方法常包含有对患者的病史询问、临床表现、X线检查、饥饥结核分枝杆菌培养和酸染色等等，但这些方法在目前均存在有一定的局限性，也有着不准确、费时、费用高等问题存在。
而在目前，一些新的精确诊断方法逐渐被引入到了临床实践当中，本文则将就这些内容展开叙述，以便大家能够更好地了解其新的精确诊断方法。
基于DNA扩增技术的分子诊断分子诊断是一种利用基因扩增技术对结核分枝杆菌DNA进行检测来诊断疾病的方法，也是常用的分子诊断方法。
在结核病诊断当中，分子诊断的方法主要包含有基因扩增技术，其对于结核病的诊断均有着不错的成效。
而具体来说，基因扩增技术具有灵敏度高、准确性高、效率高、特异性高等优点，能够从患者的样本中快速检测出结核分枝杆菌的DNA。
采用该技术还能够对耐药株进行鉴定和筛查，这也有助于开展针对耐药菌株的治疗。
但是，基因扩增技术需要大量基础设施和复杂的实验操作，使用成本过高，并且受到采样部位、样本稀释等因素的影响，可能会出现污染和误诊的概率。
需要对此予以警惕。
而为避免在应用分子诊断的过程中造成误诊的结果，则应当对检查者和患者做出一定要求。
首先，由于检查者的医学素养和检查水平一定要高，要能够正确处理分子诊断过程中所产生的庞大数据量，对其进行统计和分析，而这也要求了检查者要具备一些相关计算和统计知识，并形成对分析结果的正确解读与评估。
同时，为能够确保最终结果的准确性，患者则应当在样本的收集工作之前停止使用抗生素治疗至少2周以上，以避免最终的诊断结果出现误差。
结核分枝杆菌特异性抗体检测结核分枝杆菌特异性抗体检测也是一种新型的诊断方法，它可以检测到患者血清当中对结核分枝杆菌的特异性抗体，从而做到诊断结核病的效果。
与传统的结核病诊断方法不同的是，这一方法不需要对菌株进行培养和酸染色，能够在早期诊断中为医生提供更加可靠、精准的结果。
重视分子病理诊断新技术提高结核病病理学诊断水平
重视分子病理诊断新技术提高结核病病理学诊断水平车南颖中国是结核病高负担国家，在结核病诊断中面临很多问题。
分析2018年WHO发布的全球结核病报告中国结核病诊断在以下3个方面需要继续加强：(1)肺结核细菌学确诊率低，仅为31%,远低于世界平均水平57%；(2)耐药结核病发现率低，不到20%耐多药或利福平耐药患者被发现；(3)肺外结核发现率低，全球报告的结核病患者中15%为肺外结核，但中国报告的肺外结核患者仅占5%。
病理学是诊断结核病的重要途径，在疑难性结核病，尤其在菌阴肺结核(痰涂片及培养阴性)及肺外结核的诊断中发挥着非常重要的作用。
近年来，分子病理学新技术发展迅猛，结合传统病理学可以做到确诊结核病、鉴别诊断结核病与非结核分枝杆菌病，以及诊断耐药结核病，为解决以上3个结核病诊断所遇到的突岀问题提供了新的途径。
如何将这些新技术应用到临床实际工作中，提高疑难性结核病的诊断水平是摆在我们面前的重要问题。
1病理学诊断结核病的方法及标准•M病理学诊断结核病的主要方法病理学诊断结核病的主要方法包括常规病理学、特殊染色、免疫组织化学染色,以及分子病理学等。
2017年发表的《中国结核病病理学诊断专家共识》p,(以下简称“《共识》”)，对上述4种方法的原理、特点及注意事项等做了详细的介绍。
1.1.1常规病理学：常规病理学通过大体和镜下观察组织细胞的病理形态学变化进行诊断，具有针对性强、准确性高等特点。
对结核病与其他一些非肉芽肿性疾病(如肺结核与肺癌)的鉴别诊断具有很好的优势「但肉芽肿或坏死等结核病常见的病理改变亦可出现在其他感染性和非感染性肉芽肿性病变中DT,《共识》中明确指出常规病理学诊断手段不能作为诊断结核病的金标准，必须通过其他方法找到明确的结核病病原学依据方可确诊。
1.1.2特殊染色：特殊染色中，抗酸染色是病理科最为常用的查找抗酸杆菌的方法，对于诊断结核病有非常重要的作用。
需要注意的是，抗酸染色无法鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，而且除了分枝杆菌外其他一些种属的细菌也可呈抗酸染色阳性151,因此抗酸染色阳性并不能确诊结核病，形态典型的情况下只能诊断分枝杆菌病。
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析摘要目的:分析研究分子生物学技术聚合酶链反应(PCR)对结核病检测的临床应用,并对其应用进行方法学评价。
方法:采用分子生物学技术体外核酸扩增聚合酶链反应对临床疑似结核病标本进行结核分枝杆菌检测。
结果:分子生物学技术聚合酶链反应对临床标本可以明确区分结核杆菌与其它分枝杆菌和一般呼吸道微生物,能从含有大量人类核酸和其它分枝杆菌的标本中检测到结核杆菌,实验快速,整个实验在一天完成,灵敏度高特异性强。
结论: 分子生物学技术聚合酶链反应对结核病的临床诊断是一项敏感性高,特异性强,简便快速等特点的诊断技术,对结核病的诊断具有较高的临床意义。
关键词结核病;结核分枝杆菌;聚合酶链反应20世纪90年代,全球多数发达国家结核病疫情出现明显回升,许多发展中国家出现结核病疫情严重加剧,结核病已成为全球最紧迫的公共卫生问题,目前世界上没有任何一个国家能逃脱结核病的威胁。
每年全世界约有800万新发病人,约300万人因结核病而死亡。
我国的情况也是如此,据2000年第四次全国结核病流行病抽样调查表明,我国结核病的形势仍然十分严峻。
结核病流行病学显示高患病率、高耐药率、低递降率等特点[1]。
因此快速准确的诊断是控制结核病的主要条件,我们对使用分子生物学技术聚合酶链反应在结核病实验室的诊断做了一些分析研究。
1材料仪器与试剂:广州达安基因生物公司DA-7600荧光定量核酸扩增仪和结核分枝杆菌检测试剂盒。
2方法2.1标本采集和处理2.1.1标本的采集和液化用一次性痰液收集器采集,最好留取早晨第一口痰液。
痰液收集后应尽快送检。
在痰液标本中加入4倍体积的4%NaOH溶液,吹打均匀后室温放置30分钟使之液化。
2.1.2 1×TE溶液配制吸取1ml20×TE,溶于19ml去离子水中,混匀即可。
2.1.3标本及质控标准品的处理取0.5ml液化痰液至1.5ml离心管中,再加入0.5ml4%NaOH室温放置10分钟后15000rpm离心5分钟,吸弃上清,在沉淀中加无菌生理盐水1ml打匀,15000rpm离心分钟,吸弃上清:再重复洗涤一次。
核酸扩增技术在结核病诊断中的应用与进展
核酸扩增技术在结核病诊断中的应用与进展近10余年来现代分子生物学的迅猛进展，为临床实验室诊断提供了较为靠得住的核酸检测方式。
经典聚合酶链反映(PCR)扩增技术已普遍应用于结核病的诊断；但是，由于污染问题严峻，扩增抑制物的存在，试剂盒缺乏标准化、标准化，加上技术、条件、质控等方面因素阻碍，其灵敏性、特异性不同颇大，人们对其可信度、靠得住性产生了疑心，给临床医生诊断结核病带来了必然的困惑。
为此，国外学者开发出具有高度灵敏性、特异性、标准化、商品化的PCR 扩增试剂盒；继PCR以后，又进展了几种新的核酸体外扩增技术。
现就其在结核病诊断方面的应用与进展作一介绍，供广大同道借鉴。
一、PCR为基础扩增反映即Roche Amplicor结核分支杆菌PCR实验(Amplicor pCR)Amplicor PCR系应用生物素标记位于结核分支杆菌16S rRNA基因中高度保守区域种特异性引物扩增结核分支杆菌复合群DNA中584 bp序列；生物素标记的扩增子(amplicon)与种特异性DNA 探针进行杂交后，应用标准酶联免疫技术进行比色鉴定，结果判定以450 nm波长时吸光度(A450)＞为阳性标准［1～3］。
Amplicor pCR是由瑞士Roche公司开发研制的标准化、商品化试剂盒，该试剂盒有三个不同的小盒：标本处置盒、扩增盒和鉴定盒。
为避免交叉污染，厂商推荐试剂制备、标本处置、扩增与鉴定应三室分开，另外，应用尿嘧啶-N-糖基化酶操纵扩增子携带污染。
研究说明，Amplicor pCR可检出少至2～10个结核分支杆菌中DNA。
与培育法相较，Amplicor pCR检测临床标本中结核分支杆菌DNA的灵敏性为%～%，特异性达%～%，阳性估量值(PPV)66%～93%，阴性估量值(NPV)98%～%［2～4，6］。
假设参考临床综合诊断，其灵敏性、特异性、PPV、NPV 别离为%～%、%～100%、%～100%、%～%，该方式至少与培育法一样灵敏［1，4～6］。
2024年结核病诊断市场分析报告
2024年结核病诊断市场分析报告摘要本文旨在对结核病诊断市场进行分析。
通过对结核病的背景与现状进行梳理，分析市场规模、发展趋势以及主要竞争对手，为结核病诊断市场的投资者和业内人士提供全面的市场分析和发展建议。
1. 引言结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，全球范围内都存在一定的流行病学状况。
在过去的几年里，结核病的发病率有所上升，给社会和个人健康带来了巨大压力。
因此，结核病诊断市场的发展备受关注。
2. 市场规模与发展趋势分析2.1 市场规模结核病诊断市场是一个庞大而复杂的市场，涵盖了诊断试剂、设备、服务等多个细分领域。
根据市场调研数据显示，截至2020年，全球结核病诊断市场规模达到XX 亿美元，并预计将在未来几年持续增长。
2.2 发展趋势随着医疗技术的不断进步以及人们对结核病诊断的重视，结核病诊断市场呈现出以下几个发展趋势：•移动诊断设备的兴起：随着移动医疗的快速发展，移动诊断设备成为市场上的一大热点。
便携式结核病诊断设备使得结核病的早期诊断更加便捷和准确。
•分子诊断技术的应用：分子诊断技术（如PCR技术）的逐渐成熟，极大地提高了结核病的诊断准确性。
分子诊断技术的应用将成为未来结核病诊断市场的重要发展趋势。
•数据分析和人工智能的应用：据预测，随着人工智能的发展，结核病诊断市场将迎来新的突破。
数据分析和人工智能技术有望有效提高结核病的诊断效率和准确性。
3. 主要竞争对手分析结核病诊断市场存在着多个主要竞争对手，其中包括国内外诊断试剂和设备制造商。
以下是几个具有代表性的竞争对手：•公司 A：公司 A 是一家全球领先的结核病诊断试剂供应商，其产品在全球范围内具有广泛的市场份额和良好的口碑。
•公司 B：公司 B 在结核病诊断设备领域处于领先地位，其技术研发实力雄厚，产品具备高度的自主知识产权。
•公司 C：公司 C 是一家专注于移动结核病诊断设备研发与制造的创新型企业，其产品在便携性和准确性方面具备显著竞争优势。