结核病实验室诊断

基层镜实验室布局范例
可以开关的窗户
染色池 采 光 用 窗 户 （固定）
收集标本 用的桌子
显微镜
记录用 的桌子
工作台
试 剂 柜
实验室门
废弃标本和污染物的处理
废弃标本、痰盒和污染物均须经高压蒸汽灭菌后方能丢
弃或清洗；
如需焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚化不彻底
或暴露焚烧是危险的； 专业化处理 再用紫外线灭菌灯照射2小时
如何正确留痰
查痰对于结核病的诊断是非常重要的，通过痰检可以知道您是否痰中带菌。如 果痰中带有结核菌说明您患有肺结核，具有传染性，应该及时遵医嘱治疗。 送检痰标本的质量直接影响检验结果的准确性。请您一定按照下列要求和方 法留取合格的痰标本。每个痰盒应分别留取1～2口痰，请不要将1口痰分开放到2 或3个痰盒中。 正确的咳痰方法： 1、咳嗽前应缓慢地深吸气，吸气后稍屏气片刻。 2、躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸壁下部，内收并稍加力。 3、咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次深吸气，可连续咳嗽三声。 4、停止咳嗽后，收缩腹肌将剩余的气体尽量呼尽。 5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。 * 注意：部分人如果忽然深吸气容易诱发咳嗽，您可以尝试缓慢或分几次吸气， 争取肺泡内充分充气，以增加咳嗽的效率。在这一过程中，要注意动作的连贯性， 一气呵成。同时，也可以叩击前胸，或由家属协助叩击后背胸壁。这样震动支气 管内的分泌物，能够增加咳嗽排痰的力度。
痰标本性状 (三)
3、粘液痰：标本外观以白色、粘稠度 较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需 仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支 气管内膜纤毛柱状上皮细胞 ( 细胞较长且形 态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细 胞一端可见着色较浅的纤毛 ) ，伴有少量肺 上皮脱落细胞 ( 多数形态不规则、细胞核较 小且着色较细胞质深，核质比大于 1:3) 、 脓性炎症细胞 ( 卵圆形、细胞核占细胞比例 较大且着色较深，核质比低于 1:1) 、口腔 脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的 AFB 检 出率较唾液高。
核
酸
• RNA含量比DNA高4－5倍。 • RNA分布于细胞质内，DNA存在于细胞核 物质中。 • DNA是遗传物质，将遗传信息传给子代， 并指导RNA的合成。 • RNA是蛋白质和其他细胞成分合成必须的 物质。
结核分枝杆菌基因组
• 结核分枝杆菌DNA中约含4000个基因组。 • 结核分枝杆菌为2.5×109道尔顿, 卡 介苗株为2.8×109道尔顿 • 结核分枝杆菌H37Rv基因组全序列共含4.4×106碱 基对，平均鸟嘌呤+胞嘧啶含量（G＋C）为65.6％。
结核病细菌学诊断
结核病细菌实验室布局原则
• 1、结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得 与其他实验室混用，最好为P3级实验室； • 2、培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片 镜检、培养前处理、药敏试验等污染操作要有独 立分开的场所，最好分别在专用的房间进行； • 3、基层只从事涂片镜检的实验室只拥有一间独 立房舍的情况下，相对洁净区（镜检区、登记区） 与污染区（涂片、染色区）要有明显区分。
结核菌是兼性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无运动能 力；
形状：0.3 - 0.6×1 - 4微米的细长杆状，直或 稍弯，镜下常堆积成团、成束、排列杂乱无章， 也有呈串珠样、链状、索状者。 革兰氏染色阳性，萋-尼氏染色镜下的抗酸杆菌 为淡兰色背景下的红色或粉红色细长杆菌。荧光 染色镜下的抗酸杆菌在暗色背景下呈黄绿色或橙 色荧光。
痰标本采集 (五)
注意：由于当患 者咳嗽、咳痰时，易 产生含有结核菌的气 溶胶，感染周边人群 的机率较高，故采集 痰标本时应在远离人 群的开放空间进行， 或在通风良好的室内 进行。
痰标本性状 (一)
1、干酪痰：标本外观以黄色 ( 或奶酪色 ) 、脓样、团块状的 肺部分泌物为主，粘度较粘液 痰低，制片时较易涂抹；涂片 染色后镜检，可发现大量脓性 炎症细胞、肺上皮脱落细胞。 由于此类标本是由肺部深处咳 出，对肺结核的诊断最有价值， 故AFB的检出率较高。
概 述
分枝杆菌呈分支状生长，
营养要求比
普通细菌高，是一种生长缓慢的革兰氏
阳性杆菌。
经石炭酸复红染液着色后，不被盐酸酒
精脱色，故称此类细菌为抗酸菌。
分枝杆菌分类
类别 缓 慢 生 长 Rubyun 分群 结核分枝杆菌复合群 非结核分枝杆菌 I 群 非结核分枝杆菌 II 群 对人致病的分枝杆菌 人型、牛型、非洲型 堪萨斯、海、猿 瘰疬
非结核分枝杆菌 III 群 鸟-胞内、蟾
快速生长 非结核分枝杆菌 IV 群 偶发、龟
结核分枝杆菌结构
结核分枝杆菌组成：
细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质
细胞壁
厚度为10~35nm，较一般细菌的细胞壁厚。 含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。 功能：
• •
保护细菌的固有形态 抵抗酸碱物质及宿主细胞对细菌的破坏和 杀伤
•
•
痰标本采集 (四)
患者留取的痰标本，应由检验人员或经过培 训的专人目视检查标本性状质量 ( 特别是用于初 次诊断的痰标本)：标本量一般在3～5 ml，标本 性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的 血痰、粘液痰者为合格的标本；唾液为不合格标 本。 确定诊断检查时痰标本不合格者，医务 人员应予以进一步指导并要求其重新送检。 进行AFB 涂片检查时应在登记本和检验报 告单上注明标本性状，以供分析结果时参考。
结核病的诊断
诊断发展阶段：经验性、X线影像，細 菌学诊断、免疫学（细胞、体液）诊断、分 子生物学诊断。 控制结核病的流行，诊断是所有 措施中最为关键的一步。
实验室检查
• 结核病实验室检查包括细菌学检查以及近年来 在分子生物学和免疫学等领域建立的检测新技 术。 • 细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。 • 检测新技术为可疑结核病患者的早期诊断与合 理治疗带来新的希望。
试验操作工作面应以3%石炭酸或其他可靠的消毒液擦拭，
主要方法
1、痰涂片抗酸染色、镜检技术 2、分枝杆菌分离培养技术 3、分枝杆菌快速培养技术 4、药物敏感性实验技术 5、分枝杆菌菌种鉴定技术
痰标本采集 (一)
容器：采用 WHO 推荐的国际通用 螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、 蜡纸盒收集痰标本（参考规格： 直径4 cm，高度2 cm）。容器上 应清晰标注患者姓名、病例号、 检查项目。
结核病细菌学检查的重要作用
是结核病临床诊断和治疗的重要依据 是直接发现病原菌的诊断方法，比影象学、免疫 学等检查具有更高的特异性 是确定、调整化疗方案的重要依据 是国家结核病控制规划（NTP）的重要组成部分
是发现传染源的最主要途径和手段
是考核疗效、评价防治效果的可靠指标
分 枝 杆 菌 生 物 学 基 础
抗 酸 性
抗酸性是分枝杆菌的重要特征。其化学 基础是分枝菌属的细胞壁脂质含量较高， 并含有大量分枝菌酸。
抗酸性与细菌细胞壁的完整性关系密切， 若菌体自溶（如标本保存时间过长、温度 过高）、结核菌的异型相（如：L-型菌、 干酪或脓液中的结核菌）可能失去抗酸性。
生 长 特 性
生长适宜温度37C，PH6.8-7.2。营养要求较高。 在常用的罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上 生长的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折， 呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，不透 明。 结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需 要10多小时，根据接种菌量的多少，一般10-30 天肉眼可见菌落生长。
脂 类（1）
• 结核菌体脂类含量比其他细菌高，占细胞壁干重 的60％，是引起结核病特征性变化与表现的物质 基础。 • 脂质含量与细菌毒力相பைடு நூலகம்，毒力强的Mtb含脂最 高。
• 脂质只要有磷脂、脂肪酸、蜡质等成分，多与蛋 白质、多糖以结合形式存在。
脂 类（2）
• 磷脂：刺激机体单核细胞增生，增强菌体成分 诱导机体致敏作用。 • 索状因子：与Mtb毒力密切相关。 • 硫脂 • 蜡质：占脂质总量48％，分A、B、C、D。 • 结核菌酸：促进机体形成结核结节。 • 分支菌酸：为结核菌菌体的重要成分，与结核 菌的抗酸性有关。
结核病实验室涂片镜检技术
王 甦 民 北京结核病控制研究所 2010年12月
结核病基本情况：
（1）
结核病是一个古老的疾病，至今仍然严重 威胁着人类健康。
近十几年来，由于结核菌的耐药性、
HIV/TB双重感染
移民（流动人口）问
题 使全球结核病控制工作面临严重挑战。
全球结核病告急
据世界卫生组织估计目前全球约有：
盐 类
• 钙、钾、镁、铁、磷等，约占菌体成 分的 6％。
营养与发育
• 结核菌是需氧菌，但在含有比较低氧的环 境下也能生存，比如骨结核，淋巴结核。
• 在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。
• 结核菌生长的适宜温度和人体相近为370C
• 结核菌生长所必需的元素有氧、碳、氮、 氢、磷、钾、镁等。
结核分枝杆菌形态
痰标本性状 (二)
2 、血痰：此类标本是因粘液痰 或干酪痰标本中混有血液而形 成，颜色为褐色或深褐色、鲜 红色或伴有血丝；涂片染色后 镜检除能够观察到粘液痰或干 酪痰的细胞特征外，含新鲜血 液的标本中可见到被染色的血 细胞。由于含血标本易干扰 AFB 镜检的结果 ，故在制片时 应尽量避免挑取含血标本。
概 述
结核分枝杆菌是1882年郭霍（Robert Koch） 从肺结核病人痰标本中发现。是人类结核 病的主要病原菌。
分类
• 结核分枝杆菌属原核生物界、厚壁菌 门、裂植菌纲、放线菌目、分枝杆菌 科的分枝杆菌属，分枝杆菌属种类甚 多，目前已命名的有200多种，一般可 分为缓慢生长和快速生长两大类。
痰标本采集 (二)
合格的痰标本：应是患者深呼吸后，由肺部深 处咳出的分泌物。包括干酪痰、粘液痰和血痰。 按采集的时间，可将标本分为三类 即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液； 晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第 2口、第3口痰液； 夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液；
痰标本采集 (三)
对疑似肺结核病者，临床医护人员 应通过解释，使其充分了解标本性状、 质量对相应检查项目的重要性，示范并 指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；如 患者识字，可提供宣教材料。
多 糖
• 由阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖、 甘露聚糖和葡聚糖等组成。 • 多以脂类、蛋白质和核酸等结合形式 存在。 • 是免疫反应的重要抗原物质。
蛋白质
• Mtb含多种蛋白质组分，由不同菌体蛋白及 活菌在分泌过程中分泌于细胞外的多种蛋 白组成。 • 结核菌的主要抗原性物质。
• 结核菌素、PPD为多种蛋白的复合抗原， 可刺激机体免疫应答。
如果细胞壁有缺陷，细菌只能在高渗环境下
生存，则称此类细菌为L型细菌。
细 胞 膜
细胞壁内层围绕于细胞质外的富于弹性的
半透膜。 主要成分是脂类（磷脂）和蛋白质。 功能：
– 细菌与外界环境进行物质交换 – 在细胞内一系列代谢活动中起重要作用
菌 体 成 分
• • • • • 脂类 多糖 蛋白质 核酸 盐类
2000年全国结核病流行病学抽样调 查初步结果显示：
– 全国受结核菌感染人口超过5.6亿； – 全国现有传染性肺结核病人200万，传染性肺结核患病率为 157.8/10万。 – 结核病死亡率为9.8/10万，在各种死亡原因中占第11位。 – 结核菌耐药率：27.8%，初始耐药率18.6%，获得性耐药率： 46.5%。INH:17.6%，SM：17.3%，RFP：16.6%，EMB：1.5%， MDR：10.7%。 – 非结核分枝杆菌感染：11%
1/3人口（20亿）感染结核菌； 2000万结核病人；
每年有800万-1000万新发病例；
每年300万人死于结核病；
我国结核病现状
我国的结核病疫情依然十分严重，是世界上 结核病患病率最高的22个国家之一。
是耐药结核病最多的全球27个国家之一。
每年新登记的结核病患者约130万。
我国结核病现状
我国结核病现状
—我国历次流调疫情
肺结核 病人数 涂（+） 病人数 1 800 000 1 620 000 1 510 000 1 500 000
时间 1979
肺结核 患病率
涂（+） 患病率
717/10 万 187/10 万 6 900 000
1984/85 550/10 万 156/10 万 5 700 000 1990 2000 523/10 万 134/10 万 5 930 000 367/10 万 122/10 万 5 000 000