实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定

注：单位均为mL
生物化学与分子生物学实验
向每个试管中各加 0.5%酪蛋白溶液20滴， 加一管，立即混匀一管 静置30分钟后，以0、+、++、+++、++++ 表示各管的混浊度，并指出哪一种pH是酪蛋 白的等电点
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实验结果
酪蛋白等电点的测定
1 2 3 4 5 6 7
1
沉淀量
2 +
3 +++
4 ++++
5 ++
6 0
7 0
0
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结论 2：
4号试管沉淀量最多
说明4号管溶液的pH值为酪蛋
白的等电点，即pI=4.7
生物化学与分子生物学实验
思考题
什么是蛋白质的等电点？ 在等电点时，蛋白质溶液为什 么容易发生沉淀？
生物化学与分子生物学实验
生物化学与分子生物学实验
实验器材与试剂
大试管、滴管、刻度吸量管
0.5％酪蛋白醋酸钠溶液 0.01％溴甲酚绿指示剂(指示范围: pH3.8-5.4)
0.02M HCL溶液、 0.02M NaOH溶液
0.01M醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、 1.00M醋酸溶液
生物化学与分子生物学实验
pH>pI
阳离子
兼性离子
阴离子
生物化学与分子生物学实验
维持蛋白质胶体稳定的因素： 表面电荷、水化膜
在等电点时蛋白质颗粒上的净电
荷为零，缺乏同电相斥的因素，蛋
白质溶解度最小，最容易析出沉淀
生物化学与分子生物学实验
本实验配制了各种不同 pH 值的
缓冲液，沉淀出现最多的缓冲液 pH值即为酪蛋白的等电点
生物化学与分子生物学实验
蛋白质的两性反应(2)
[H+] ，沉淀 出现最大量沉淀时,说 明到达了酪蛋白的等电点 溶液由蓝色变成浅绿色 （3.8﹤pH﹤5.4）
生物化学与分子生物学实验
继续加酸，[H+]继续增 大，pH＜pI。酪蛋白所带
正电荷不断增加，同电相
斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解时，溶 液显黄色(pH﹤3.8)
生物化学与分子生物学实验
实
验
二
蛋白质的两性反应与 等电点测定
生物化学与分子生物学实验
实验目的
了解蛋白质的两性解离性质 掌握测定蛋白质等电点的方法
生物化学与分子生物学实验
实验原理
P COOH NH2
+OH+H+
P
COOH NH3+
pH<pI
+OH+H+
P
COONH3+ pH=pI
P
COONH2

实验项目 实验原理 试剂和器材 操作方法（主要步骤） 结果分析 思考题
生物化学与分子生物学实验
预 习
实验三
凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高
铁氰化钾
生物化学与分子生物学实验
蛋白质的两性反应(3)
[OH-] ，沉淀 出现最大量沉淀时,说 明到达了酪蛋白的等电点 溶液由黄色变成浅绿色 （3.8﹤pH﹤5.4）
生物化学与分子生物学实验
继续加碱，[OH-]继续 增大，pH﹥pI。酪蛋白所
带负电荷不断增加，同电
相斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解时，溶 液显蓝色(pH﹥5.4)
蛋白质的两性反应（3）
继续滴加0.02M NaOH溶液
边滴加边混匀
有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化 继续滴加0.02M NaOH溶液
边滴加边混匀
至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象
生物化学与分子生物学实验
实验结果
蛋白质的两性反应(1)
溶液呈蓝色 酪蛋白溶液呈碱性 (pH﹥5.4)，使溴甲酚 绿指示剂显蓝色
实验步骤
蛋白质的两性反应（1）
取一干净试管
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
酪蛋白液10滴
溴甲酚绿指示剂3滴
观察溶液颜色 并解释现象
生物化学与分子生物学实验
蛋白质的两性反应（2）
滴加0.02M HCL溶液
边滴加边混匀
有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化 继续滴加0.02M HCL溶液
边滴加边混匀
至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象
生物化学与分子生物学实验
生物化学与分子生物学实验
结论 1：
蛋白质是两性电解质 pH= pI时，蛋白质溶解度最小
酪蛋白的等电点在pH3.8-5.4之间
生物化学与分子生物学实验
酪蛋白等电点的测定
取7支同样规格的干燥试管，精确加入各试剂
试管号码 蒸馏水 1.00M醋酸 0.1M醋酸 0.01M醋酸 pH 1 2 3 4 5 6 7 2.4 3.2 — 3.0 1.5 2.75 3.38 — — 1.6 0.8 — — — — — 4.0 1.0 — — — — — — — 2.5 1.25 0.62 3.5 3.8 4.1 4.7 5.3 5.6 5.9